HLA-A2小干扰RNA的设计及沉默效果检测

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.003

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (29): 4605-4610.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.003

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HLA-A2小干扰RNA的设计及沉默效果检测

刘建生，赵刚，裴丹，郑德宇

辽宁医学院解剖学教研室，辽宁省锦州市 121001

修回日期:2014-06-18 出版日期:2014-07-09 发布日期:2014-07-09
通讯作者: 郑德宇，博士，硕士生导师，教授，辽宁医学院解剖学教研室，辽宁省锦州市 121001
作者简介:刘建生，男，1983年生，内蒙古自治区通辽市人，蒙古族，硕士，主要从事神经退行性病方面的研究。
基金资助:
辽宁省自然科学基金资助项目(2013022066，2013022048)；辽宁省教育厅项目(L2013335)；辽宁医学院青年基金项目(Y2011Z022)

Designation and silencing function of the small interfering RNA of HLA-A2

Liu Jian-sheng, Zhao Gang, Pei Dan, Zheng De-yu

Department of Anatomy, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

Revised:2014-06-18 Online:2014-07-09 Published:2014-07-09
Contact: Zheng De-yu, M.D., Master’s supervisor, Professor, Department of Anatomy, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China
About author:Liu Jian-sheng, Master, Department of Anatomy, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 2013022066, 2013022048; a grant by Liaoning Provincial Education Bureau, No. L2013335; the Youth Fund of Liaoning Medical University, No. Y2011Z022

摘要/Abstract

摘要：

背景：人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是人的主要组织相容性复合物，在移植排斥反应中起关键作用。降低HLA的表达，可以延长移植物的存活时间。

目的：设计HLA-A2小干扰RNA，检测其对HLA-A2表达沉默的作用。

方法：设计4种HLA-A2 siRNA靶点序列构建其慢病毒表达体系，体外感染HLA-A过表达的293T细胞，观察4种靶点的敲减效率并筛选出有效靶点序列。体外培养人胚肺成纤维细胞，并用携带目的干扰序列的慢病毒感染人胚肺成纤维细胞，荧光显微镜下观察感染效率，应用Western blot检测在人胚肺成纤维细胞中对HLA-A2表达沉默的作用。

结果与结论：根据Genbank中HLA-A2的mRNA序列，设计合成了3个小干扰RNA，在体外能有效的沉默HLA-A2在293细胞中的表达，将基因序列亚克隆入干扰载体后感染人胚肺成纤维细胞，也能有效的沉默HLA-A2的表达，效率达80%左右。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 人类白细胞抗原A2, RNA干扰, 基因沉默, 人胚肺成纤维细胞, 辽宁省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Human leukocyte antigen (HLA), the major histocompatibility complex of human, plays an important function in the transplant rejection. Decreasing the expression of HLA will prolong the survival time of transplants.

OBJECTIVE: To design small interfering RNA (siRNA) of HLA-A2 and to detect the effect of siRNA-HLA-A2 on the expression of HLA-A2.

METHODS: Four kinds of siRNA-HLA-A2 domains were designed, and recombinant lentivirus expression vector were formed. The 293T cells, highly expressing HLA-A2, were infected in vitro. Then the knockout efficacy of four domains was detected to select the highly efficient siRNA-HLA-A2 target sequences. The human embryo lung fibroblasts were cultured in vitro and infected with the lentivirus carrying the target sequence. The infecting efficiency of LV-siRNA-HLA-A2 was observed under the fluorescence microscope and the silence function of this siRNA in human embryo lung fibroblasts was detected by western blot analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: According to the mRNA sequence of HLA-A2 in Genbank, three siRNAs were designed and synthesized. In vitro, the over expression of HLA-A2 in 293K cells was successfully silenced. The HLA-A2 expression in human embryo lung fibroblasts was also efficiently silenced after the human embryo lung fibroblasts were infected by the highly efficient siRNA of HLA-A2. The efficacy was up to 80%.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: HLA antigens, RNA interference, gene silencing, fibroblasts

中图分类号:

R318

刘建生，赵刚，裴丹，郑德宇. HLA-A2小干扰RNA的设计及沉默效果检测[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(29): 4605-4610.

Liu Jian-sheng, Zhao Gang, Pei Dan, Zheng De-yu. Designation and silencing function of the small interfering RNA of HLA-A2[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(29): 4605-4610.

图/表（结果） 1

2.1 HLA-A2基因克隆和表达载体的构建和表达 在5个PCR扩增的温度中，均得到HLA-A2 cDNA的目的片段，长度约1 100 bp，其中64 ℃扩增效率最好(图1)。切取64 ℃所代表的目的条带进行玻璃奶回收，回收的PCR产物与T载体经EcoRⅠ酶切后，经T₄ DNA连接酶连接获得pGEM-T easy-HLA-A2，序列测定显示与Gene bank中的序列完全一致。将pGEM-T easy-HLA-A2与pEGFP-C1载体应用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，玻璃奶回收目的片段，经T₄ DNA连接酶连接获得重组载体。pEGFP-HLA-A2转化感受态细胞，提取质粒酶切鉴定表明融合蛋白表达载体pEGFP-HLA-A2构建成功，测序结果表明HLA序列完全正确。

2.2 pEGFP-HLA-A2在体外的表达 在Lipofectamine 2000介导下，pEGFP-HLA-A2和pEGFP-C1均能高效的转染293T细胞。收集细胞总蛋白，用HLA-A2抗体进行Western Blot检测，结果表明pEGFP-HLA-A2转染293T细胞能表达HLA-A2蛋白，而转染pEGFP-C1空载体则无HLA-A2的表达(图2)。

2.3 表达siRNA慢病毒载体的构建和病毒包装 退火的siRNA双链序列全长64 bp，接入pGCL-EGFP载体用PCR鉴定可扩增出预期的360 bp片段，pGCL空载体扩增产物为300 bp(图3)。测序结果表明插入的siRNA序列完全正确。

表达siRNA分子的慢病毒在包装细胞能表达绿色荧光蛋白。48 h后在倒置荧光显微镜下检测绿色荧光，通过对比不同稀释度的假病毒颗粒溶液对细胞的感染效率，得知经离心浓缩的病毒滴度>10⁸/mL。

2.4 不同靶点siRNA干扰效率检测 在HLA-A cDNA质粒转染293T细胞的基础上，加入适量表达不同靶点siRNA干扰病毒溶液，用Western blot检测HLA的表达水平，结果表明，1号和2号靶点病毒的敲减效率较好(图4)。本实验对含2号靶点的病毒载体进行大包装和纯化浓缩。

对比观察不同MOI值的病毒溶液对人胚肺成纤维细胞的感染情况，发现MOI值为20时细胞状态良好，病毒感染效率在80%以上。

2.5 慢病毒感染人胚肺成纤维细胞 人成纤维细胞感染72-96 h后荧光显微镜下观察，可见感染率达到80%以上(图5)。在感染1周后，收集细胞，提取细胞总蛋白，经Western blot检测显示，感染siRNA-HLA-A2后，人成纤维细胞中HLA-A2的表达在有的组几乎检测不到，有的仅能看到淡淡的条带(图6)。将Western blot结果进行灰度扫描，应用HLA-A2的条带灰度除以内参照β-actin条带的灰度，可以得出HLA-A2的相对表达量，可见HLA-A2在siRNA-HLA- A2感染人胚肺成纤维细胞中的表达量仅为0.041±0.005，不足正常培养细胞(0.139±0.021)或感染siRNA阳性对照组(0.143±0.018)的30%，差异有显著性意义(P < 0.01)，而正常培养的细胞和阳性对照组之间则差异无显著性意义。说明siRNA-HLA-A2感染后能有效的抑制HLA-A2的表达。

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引言

移植物在宿主中引起的免疫排斥反应主要是由移植物与宿主的组织相容性抗原复合物(major histocompatibility complex，MHC)不同而引起。这也在异种移植排斥反应中起关键作用^[1-3]。人类的主要组织相容性复合物为人类白细胞抗原(human Leukocyte Antigen，HLA)。HLA基因位于人类第6号染色体上(6p21.3)，全长3 600 kb，是目前为止所知最复杂的人类遗传多态性系统。HLA复合物可分为3个区，分别称之为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类基因^[4-6]。Ⅰ类基因包括HLA-A、-B、-C位点，编码HLA-Ⅰ类抗原，此类抗原在所有的有核细胞上均有表达(不包括神经元和横纹肌细胞^)[7-8]。Ⅱ类基因包括HLA-DQ、-DP、-DR位点，编码HLA-Ⅱ类抗原，此类抗原仅在免疫效应细胞上有表达，如吞噬细胞、单核细胞^[9-10]。当移植物在体内建立血液循环后，移植物HLA-Ⅰ和Ⅱ类抗原暴露于宿主的免疫系统，受者的免疫细胞识别外来抗原后，CD8⁺细胞毒性T细胞前体细胞与供者HLA-Ⅰ类抗原结合后活化增殖为成熟的细胞毒性T细胞，对移植物产生攻击效应；CD4⁺T辅助细胞识别供者HLA-Ⅱ类抗原，促使抗原递呈细胞释放白细胞介素1，后者可促进T辅助细胞增殖和释放白细胞介素2，白细胞介素2可进一步促进T辅助细胞增殖并为细胞毒性T细胞的分化提供辅助信号；除了白细胞介素2之外，TH细胞还能产生白细胞介素4、白细胞介素5，促进B细胞分化并产生抗移植物的抗体，参与移植排斥^[11-13]；可见在HLA分子中，Ⅰ类抗原在移植物的免疫排斥反应中起重要的作用，其中HLA-A2抗原在人类细胞中表达率最高，在免疫排斥反应中起主要的作用。临床资料表明，若肾移植患者血液中存在针对HLA-Ⅰ类抗原的抗体，则宿主排斥反应明显且移植物存活能力较差^[14-15]。因此，降低移植物HLA-Ⅰ类抗原的表达应能提高脑内移植的异种或同种细胞的存活。有研究表明用HLA-A2的反义核酸技术处理人成纤维细胞再移植入帕金森病大鼠纹状体，可降低异种移植排斥反应程度，并且延长细胞的存活时间[16-18]。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。它能够特异性降解具有与其序列相同的单链RNA分子，从而高效特异地沉默靶基因表达^[19-21]。RNAi研究技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。本实验拟设计并合成HLA-A2小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)序列，体外筛选后包装入慢病毒载体，并感染人胚肺成纤维细胞检测其对HLA-A2的基因表达沉默的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：基因水平体外观察实验。

时间及地点：实验于2011年9月至2013年12月在辽宁医学院解剖学教研室的无菌培养室完成。

材料：慢病毒载体系统(包括pGCL-GFP，pHelper1.0和pHelper2.0三个质粒，Addgene公司)，Trizol RNA提取试剂、DEPC、小鼠抗HLA-A2单克隆抗体(Sigma)，Superscript^TM 反转录酶(Invitrogen)，Easy-A High-Fidelity PCR Clonging Enzyme、质粒大量制备试剂盒(Promega)，EcoRⅠ、BamHⅠ内切酶、DNA marker(NEB)，DNA纯化回收试剂盒(北京博大泰克)，293T细胞(上海博古生物科技公司)。

方法：

引物设计：根据人的HLA-A2编码区序列(GenBank NM_002116)和T载体设计PCR引物序列：上游为5’-CAT GGC GGC CGC GGG AAT TCT GAC TAC AAA GAC GAT GAC GAC AAG ATG GCC GTC ATG GCG CCC CGA AC，下游为5’-GCA GGC GGC CGC GAA TTC TGG ATC CTT ATT ACA CTT TAC AAG CTG TGA GGG AC。引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。下划线部分含有EcoRⅠ酶切位点，之后为BamHⅠ酶切位点。

HLA-A2基因克隆：

RT-PCR：取健康自愿者外周血白细胞，按试剂盒的操作方法，用Trizol RNA提取外周血白细胞总RNA，再用反转录聚合酶superscript^TM合成cDNA第一链，取部分cDNA产物PCR扩增HLA-A2 cDNA，其余产物于-20 ℃保存备用。PCR反应条件为预变性94 ℃ 3 min、94 ℃ 1 min、梯度温度(56 ℃，58 ℃，60 ℃，62 ℃，64 ℃)退火1 min、延伸72 ℃ 1 min，共30个循环，72 ℃ 5 min充分延伸。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，Glassmilk DNA纯化回收目的片段。

PCR产物与T载体连接：将PCR回收产物与pGEM-T easy vector分别用EcoRⅠ酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳，Glassmilk DNA纯化回收目的片段。回收片段混匀后用T₄ DNA连接酶于16 ℃反应16-20 h构建pGEM-T easy- HLA-A2载体。常规制备感受态细菌并用重组载体进行转化，LB培养板37 ℃培养12-16 h。常规方法提取质粒进行酶切鉴定后送北京三博远志基因公司测序，测序结果与GenBank上的HLA-A2 cDNA序列进行比对。

HLA-A融合蛋白表达载体的构建和表达：

HLA-A融合蛋白表达载体的构建：BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pEGFP-C1载体和pGEM-T easy-HLA-A2载体，酶切产物产物经1%琼脂糖凝胶电泳，Glassmilk DNA纯化回收目的片段。将目的片段混合在一起用T₄ DNA连接酶连接目的片段，构建融合蛋白表达载体pEGFP-HLA-A2。重组载体转化感受态细胞，提取质粒酶切鉴定。

pEGFP-HLA-A2表达的检测：在Lipofectamine 2000介导下，用pEGFP-HLA-A2和pEGFP-C1转染293T细胞，4 h后加入新鲜培养基(含血清)培养48 h。观察绿色荧光检测感染效率和用Western blot检测HLA-A2水平。余细胞冻存备用。

HLA-A2基因特异siRNA的设计、合成、包装和筛选：

表达siRNA慢病毒载体的构建：siRNA靶点设计：根据人的HLA-A2编码区序列(GenBank NM_002116)设计了4个待选靶点序列：1号GGA GAC ACG GAA TGT GAA G，2号CAC CAT CCA GAT AAT GTA T，3号GCA GAG ATA CAC CTG CCA T和4号GGA CCA GGA GAC ACG GAA T，分别起始于编码区的第257，350，833和251位碱基，同时用序列TTC TCC GAA CGT GTC ACG T作为对照。

根据以上靶点序列合成双链DNA分子。序列包括：上述靶点序列、中间的Loop序列(TTC AAG AGA)及靶点的互补序列，序列上游5’-末端为T，下游3’-末端为TTT TTT C。另一条链为上述序列的互补序列，上游5’-末端为A，下游 3’-末端为AAA AAA GAG CT。全部序列由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。目的片段克隆至pGCL-GFP慢病毒载体后转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒用PCR方法鉴定阳性克隆。PCR上游引物：5’-GCC CCG GTT AAT TTG CAT AT -3’，下游：5’-GTA ATA CGG TTA TCC ACG CG -3’，分别开始于pGCL-GFP载体的第2 706位和2 986位碱基。PCR鉴定后的阳性克隆送检测序。

病毒包装和滴度测定：培养293T细胞密度达60%-70%待用。利用脂质体介导的方法应用慢病毒包装试剂盒小量包装并纯化慢病毒颗粒，记为pLV-siRNA。在96孔板的每孔中加入293T细胞5×10⁴个。每孔加入1∶10倍比稀释的假病毒颗粒溶液，每个滴度复孔4个，37 ℃培养，用于滴度的测定。

病毒感染和RNAi靶点的筛选：复苏冻存的感染HLA-A2的293T细胞，待细胞达到50%-60%融合时，加入适量病毒。继续培养。2 d后更换为正常培养基。常规传代培养。6 d后收集总蛋白样品，通过Western Blotting方法检测HLA-A2蛋白表达水平以评价不同靶点RNAi的敲减效率。筛选高效特异的pLV-siRNA，并进行大量包装。

HLA-A2高效特异的pLV-siRNA对人成纤维细胞HLA-A2表达的沉默效果检测：复苏本室冻存的人成纤维细胞，在细胞达到70%-80%融合时常规酶蛋白酶-EDTA消化，以2×10⁸ L^-¹接种于6孔培养板中，每孔3 mL。第2天细胞达到40%左右的融合时，先吸弃培养基，用病毒稀释液清洗1次，加入1.5 mL病毒稀释液(MOI=20，含2 mg/L的Polybrene)。37 ℃，体积分数为5%CO₂、饱合湿度的培养箱中继续培养。12 h后用含有体积分数为20%胎牛血清的培养基半量换液，36 h后体积分数为10%胎牛血清的培养基全量换液。72-96 h后，荧光显微镜观察病毒的感染效率。细胞达到70%-80%融合后，常规传代培养。于感染后7 d收集细胞，提取细胞总蛋白，应用Western blot方法检测HLA-A2的表达。以无关序列做阳性对照，正常培养的人成纤维细胞做对照。

主要观察指标：HLA-A2基因克隆的结果、siRNA的设计合成结果、siRNA对HLA-A2蛋白表达的沉默作用。

统计学分析：应用SPSS 13.0分别对siRNA-HLA-A2感染人胚肺成纤维细胞后蛋白水平进行配对t 检验，以分析小干扰RNA对HLA-A2表达沉默的作用。

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移植物MHC分子在异种移植排斥反应中起关键作用，宿主的CD8⁺细胞毒T细胞的前体细胞通过识别供体MHC分子，然后自身活化增殖为成熟的细胞毒T细胞，对移植物产生攻击效应，从而启动免疫应答^[22-24]。Markmann等报道在不使用免疫抑制剂的情况下，将MHC基因敲除的鼠胰岛细胞异体移植后，细胞存活时间延长^[25-27]。将MHCⅠ或(和)MHCⅡ敲除的小鼠胚胎中脑神经元移植到大鼠脑中可以长期存活，并且降低免疫反应^[28-31]，移植物MHCⅠ用F(ab')片断阻断后也可以减轻免疫排斥反应^[32-34]。缺乏MHC分子的肝脏细胞异种移植后存活时间也会延长^[35-38]。在人类的细胞中，MHC分子为HLA抗原，分别由HLA-Ⅰ类基因和Ⅱ类基因编码，而HLA-Ⅰ类基因编码的抗原分子包括HLA-A、HLA-B和HLA-C 3类，这些抗原广泛的存在于体细胞的表面^[39-41]，其中在汉族人群中，HLA-A2抗原表达最广。实验选择HLA-A2作为目的基因，如果能沉默HLA-A2基因的表达，就能降低移植物细胞表面HLA-A2抗原引起的免疫排斥反应。首先，实验中应用差异温度PCR的方法克隆了HLA-A2基因，从实验中发现扩增的温度越高，获得基因的正确率越高。选择正确的基因序列将其亚克隆入表达载体中，并用表达载体转染293T细胞，经过筛选后获得了过表达HLA-A2的293T细胞。这为下一步进行小干扰RNA的设计及筛选打下基础。克隆获得的目的基因与Genbank中的序列完全一致，说明能进行后续的研究。然后实验设计4个小干扰靶点分子，在HLA-A2过表达细胞用Western blot技术筛选到2个HLA-A有效靶点，随机选用了其中一个对HLA-A2起作用的靶点，同时对也能与HLA-A其他亚类序列结合的也有一点沉默作用的干扰序列，作为本实验的目的序列。在这一过程中，设计获得的小干扰RNA并不能保证每个片段都具有良好的干扰效果，也不能保证有效果的干扰片段对细胞的管家基因没有影响，在所有实验中，仅仅筛选出2个相对效果较好的小干扰RNA片段，随机选择一个并将有效的序列克隆入慢病毒载体并进行包装后，能有效的沉默HLA-A2在293T细胞中的表达。随后应用siRNA-HLA-A2感染人胚肺成纤维细胞后，在荧光显微镜下观察感染效率达到80%以上，这表明实验获得的siRNA-HLA-A2具有良好的感染效率，增加了实验的稳定性，能感染80%的细胞。人胚肺成纤维细胞在感染siRNA- HLA-A2 1周后，应用Western blot检测确认人成纤维细胞HLA-A2的表达几乎检测不到，可以认为在实验中获得的siRNA-HLA-A2能有效沉默人胚肺中HLA-A2基因的表达，减弱或抑制感染了siRNA-HLA-A2的人胚肺成纤维细胞HLA-A2抗原的数量，从而达到减弱细胞的免疫排斥反应的发生。应用小干扰RNA能降低同种异体种子细胞的抗原性，在一定程度上可以延长载体细胞在宿主体内的生存时间，使目的基因在宿主中获得较长时间的表达。但在今后的应用过程中，尚要解决感染了siRNA-HLA-A2细胞的安全性和致瘤性的问题。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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HLA-A2小干扰RNA的设计及沉默效果检测

Designation and silencing function of the small interfering RNA of HLA-A2

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