脂质体介导转染N2a细胞的优化方法

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (29): 4669-4674.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.014

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

脂质体介导转染N2a细胞的优化方法

赵云鹤¹，王若楠²，杨桂姣¹，陆利¹

¹山西医科大学人体解剖学教研室，山西省太原市 030001；²山西医科大学七年制临床医学系，山西省太原市 030001

修回日期:2014-05-24 出版日期:2014-07-09 发布日期:2014-07-09
通讯作者: 陆利，博士，教授，硕士生导师，山西医科大学人体解剖学教研室，山西省太原市 030001
作者简介:赵云鹤，女，1981年生，山西省阳泉市人，山西医科大学在读博士，主要从事神经干细胞衰老机制的相关研究。
基金资助:
山西省研究生创新基金项目(20133075)；山西省高等学校大学生创新创业培训项目(2013119)；山西医科大学青年科技研究基金项目(02201101)

Optimization of N2a cell transfection mediated by liposome

Zhao Yun-he¹, Wang Ruo-nan², Yang Gui-jiao¹, Lu Li¹

¹Department of Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; ²Seven-year Program of Clinical Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Revised:2014-05-24 Online:2014-07-09 Published:2014-07-09
Contact: Lu Li, Ph. D, Professor, Master’s supervisor, Department of Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Zhao Yun-he, Studying for doctorate, Department of Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
Shanxi Provincial Innovation Foundation for Postgraduate, No. 20133075; Innovation and Entrepreneurship Project of Shanxi Province for Higher Education, No. 2013119; Youth Science and Technology Research Fund of Shanxi Medical University, No. 02201101

摘要/Abstract

摘要：

背景：阳离子脂质体介导的细胞转染具有结果可靠、可重复性强的特点，但面临一个共同的缺点，就是转染效率常较低。

目的：探讨阳离子脂质体转染N2a细胞(小鼠神经胶质瘤细胞)的优化方法。

方法：采用24孔培养板，1.5 μL阳离子脂质体Lipofectamine™ LTX介导，通过贴壁法和悬浮法，将500 ng带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pcDNA3-GFP转入N2a细胞，倒置荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况，并比较二者转染效率。采用悬浮转染法，将500 ng质粒DNA分别用1.0，1.5，2.0，2.5 μL Lipofectamine™ LTX进行转染，探讨最适脂质体和DNA比例。

结果与结论：1.5 μL脂质体/500 ng DNA，悬浮法转染效率显著高于贴壁法转染效率(P < 0.01)；1.0，1.5，2.0，2.5 μL Lipofectamine™ LTX对500 ng质粒DNA的转染效率分别为(76.60±3.85)%，(80.00±4.17)%，(88.00±5.89)%，(54.96±4.23)%，提示脂质体2.0 μL与质粒DNA 500 ng的转染效率最高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 脂质体, 贴壁转染, 悬浮转染, N2a细胞, 绿色荧光蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Cationic liposome-mediated cell transfection is reliable and repeatable. However the transfection efficiency is often low.

OBJECTIVE: To study the optimized methods for gene transfection mediated by liposome into N2a cells (mouse neuroblastma cells).

METHODS: Using traditional adherent method and improved suspension method, 500 ng recombinant plasmid pcDNA3-GFP carrying green fluorescence protein was transfected into N2a cells in 24-well culture plate, which was mediated by 1.5 μL Lipofectamine™ LTX Reagent. The expression of green fluorescent protein was observed by inverted fluorescence microscope, and the transfection efficiencies at different transfection ways were calculated. By using improved suspension transfection method, 500 ng plasmid DNA was transfected with different doses of Lipofectamine™ LTX Reagent (1.0, 1.5, 2.0, 2.5 μL). The optimal ratio of liposome and DNA was explored.

RESULTS AND CONCLUSION: The transfection efficiency of suspension transfection method was significantly higher than that of the tranditional adherent method (P < 0.01) when using 1.5 μL liposome/500 ng DNA. The transfection efficiency of the 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 μL Lipofectamine™ LTX on 500 ng plasmid DNA was respectively (76.60±3.85)%, (80.00±4.17)%, (88.00±5.89)%, (54.96±4.23)%. It showed the 500 ng DNA and 2.0 μL liposome achieve the highest transfection efficiency.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: liposome, transfection, green fluorescent protein

中图分类号:

R318

赵云鹤，王若楠，杨桂姣，陆利. 脂质体介导转染N2a细胞的优化方法[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(29): 4669-4674.

Zhao Yun-he, Wang Ruo-nan, Yang Gui-jiao, Lu Li. Optimization of N2a cell transfection mediated by liposome[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(29): 4669-4674.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] Seo SJ, Kim TH, Choi SJ, et al. Gene delivery techniques for adult stem cell-based regenerative therapy. Nanomedicine (Lond). 2013;8(11):1875-1891.
[2] Brito LA, Chandrasekhar S, Little SR, et al. In vitro and in vivo studies of local arterial gene delivery and transfection using lipopolyplexes-embedded stents.J Biomed Mater Res A. 2010; 93(1):325-36.
[3] 潘敏慧,刘敏,刘佳,等.阳离子脂质体转染家蚕培养细胞的技术体系研究[J].蚕业科学,2008,34(4):684-688.
[4] Koirala A, Conley SM, Naash MI.A review of therapeutic prospects of non-viral gene therapy in the retinal pigment epithelium. Biomaterials. 2013;34(29):7158-7167.
[5] Podolska K, Stachurska A, Hajdukiewicz K, et al.Gene therapy prospects--intranasal delivery of therapeutic genes. Adv Clin Exp Med. 2012;21(4):525-534.
[6] Suzuki R, Takizawa T, Negishi Y, et al.Effective gene delivery with liposomal bubbles and ultrasound as novel non-viral system. J Drug Target. 2007 ;15(7-8):531-537.
[7] Wang W, Li W, Ma N,et al. Non-viral gene delivery methods. Curr Pharm Biotechnol. 2013;14(1):46-60.
[8] 李永伟,卢建溪,郭云蔚,等.磷酸钙法与脂质体法转染HBV全基因组的比较[J].中国热带医学,2010,10(6):656-658.
[9] Pappalardo JS, Langellotti CA, Di Giacomo S, et al. In vitro transfection of bone marrow-derived dendritic cells with TATp-liposomes. Int J Nanomedicine. 2014;13(9):963-973.
[10] Yang J, Liu H, Zhang X. Design, preparation and application of nucleic acid delivery carriers.Biotechnol Adv. 2014;32(4): 804-817.
[11] Zhi D, Zhang S, Qureshi F, et al. Structure-activity relationship of carbamate-linked cationic lipids bearing hydroxyethyl headgroup for gene delivery.Colloids Surf B Biointerfaces. 2013 ;112:537-541.
[12] Savarala S, Brailoiu E, Wunder SL,et al. Tuning the self-assembling of pyridinium cationic lipids for efficient gene delivery into neuronal cells. Biomacromolecules. 2013;14(8): 2750-2764.
[13] De La Vega J, Braak BT, Azzoni AR, et al. Impact of plasmid quality on lipoplex-mediated transfection.J Pharm Sci. 2013; 102(11):3932-3941.
[14] Xu L, Feng L, Dong R, et al. Transfection efficiency of DNA enhanced by association with salt-free catanionic vesicles. Biomacromolecules. 2013;14(8):2781-2789.
[15] Chen Y, Sun J, Lu Y, et al. Complexes containing cationic and anionic pH-sensitive liposomes: comparative study of factors influencing plasmid DNA gene delivery to tumors. Int J Nanomedicine. 2013;8:1573-1593.
[16] 安龙,续惠云,瓮媛媛,等.小鼠骨样细胞MLO—Y4转染方法的研究[J].生物学杂志,2010,27(6):87.
[17] 赵祥宇,舒鹏程,张靖,等.小鼠脑皮质神经干细胞体外培养及miRNAs影响其分化能力[J].基础医学与临床,2011,31(6):630- 635.
[18] 段艳,王冰,崔韶辉,等.阳离子脂质体转染He la细胞的实验[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2009,13(11):2119-2122.
[19] 段炼,周波,李启富.影响人脐静脉内皮细胞脂质体转染pReceiver-M29-PRKcB1效率因素的探讨[J].重庆医科大学学报,2009,34(1):9-12.
[20] Yang HY, Vonk LA, Licht R, et al. Cell type and transfection reagent-dependent effects on viability, cell content, cell cycle and inflammation of RNAi in human primary mesenchymal cells.Eur J Pharm Sci. 2014;53:35-44.
[21] 陈小艳,张弓,刘芳,等.不同方式转染小鼠B淋巴瘤细胞A20的探讨[J].实用医学杂志,2009,25(19):3201-3203.
[22] 庄炜,李莉,雷凯波,等.体外脂质体转染兔成肌细胞优化条件的研究[J].中华实验外科杂志,2009,26(4):536.
[23] Jain S, Sharma A, Basu B. In vitro cytocompatibility assessment of amorphous carbon structures using neuroblastoma and Schwann cells. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2013 ;101(4):520-531.
[24] Felgner PL, Ringold GM. Cationic liposome-mediated transfection.Nature.1989;337(6205):387-388
[25] Pezzoli D, Kajaste-Rudnitski A, Chiesa R, et al. Lipid-based nanoparticles as nonviral gene delivery vectors. Methods Mol Biol. 2013;1025,269-279.
[26] Sarker SR, Aoshima Y, Hokama R, et al. Arginine-based cationic liposomes for efficient in vitro plasmid DNA delivery with low cytotoxicity.Int J Nanomedicine. 2013;8:1361-1375.
[27] Govindarajan S, Kitaura K, Takafuji M, et al. Gene delivery into human cancer cells by cationic lipid-mediated magnetofection. Int J Pharm. 2013;446(1-2):87-99.
[28] Coppola S, Cardarelli F, Pozzi D, et al. The role of cytoskeleton networks on lipid-mediated delivery of DNA.Ther Deliv. 2013;4(2):191-202.
[29] Kim BK, Seu YB, Bae YU, et al. Efficient delivery of plasmid DNA using cholesterol-based cationic lipids containing polyamines and ether linkages. Int J Mol Sci. 2014;15(5): 7293-7312.
[30] Wang W, Li W, Ma N, et al. Non-viral gene delivery methods. Curr Pharm Biotechnol. 2013;14(1):46-60.
[31] 邓欣,赵宇,李亘松,等.脂质体转染质粒DNA成功导入小鼠受精卵[J].解剖科学进展,2010,16(6):514-518,522.
[32] 粟文俊,蒋泓,唐冬生,等.脂质体转染巴马猪胎儿成纤维细胞条件的优化[J].中国农学通报,2011,27(7):300-303.
[33] 魏云波,高平,刘书花,等.阳离子脂质体转染效率的主要影响因素[J].北方药学,2012,9(11):86.
[34] Priya R, Dhanwani R, Patro IK, et al.Differential regulation of TLR mediated innate immune response of mouse neuronal cells following infection with novel ECSA genotype of Chikungunya virus with and without E1:A226V mutation. Infect Genet Evol.2013;20C:396-406.
[35] Laurenti E, Barde I, Verp S, et al. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 2010,28(8):1390-1398.
[36] Zhang M,Guller S,Huang Y.Method to enhance transfection efficiency of cell lines and placental fibroblasts. Placenta. 2007;28(8-9):779-782.
[37] Malecki M, Swoboda P, Pachecka J.Recombinant adeno-associated virus derived vectors(rAAV2) efficiently transducer ovarian and hepatocellular carcinoma cells implications for cancer gene therapy.Acta Pol Pharm. 2009; 66(1):93-99.

引言

通过PCR、基因工程、分子杂交、基因转染等分子生物学技术将某特定外源基因DNA、RNA等转导至真核细胞内表达，是研究基因功能及其作用机制、调控基因表达、进行突变分析和蛋白质生产等生物学试验的重要手段^[1]。随着现代分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，基因转染技术不但革新了生物学研究领域和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，基于基因转染技术的基因治疗作为一种靶向性治疗相关性疾病的方法而被广泛地应用于医学临床应用研究^[2]。近年来，这种技术已广泛应用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究^[3-4]。

将某一特定的靶基因传递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，这一系统可概括为两大类：病毒载体和非病毒载体^[5-6]。病毒载体是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得该基因进入细胞内稳定表达，转染效率最高，但其前期准备较复杂、且容易造成细胞感染和存在潜在致癌性等安全性问题限制了它在临床中的应用。非病毒载体有DEAE-葡聚糖转染法、磷酸钙-DNA共沉淀法、电穿孔法及脂质体介导DNA转染法等^[7]。

电穿孔法转染是利用电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使外源DNA分子进入胞内；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；但是由于电穿孔法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大^[8]，一般应用于脂质体转染效率很低或几乎无法转入时，所以对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法仍多采用脂质体法^[9-11]。

阳离子脂质体介导的细胞转染具有结果可靠、可重复性强的特点^[12]，但面临一个共同的缺点，就是转染效率较低，提高转染效率对研究基因的结构、功能和基因工程、基因治疗等均是非常重要的因素，影响脂质体介导基因转染效率的因素很多：DNA纯度^[13]、脂质体粒径大小、脂质体与质粒DNA的比例、细胞密度以及转染的时间长短等均影响脂质体转染的效率^[14-15]，且不同的细胞种系对同一脂质体转染方案其效率有很大差异^[16-20]，通过实验摸索合适的转染条件对于转染效率的提高有巨大的作用和必要性^[21-22]。

因此，本实验应用N2a细胞(mouse neuroblastma N2a cells，小鼠神经胶质瘤细胞)，以绿色荧光蛋白为标记蛋白，应用显微荧光技术，探讨一种改良的脂质体介导基因转染法。该方法基于传统的脂质体介导法，用新鲜胰酶消化的细胞，去掉含血清细胞培养基，加入预温的转染试剂复合液孵育，观察并比较传统贴壁转染与改良后的悬浮转染两种方法介导质粒pcDNA3-GFP转染N2a细胞的效率，优化转染方法及条件，提高转染效率，为后续基因功能等的研究提供实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：完全随机设计，体外细胞观察。

时间及地点：于2013年3至9月在山西医科大学人体解剖学科研实验室完成。

材料：

Omega大量抽提试剂盒进行质粒抽提，酶标仪紫外分光光度法检查质粒DNA浓度0.5 g/L，A₂₆₀/A₂₈₀比值1.80。

实验方法：

设计及合成基因pcDNA3-GFP：

质粒DNA：pcDNA3-GFP，GFP作为质粒DNA转染的报告蛋白。pcDNA3-GFP按照标准实验步骤通过热休克转化入E. coli-DH5α转化菌，通过氨苄青霉素抗性LB琼脂固体培养板纯化，氨苄青霉素抗性LB琼脂液体培养基37 ℃摇震扩增，使用Omiga质粒抽提试剂盒，按照说明书操作步骤大量抽提，酶标仪检测质粒DNA浓度，质量，-20 ℃保存备用。

N2a细胞培养：N2a细胞在DMEM细胞培养基，体积分数10%胎牛血清，青霉素(100 U/mL)，链霉素(100 mg/L)，37 ℃，体积分数5% CO₂，饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养^[23]，常规换液传代，将细胞培养至对数生长期。准备无菌24孔板，种细胞，将每孔N2a细胞稀释为6×10⁷，8×10⁷，10×10⁷ L^-¹，次日观察细胞生长状态。选择贴壁生长融合率60%-70%的细胞进行转染实验。

脂质体贴壁转染法和悬浮转染法转染效率比较：①细胞转染实验分为贴壁转染组和悬浮转染组，分别设空白对照组，每组3个复孔。贴壁转染组及其对照组于转染实验前1 d，收获对数生长期的细胞，于24孔培养板接种细胞， 37 ℃过夜培养，次日即转染实验当天，细胞生长融合率达60%-70%。②制备转染复合液：A液：在灭菌的聚苯乙烯Eppendorf 管中用25 μL OPTI-serum稀释1.5 μL 脂质体LTX、混匀；B液：DNA 500 ng溶于25 μL OPTI-serum、再加0.5 μL Plus液，混匀；室温孵育5 min；将A液和B液混合(终体积50 μL)，室温静置20 min。③贴壁转染组除去原培养基，OPTI-serum洗涤2次，将上述转染复合液加入细胞培养孔，用 OPTI-serum补足1 mL。④悬浮转染组取处于对数生长期的N2a细胞用0.1%胰酶消化，完全培养基终止消化，离心、OPTI-serum重悬、计数，8×10⁴/50 μL转染复合物混合，室温静置15 min，接种于24孔培养板。⑤空白对照组加正常培养基。⑥体积分数5%CO₂，37 ℃细胞培养箱正常培养，6 h后换入完全培养液继续培养。

不同DNA和脂质体比例对转染效率的影响：①制备转染复合液：A液：分别用25 μL OPTI-serum稀释1.0，1.5，2.0，2.5 μL 脂质体LTX、混匀；B液：将500 ng DNA溶于25 μL OPTI-serum、再加0.5 μL Plus液，混匀；室温孵育5 min；将A液和B液混合(终体积50 μL)，室温静置20 min。②转染方法同上。

观察转染效率：在上述实验的基础上，以未进行转染，正常培养的N2a细胞作为空白阴性对照，观察实验组的转染效率。转染48 h后可见光下观察细胞形态及数量，倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白，根据绿色荧光蛋白表达细胞数检测转染效率。在明场(白光)下固定1个高倍视野，计数细胞总数然后转换荧光(绿色)，计数发出绿色荧光的细胞数，转染效率(%)=(荧光细胞数/计数的细胞总数)× 100%。

主要观察指标：①N2a细胞培养结果。②贴壁法和悬浮法转染效率比较。③不同脂质体和DNA比例对悬浮转染效率的影响。

统计学分析：样本用x(_)±s表示，组间差异使用SPSS 17.0进行卡方检验，单因素方差分析，α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

20世纪80年代，Feigner等首次通过实验证明阳离子脂质体可用于DNA 转染，该发现发表于《Nature》杂志^[24]。阳离子脂质体是N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride (DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine (DOPE)的混合物(质量比1∶1)，其原理是当阳离子脂质体试剂加入水中时，形成微小的带正电的单层脂质体(平均100-400 nm)，能和带负电的基因(DNA 或RNA)的磷酸根吸附形成基因-脂质体复合物，同样也能和表面带负电荷的细胞膜吸附，而脂质体本身的亲脂性，可使脂质复合物通过细胞内吞或细胞膜融合作用进入细胞内形成内涵体；脂质复合物在细胞质中或进一步传递到细胞核内释放基因，从而在细胞内转录和翻译^[25-29]。其生物膜特性能使其转运的基因保持生物活性，保护基因免受溶酶体的降解，且具有操作简单、重复性好、可自然降解等优点^[30]，是目前条件下最方便的转染方法之一^[31-32]。因脂质体对细胞有一定的毒性，用脂质体进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该产品对转染某一特定细胞适合作用时间、脂质体和DNA两者的最佳剂量等^[33]。

N2a细胞全称mouse neuroblastoma N2a cells，也有人称其为Neuro-2a，是小鼠来源神经胶质瘤细胞^[34]。质粒pcDNA3-GFP中GFP序列为报告基因，绿色荧光蛋白(GFP)是存在于水母中的一种天然荧光蛋白，在各种异源细胞中表达后，不需要任何外加酶或底物便可在合适的激光激发下发出绿色荧光，作为报告基因具有观察简单方便、直观并能对活细胞进行观察的优点^[35]。

本实验在脂质体Lipofectamine^TM LTX&PLUS介导下将重组质粒pcDNA3-GFP转染入N2a细胞，48 h后倒置荧光显微镜观察，以绿色荧光蛋白为标记，成功转染质粒DNA的细胞在470-490 nm光激发下可发出绿色荧光。因为脂质体介导DNA的细胞转染率与DNA和脂质体的比例密切相关，若DNA浓度过高中和了脂质体表面电荷，则可降低与细胞的结合能力；若脂质体浓度过高时，容易出现细胞脱落和坏死，转染效率反而降低，本实验参照脂质体Lipofectamine^TM LTX&PLUS说明书，使用24孔培养板，500 ng重组质粒DNA，采用传统贴壁和改良的悬浮转染法，转染时间6 h，以绿色荧光蛋白为标记，探索N2a细胞脂质体转染的最佳方法和最适条件。

实验结果发现，N2a细胞悬浮转染法的效率优于贴壁转染^[36][(80±4.17)%，(27.2±3.18)%]，其原因可能为阳离子脂质体和基因的复合物在悬浮转染法中与细胞膜接触面积更广，更充分，可将更多的基因通过细胞内吞作用运送入细胞内表达。对悬浮转染法1.0，1.5，2.0，2.5 μL不同脂质体剂量组的转染效率进行比较，发现随着脂质体量增加，绿色荧光蛋白的表达量增加，当质粒脂质体比例为500 ng/ 2.0 μL时，转染效率最高；当两者比例为500 ng/2.5 μL时，脂质体量增加，转染效率反而降低[(76.60±3.85)%，(80.00±4.17)%，(88.00±5.89)%，(54.96±4.23)%]，原因可能为阳离子脂质体带有很强的正电荷，具有细胞毒性，当脂质体浓度过高时，脂质体对细胞的毒性也随之增大，过量的脂质体导致细胞死亡数增多，转染效率下降^[37]。实验结果表明，通过改良后的脂质体悬浮转染法介导外源性基因pcDNA3-GFP 进入N2a细胞可获得更高效率，该改良方法及其优化参数可为进一步的动物实验和临床研究提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Optimization of N2a cell transfection mediated by liposome

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[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[3]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[4]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[5]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[6]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[7]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[8]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[9]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[10]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[11]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[12]	陈思奇, 先德彬, 徐荣胜, 覃中杰, 张磊, 夏德林. 羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3458-3465.
[13]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[14]	王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.
[15]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.