兔肌腱细胞的分离、培养及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.51.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：肌腱细胞是一种高分化的细胞，其增殖相对缓慢，在体外经多次传代后甚至丧失增殖能力，因此有必要建立肌腱细胞良好的体外分离、培养模式。

目的：探讨兔肌腱细胞的分离、培养及鉴定。

方法：无菌条件下切取新西兰乳兔趾屈肌腱，显微镜下剥离腱外膜，采用Henderson分步酶消化法分离肌腱细胞，用含体积分数为20%胎牛血清的F-12培养液进行培养、传代。

结果与结论：通过不同的酶消化分离可获得较纯肌腱细胞，体外培养细胞表现出良好的细胞增殖能力和传代能力。免疫组织化学染色见分离培养的第2代腱细胞Ⅰ型胶原抗体染色呈阳性，而Ⅲ型胶原抗体染色呈阴性，证明所获细胞为肌腱细胞。提示肌腱细胞能够在体外分离、扩增和传代。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 腱细胞, 兔, 分离, 培养, 鉴定

Abstract:

BACKGROUND: Tendon cells are characterized by high differentiation potentials, slow proliferation rate, and even lost proliferation capacity after passage in vitro. Therefore it is necessary to establish the ideal isolation and culture patterns of tendon cells in vitro.

OBJECTIVE: To investigate the isolation, culture and identification of tendon cells.

METHODS: The flexor tendon of New Zealand fetal rabbits were cut under sterile conditions, the peritenon of flexor tendon was removed by microsurgical technique. Tendon cells were isolated with Henderson-step enzymatic digestion method and cultured in a complete medium consisting of DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum for primary culture and passage.

RESULTS AND CONCLUSION: The tendon cells with high purity can be successfully isolated by different enzymatic digestion methods, and the cultured cells well proliferated and passaged in vitro. The immunohistochemical staining showed that, passage 2 cells were positive for collagen type I antibody, but negative for collagen type III antibody. These evidences confirmed that the cultured cells are tendon cells. Tendon cells can be isolated, proliferated and passaged in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: cell, cultured, immunohistochemistry, rabbits, tendon

中图分类号:

R318

王玉聪，张前法. 兔肌腱细胞的分离、培养及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(51): 8297-8300.

Wang Yu-cong, Zhang Qian-fa. Isolation, culture and identification of rabbit tendon cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(51): 8297-8300.

图/表（结果） 4

参考文献

引言

材料方法

设计：体外细胞学实验。

材料：

实验动物：肌腱取自健康新西兰乳兔，雌雄不拘，体质量1.0-1.5 kg，由宁波大学试验动物中心提供，双后肢无感染、瘢痕和皮肤撕裂等。

方法：

肌腱细胞的分离培养：严格无菌条件下切取兔双后肢趾屈肌腱1.5 cm，立即放入三抗液中，在手术显微镜下剥离腱外膜组织后，用Hank’s液洗涤3次。将整段肌腱用含0.25%胰蛋白酶及0.1%胶原酶的混合酶液在37 ℃水溶箱中消化30 min。中止消化后用Hank’s液冲洗，将整段肌腱剪成1.0-2.0 mm³的碎块，用上述浓度的胰蛋白酶与胶原酶液在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中消化1.0-2.0 h。消化过程中每隔30 min取出消化瓶晃动数次，以帮助消化及组织块分散，同时在倒置显微镜下观察，当组织块大部疏松，有较多的细胞逸出时，加含体积分数为20%胎牛血清的F-12培养液中止消化。过滤除去组织碎块，滤液经 1 000 r/min离心10 min后弃上清液，下层液用含体积分数20%胎牛血清的F-12培养液洗脱1次。并制成细胞悬液，细胞计数按5×10⁵个，接种于25 mL培养瓶中培养。

肌腱细胞传代培养：在原代培养的肌腱细胞生长旺盛、融合成单层细胞后，进行传代培养。首先吸出培养液，PBS洗涤3次，去除失活未贴壁细胞，加入0.25%胰蛋白酶约 2 mL，轻轻摇晃培养瓶，并在倒置显微镜下观察，待细胞回缩、细胞间隙增大后立即倒出酶溶液，加入含体积分数为20%胎牛血清的F-12培养液5 mL中止消化，轻轻吹打培养液，观察细胞均游离、分布均匀后，计数并按1∶2分装于2个25 mL无菌培养瓶中进行传代培养。

肌腱细胞的形态学观察：分别取原代、传代培养所得细胞在倒置显微镜下观察其生长情况及细胞形态学变化，照相并保存。

免疫细胞化学染色测定细胞合成胶原类型：选用第2代传代培养所得的肌腱细胞，待细胞长满25 mL培养瓶时，0.25%胰蛋白酶消化后，按3×10⁷ L^-1细胞浓度接种于24孔培养板的3孔内，每孔置入一清洁载玻片,待肌腱细胞继续培养两三天，长满培养板80%左右，取出载玻片，①Hank’s液冲洗2次，晾干后丙酮脱水，PBS洗2次后甲醇固定， 37 ℃暖箱内放置30 min，PBS洗2次。②山羊血清覆盖玻片封闭，暖箱内放置10 min后分别滴加鼠抗兔胶原Ⅰ、Ⅲ抗体染色，37 ℃暖箱1 h，PBS洗2次，5 min/次。③滴加 2抗，37 ℃暖箱30 min，PBS洗2次，5 min/次。④按DAB显色试剂盒操作说明进行DAB染色，光镜下观察，照相并保存。Ⅰ型胶原抗体染色阳性、Ⅲ胶原抗体染色阴性者为肌腱细胞。

主要观察指标：倒置显微镜观察细胞形态变化及生长情况；取第2代所得肌腱细胞行免疫细胞化学染色，测定细胞合成胶原类型。

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讨论

Dehm等^[2]在1971年首次体外培养腱细胞并研究了细胞的胶原合成及分泌，使得肌腱细胞的研究被不断深入。Henderson等^[3]应用免疫组织化学及同位素标记方法对体外培养获得的鸡胚腱细胞和腱外膜成纤维细胞进行胶原合成类型的测定发现：肌腱细胞仅合成Ⅰ型胶原，而成纤维细胞同时合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维，为后期体外培养肌腱细胞定性研究奠定了实验基础。本实验根据此理论基础应用免疫细胞化学染色、DAB显色方法进行测定，结果显示：腱细胞Ⅰ型胶原抗体染色呈阳性，而Ⅲ胶原抗体染色呈阴性，证实了体外培养所得细胞为现已知多种生长肌腱细胞。

实验同时采用显微外科技术剥离肌腱外膜组织，结合胰蛋白酶和胶原酶分步消化，可获取较为纯净的腱细胞，提高了腱细胞研究的可靠性。

目前研究证实肌腱细胞在体外多次传代培养后其增殖能力明显降低。张兆峰等^[4]通过对体外培养鸡肌腱细胞的功能老化规律测定发现：腱细胞传至第5代后，细胞增殖能力显著降低，胶原分泌明显减少，同时细胞的形态学和生长方式也出现明显改变，初始原代培养时呈梭形，平行排列，经多次传代培养后表现为形态不规则，胞核浓染，胞浆皱缩，细胞排列紊乱，认为可能与细胞逐渐发生凋亡，细胞骨架蛋白降解有关。张前法等^[5]对比体外培养肌腱细胞原代和传代细胞的形态学变化发现原代肌腱细胞贴壁时间为48 h，延展时间为60 h；传代的肌腱细胞贴壁时间为8 h，延展时间为18 h。然而，因子对肌腱细胞增殖具有明显的促进作用，其中主要包括：碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白12、胰岛素样生长因子1、血管内皮生长因子、转化生长因子β、血小板源性生长因子等^[6]。杨志明等^[7]利用最新构建的带有潮霉素B标记的SV40温度依赖ptsA 58H质粒，采用电穿孔法将其导入肌腱细胞，并经潮霉素筛选，获得阳性克隆，扩增后建立转化人胚肌腱细胞系，成功传代培养65代转化人胚肌腱细胞，对细胞进行形态学、超微结构特征的观察，未见肿瘤细胞的恶性转化迹象，具有正常肌腱细胞分泌Ⅰ型胶原的能力，为肌腱组织工程提供了可用标准细胞系。

在体外培养肌腱细胞过程中，细胞接种密度及培养条件对肌腱细胞的增殖有较大影响。Schwarz等^[8]体外培养鸟类原代肌腱细胞时发现，在低密度接种时肌腱细胞不易贴壁融合，原因在于过低的细胞密度使细胞之间的信号传导受到抑制而影响细胞的增殖分裂。然而，正常细胞的体外培养同时存在着一定的密度生长极限，倘若细胞接种过密培养，在细胞贴壁伸展后很快融合，同样会形成接触抑制、代谢产物聚集而阻滞细胞增殖。本实验选用细胞计数5×10⁵个，使细胞培养过程中获得了良好的增殖趋势。另外在行传代培养换液时，应保留原液的一半，避免细胞生长环境的改变影响细胞增殖。

有效的肌腱细胞体外分离、培养模式对于进一步开展组织工程化肌腱的研究具有重要意义，解决了种子细胞来源的问题。课题组拟进一步研究应用不同浓度、不同种类的外源性生长因子对肌腱细胞增殖的影响，为组织工程化肌腱种子细胞的获取提供可靠而稳定的来源。

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