体外大鼠肝卵圆细胞的长期培养方法

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.013

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (29): 4663-4668.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.013

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

体外大鼠肝卵圆细胞的长期培养方法

尹寿新¹，周震²，马美雪³，杨景波¹，羊东晔¹

¹中南大学湘雅二医院消化内科，湖南省长沙市 410011；²长沙市第一医院消化内科，湖南省长沙市 410005；³徐州市中心医院消化内科，江苏省徐州市 221009

修回日期:2014-05-27 出版日期:2014-07-09 发布日期:2014-07-09
通讯作者: 羊东晔，博士后，副主任医师，中南大学湘雅二医院消化内科，湖南省长沙市 410011
作者简介:尹寿新，男，1989年生，山东省济南市人，汉族，2014年中南大学湘雅医学院毕业，硕士，医师，主要从事肝癌和肝再生的研究。并列第一作者：周震，男，1985年生，湖南省邵阳市人，汉族，2013年中南大学湘雅医学院毕业，硕士，医师，主要从事肝癌和肝再生的研究。
基金资助:
2010年国家自然科学基金(81072037)

Long-term culture of hepatic oval cells in rats in vitro

Yin Shou-xin¹, Zhou Zhen², Ma Mei-xue³, Yang Jing-bo¹, Yang Dong-ye¹

¹Department of Gastroenterology & Hepatology, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China; ²Department of Gastroenterology & Hepatology, the First Changsha Hospital, Changsha 410005, Hunan Province, China; ³Department of Gastroenterology & Hepatology, Xuzhou Central Hospital, Xuzhou 221009, Jiangsu Province, China

Revised:2014-05-27 Online:2014-07-09 Published:2014-07-09
Contact: Yang Dong-ye, Associate chief physician, Department of Gastroenterology & Hepatology, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China
About author:Yin Shou-xin, Master, Physician, Department of Gastroenterology & Hepatology, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China Zhou Zhen, Master, Physician, Department of Gastroenterology & Hepatology, the First Changsha Hospital, Changsha 410005, Hunan Province, China Yin Shou-xin and Zhou Zhen contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81072037

摘要/Abstract

摘要：

背景：肝卵圆细胞是目前公认的成体肝干/祖细胞，但其体外长期培养时会不可避免地丢失干细胞的活性。

目的：探索大鼠肝卵圆细胞体外长期培养的方法。

方法：构建2-乙酰胺基芴/部分肝切除肝再生大鼠模型，通过酶消化和Percoll梯度离心分离纯化大鼠异质卵圆细胞并进行免疫染色鉴定，用含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养基体外长期培养，后撤去表皮生长因子、白血病抑制因子，通过形态学的观察和分子标志物的检测判断其能否保持干/祖细胞活性。

结果与结论：采用含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养基体外培养卵圆细胞4个月后，大鼠异质卵圆细胞仍能表达肝细胞标志物ALB、胆管上皮细胞标志物CK-19，经不含表皮生长因子、白血病抑制因子的培养液继续培养后，卵圆细胞胎肝标志AFP表达量迅速下降。该研究结果表明大鼠肝卵圆细胞在表皮生长因子、白血病抑制因子等培养条件下可长期增殖并保持干细胞活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 卵圆细胞, 长期培养, 表皮生长因子, 白血病抑制因子, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Hepatic oval cells are recognized as stem/progenitor cells currently, however, long-term culture of hepatic oval cells can inevitably result in the loss of cell activity.

OBJECTIVE: To explore a long-term culture method of hepatic oval cells in vitro.

METHODS: Partially hepatectomized rat model was established by using 2AAF/PH. The regenerated liver was digested by collagenase, and hepatic oval cells were isolated and purified by density gradient centrifugation and identified by immunocytochemistry. Hepatic oval cells were cultured in a medium containing epidermal growth factor and leukaemia inhibitory factor. Then epidermal growth factor and leukaemia inhibitory factor were removed after several months, and its ability of maintaining stem/progenitor cell activities was determined based on morphology and molecular markers.

RESULTS AND CONCLUSION: Both hepatocyte marker ALB and biliary epithelial cell marker CK-19 were found after hepatic oval cells were cultured in a medium containing epidermal growth factor and leukaemia inhibitory factor for 4 months. While in the absence of epidermal growth factor and leukaemia inhibitory factor, the

expression of fetal liver marker AFP was decreased quickly. These results indicated that hepatic oval cells could expand in a medium containing epidermal growth factor and leukaemia inhibitory factor and maintain stem/progenitor cell activities for a long time.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: hepatocytes, epidermal growth factor, leukemia inhibitory factor, cells, cultured

中图分类号:

R318

尹寿新，周震，马美雪，杨景波，羊东晔. 体外大鼠肝卵圆细胞的长期培养方法[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(29): 4663-4668.

Yin Shou-xin, Zhou Zhen, Ma Mei-xue, Yang Jing-bo, Yang Dong-ye. Long-term culture of hepatic oval cells in rats in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(29): 4663-4668.

图/表（结果） 2

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引言

肝癌是位居世界第5位的恶性肿瘤，全球每年有 600 000例新发肝癌患者，其中亚洲国家约占78%^[1]。关于肝癌细胞的来源存在两种观点：一种是成熟肝细胞的去分化，另一种是肝内干/祖细胞的成熟受阻异常分化^[2]。后一种观点得到更广泛的认可。干/祖细胞一般具有下列几种特征：①自我更新或维持的能力(通常缓慢进行细胞周期循环)。②多能性。③长期进行组织重建。④连续移植的能力^[3]。而卵圆细胞(heapatic oval cells，HOCs)不同程度地具有这些特征，并表达多种肝干/祖细胞的分子标志，是目前公认的成体肝干/祖细胞^[3-7]。一般认为，正常情况下，卵圆细胞(肝干/祖细胞)位于小叶间胆管及Hering管的胆管上皮细胞处，保持休眠状态；当损伤特别严重或成熟肝细胞增殖受到抑制时肝卵圆细胞(肝干/祖细胞)才会增殖^[3]，并不断分化成成熟肝细胞与胆管细胞，进而修复损伤肝。这为肝干细胞移植和肝再生提供了理论支持。同时，肝卵圆细胞作为目前公认的肝干/祖细胞与肝癌(干)细胞有着极为密切的联系：①肝干细胞与肝癌(干)细胞都有相似的无限增殖和分化能力。②肝干细胞与肝癌(干)细胞都可以分化和产生不同的亚系。③肝干细胞与肝癌(干)细胞都表达某些相关蛋白和表面标志物。④肝干细胞与肝癌(干)细胞增殖过程中有一些相同的细胞因子和信号转导通路参与。⑤肿瘤干细胞学说为干细胞向癌细胞转化提供了很好的理论支持^[8]。故推断某些卵圆细胞亚群很可能是肝癌(干)细胞的前体细胞^[9]，而阻断肝卵圆细胞的恶性转变有可能为肝癌治疗提供新的方式。因此肝卵圆细胞恶性转变的研究一直令人关注。由于卵圆细胞在肝再生和肝癌研究中的重要性，建立一套肝卵圆细胞增殖、分离纯化、体外长期培养的方法十分必要。目前，2-乙酰胺基芴联合大部分肝切除术、两步酶消化联合Percoll密度梯度离心作为卵圆细胞增殖、分离纯化的方法已相对较成熟并被广泛使用^{[4,6, 10-14]}。但干/祖细胞的体外长期培养一直是一个棘手的问题，因其不可避免地会丢失干细胞的活性。虽然有许多研究者针对肝卵圆细胞的体外培养进行了有意义的探索^{[4, 10,15-18]}，但迄今为止尚未形成共识。基于此，本研究以期获得一个使大鼠肝卵圆细胞体外长期增殖并保持干细胞活性的经济、简便的方法，进而为肝干细胞移植/肝再生和肝卵圆细胞恶性转变等研究打下基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2011年3月至2012年2月在湘雅二医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：清洁级雌性SD大鼠，体质量150-180 g，由中南大学湘雅二医院动物实验室提供，于每日12 h光照和12 h黑暗的饲养室中，清洁饮食、饮水。

方法：

卵圆细胞的提取和纯化：采用已经比较成熟的2-乙酰胺基芴+2/3肝切除(2-AAF/PH)的造模方法建立肝卵圆细胞增殖模型，术后继续灌胃2-乙酰胺基芴至术后9-11 d提取肝卵圆细胞。

采用目前最常用的酶消化结合Percoll密度梯度离心法分离纯化肝卵圆细胞，并做适当调整。主要步骤为：取术后第9-11天大鼠，超净台内打开腹腔，充分暴露肝门静脉及肝脏；用4 ℃预冷无钙镁平衡盐缓冲液(PBS)原位缓慢灌注直到肝脏变为灰褐色并失去弹性，完整取下肝脏，用含抗生素PBS浸泡冲洗；倾倒液体，加入37 ℃预热的含0.50 g/L(0.05%)Collagenase Ⅰ及3 mmol/L CaCl₂的平衡盐缓冲液，同时将肝脏剪成0.1 cm×0.1 cm大小的组织块，37 ℃摇床中孵育40 min；细胞悬液通过70目尼龙网后，经4 ℃、50×g离心1 min，重复一两次；吸取上层清液(含非实质细胞)，再以4 ℃、400×g离心 10 min后弃上清；沉淀细胞用37 ℃预热的含1 g/L(0.1%) CollagenaseⅠ、1 g/L(0.1%) Pronase E、0.1 g/L(0.01%)DnaseⅠ的DMEM培养液悬浮并37 ℃摇床中孵育30 min；孵育后细胞悬液经4 ℃、400×g离心10 min；弃上清，沉淀细胞用5 mL含体积分数为1%胎牛血清的PBS培养液悬浮。用0.15 mol/L NaCl溶液将100% Percoll按体积分数配成90%、70%及50% 3种浓度梯度；从离心管底部开始按90%、70%、50%逐层铺加，将5 mL富含肝卵圆细胞的悬液沿管壁置最上层；经4 ℃、 12 000 r/min离心30 min，可见位于50%与70% Percoll之间的卵圆细胞层，小心吸取；细胞经无菌PBS冲洗后离心沉淀并用培养基悬浮。

肝卵圆细胞的长期培养：将获得的肝卵圆细胞用含体积分数为10%胎牛血清、20 μg/L表皮细胞生长因子、10 μg/L白血病抑制因子、2 mmol/L L-谷氨酰胺和 100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM/F12(1∶1)培养液培养于体积分数为5% CO₂、37 ℃培养箱中，每隔3 d用上述培养液换液。换液、传代、计数、冻存、复苏等方法同普通贴壁生长细胞系。将体外培养1个月后冻存、冻存1个月后复苏继续培养2个月的卵圆细胞，一部分行免疫荧光检测ALB、CK-19的表达判断其是否仍保持干细胞活性，一部分提取蛋白进行Western blot，其余卵圆细胞撤去表皮细胞生长因子、白血病抑制因子继续培养，观察细胞形态等有无变化。

免疫细胞染色鉴定：通过分子标志物OV-6、CK-19、GPC3、Thy-1等免疫细胞染色鉴定卵圆细胞。将细胞接种于24孔板内培养至贴壁，PBS浸洗；40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS浸洗；0.2% Triton X-100细胞通透20 min，PBS浸洗；5%牛血清白蛋白室温孵育30 min；吸去血清，滴加一抗(阴性对照组用PBS代替一抗)，4 ℃过夜，PBS浸洗；滴加辣根过氧化物酶标羊抗小鼠/兔IgG二抗，室温下孵育1 h，PBS浸洗；滴加新鲜配置的DAB显色剂，显微镜下控制显色时间(3-10 min)，终止显色反应；苏木素复染10 s，自来水冲洗。

免疫荧光检测：将体外培养1个月后冻存、冻存1个月后复苏继续培养2个月的卵圆细胞行免疫荧光检测ALB、CK-19的表达判断其是否仍保持干细胞活性。将细胞接种于24孔板内培养至贴壁，PBS浸洗；40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS浸洗；0.2% Triton X-100细胞通透20 min，PBS浸洗；5%牛血清白蛋白室温孵育30 min；吸去血清，滴加一抗(阴性对照组用PBS代替一抗)，4 ℃过夜，PBS浸洗；滴加山羊抗小鼠FITC、山羊抗兔Cy3荧光二抗，此后注意避光，室温下孵育1 h，PBS浸洗，Hoechst染核 1 min，PBS浸洗，荧光显微镜下观察。

Western blot检测：取撤去表皮细胞生长因子、白血病抑制因子前和撤去10 d后的卵圆细胞，提取蛋白，Western blot检测ALB、CK-19、Thy-1、AFP的表达量判断卵圆细胞分化程度有无改变。具体步骤为：倾去培养基，TBS清洗，彻底吸去残留液体；每6孔板加100 μL新配裂解液(含蛋白酶抑制剂)充分裂解；收集至EP管中超声波均浆1 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min；取上清变性、电泳、转膜；封闭(含5%脱脂奶粉的TBST溶液)1 h；加封闭液配制的一抗，4 ℃温和振荡过夜，洗膜；加封闭液配制的二抗室温温和振荡孵育1 h，洗膜；ECL显影；使用化学发光仪采集图片；使用Quantity One软件分析条带的灰度值。

主要观察指标：①大鼠卵圆细胞的形态和免疫细胞染色鉴定。②免疫荧光检测卵圆细胞ALB、CK-19的表达。③表皮细胞生长因子、白血病抑制因子撤去前后Western blot检测ALB、CK-19、Thy-1、AFP的表达量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

成体肝损伤后的修复源于两种细胞的增生：一种是处于静息状态的成熟肝细胞，另一种是肝内或肝外的干/祖细胞。一般认为，当损伤特别严重或成熟肝细胞增殖受到抑制时肝干/祖细胞才会增殖^[19]。1956年Farber在研究几种不同化学物质造成的肝损伤时首先命名了卵圆细胞，肝损伤严重同时成熟肝细胞增殖受限或肝细胞本身损伤严重时，可以观察到大量具有卵圆形细胞核、胞浆

较少的细胞在汇管区大量聚集^[7]，并因此而被称为卵圆细胞^[20]。此后许多研究报道证实成年哺乳动物肝脏存在卵圆细胞^{[11, 16, 21-23]}。上述多项研究表明，卵圆细胞形态不均一，多数体积明显小于肝细胞，细胞核所占比重大，核仁明显，核/浆比例较大，胞质细胞器较少。在动物卵圆细胞增殖模型中，目前已筛选出一些卵圆细胞高度表达标志物OV6、CK9、CK17、GPC3、AFP、c-kit和EpCAM等^[7]。不同分子标志和不同程度的表达可能与肝干细胞的多源性和分化程度有关，提示卵圆细胞的异质性。在人类，已经发现肝癌、胆管细胞癌、肝硬化、遗传性血色病、酒精性肝病、慢性乙型病毒感染、慢性丙型病毒感染等疾病中卵圆细胞的增殖，而后5种疾病与原发性肝细胞癌发生密切相关^[23-25]。更有意义的是，多个研究组将获得的卵圆细胞株在致癌剂或癌基因作用下分别转化为不同类型的肝脏肿瘤^[26-28]，说明某些卵圆细胞亚群很可能是肝癌的前体细胞。

肝卵圆细胞作为目前公认的成体肝干/祖细胞和潜在的肝癌(干)细胞的前体细胞，其在肝干细胞移植/肝再生和肝癌发生发展等研究中颇受瞩目。肝卵圆细胞增殖、分离、纯化、体外(长期)培养模型旨在为上述研究提供技术支持。然而使干/祖细胞在体外增殖而保持未分化状态非常困难。作者的前期实验表明未添加生长因子时(体积分数为10% 胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺和 100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液)，卵圆细胞增殖较慢，传第1代需要两三周，且形态上有增大、向肝细胞逐渐裂解趋势，一般只能维持生长4-6周。为此，多种生长因子常联合用于体外培养卵圆细胞，如肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子、干细胞因子、胰岛素、纤维细胞生长因子、白血病抑制因子等。刘君等^[29]联合应用肝细胞生长因子和表皮生长因子体外培养大鼠肝脏卵圆细胞OC3，诱导10周后，卵圆细胞胞质变丰富，细胞器增多，表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST-P)和丙酮酸激酶(M2-PK)减弱，而表达白蛋白(ALB)、CK18增强，同时诱导后期的细胞较之诱导前主要出现了8种表达差异蛋白，提示在肝细胞生长因子与表皮生长因子的共同作用下，体外培养的卵圆细胞可逐步分化为成熟肝细胞，8种主要的结构蛋白或功能蛋白可能参与了对该过程的调控。Shupe等^[6]用含1%胰岛素的培养基在体外使卵圆细胞保持未分化状态达5个月之久。He等^[10]用含20 μg/L干细胞因子、10 μg/L肝细胞生长因子、20 μg/L肝脏刺激生长因子、10 μg/L表皮细胞生长因子的培养基培养卵圆细胞3个月并使细胞倍增次数达到100次，类似研究还有很多^{[4, 15-17]}。在这些生长因子中，干细胞因子被认为在干/祖细胞的生存和增殖中起着基础作用；表皮细胞生长因子可以明显促进上皮细胞合成DNA和卵圆细胞形成集落；肝细胞生长因子和干细胞因子能明显促进胎肝来源的肝干细胞样细胞的增殖^{[10, 30]}，但亦有文章指出肝细胞生长因子可以诱导肝干细胞分化和促进肝细胞成熟、增殖^{[11, 18, 31]}；白血病抑制因子用来抑制卵圆细胞的分化，因为有报道缺乏白血病抑制因子时卵圆细胞可向肝细胞和胆管上皮细胞分化^[10]；碱性成纤维细胞生长因子可以使人胚胎干细胞持续增殖并保持未分化状态^[30]。另外，也有许多研究者认为纤维母细胞层对卵圆细胞的生长是必要的，可能是因为其能分泌多种生长因子，模拟卵圆细胞增殖的微环境^[10]。但是构建纤维母细胞层会增加实验成本、难度，且由于其具体作用不确切、分泌成分不确定，不利于控制实验条件。本实验使用仅含体积分数为10%胎牛血清、20 μg/L表皮细胞生长因子、10 μg/L白血病抑制因子的培养基体外培养原代卵圆细胞，4个月时证明其仍能保持双向分化的能力，培养时间较长，且其操作简单、成本相对较小，此前未见有类似报道，可为其他研究者体外培养肝卵圆细胞提供一种新的选择。

值得注意的是，无论是2-乙酰胺基芴+2/3肝切除模型再生肝组织切片、卵圆细胞免疫细胞染色还是卵圆细胞蛋白Western blot都未发现Thy-1表达阳性。此前有多种文献认为卵圆细胞(肝干/祖细胞)表达Thy-1^{[5-6, 32]}，这被认为是肝再生时肝干/祖细胞肝外迁徙一说提供了有力证据。但目前认为虽然造血干细胞可以转化为肝干/祖细胞或肝细胞，但这种情况极为少见，大多数情况下这不是肝再生最有效的方式^[12]。2007年有研究者构建2-乙酰胺基芴+2/3肝切除模型诱导卵圆细胞大量增殖，分别将整个再生肝和激光显微分离的卵圆细胞行qRT-PCR分析AFP、Thy-1、SMA的表达量，发现整个再生肝中Thy-1表达量极少，而卵圆细胞中无表达^[12]。其利用免疫共聚焦等技术发现Thy-1始终出现在包围卵圆细胞的基膜之外，且与SMA表达范围重叠，而在无卵圆细胞增殖的肝纤维化模型中Thy-1在纤维母细胞中表达^[12]。所以卵圆细胞是否表达Thy-1尚需进一步检验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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