过表达大鼠TIPE2基因重组腺病毒载体的构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：TIPE2抗炎蛋白，通过对T细胞受体(TCR)和T细胞TOLL样受体信号途径实行负向调节，从而对适应性免疫和固有免疫起到负性调控作用，有效地维持机体内环境的稳定。

目的：使用人工合成腺病毒载体构建能过表达大鼠TIPE2基因的重组腺病毒。　

方法：利用RT-PCR的方法，从大鼠淋巴细胞中扩增出大鼠TIPE2基因，克隆到穿梭质粒pShuttle-clontech的表达框中，然后将包含TIPE2的完整表达框，进一步亚克隆到黑猩猩来源的腺病毒包装载体AdC68，转染HEK 293A细胞，包装出重组腺病毒。并以其感染HEK293A细胞，采用western blotting方法检测TIPE2基因的表达水平。　

结果与结论：PCR扩增、酶切鉴定和测序结果表明，所获取的cDNA为TIPE2的蛋白编码基因，western blotting结果表明，重组腺病毒能可高效表达TIPE2基因。说明成功完成AdC68-TIPE2重组腺病毒的构建，该腺病毒载体，能稳定表达大鼠TIPE2基因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 器官移植, 重组腺病毒Adc68, TIPE2基因, 基因表达, 转染, T细胞

Abstract:

BACKGROUND: Tumor necrosis factor-α-induced protein-8 like-2 (TIPE2), an anti-inflammatory protein, through the T cell receptor (TCR) and TOLL-like receptor signaling pathway, implements negative regulation of adaptive immunity and innate immunity, and thus effectively maintains the stable internal environment of the body.

OBJECTIVE: To construct a recombinant adenovirus that can overexpress rat TIPE2 gene.

METHODS: TIPE2 cDNA target gene was amplified from rat’s lymphocytes using RT-PCR, cloned into shuttle plasmid pShuttle-clontech, and then subcloned into artificial adenovirus vector AdC68. Hereafter, HEK 293 cells were transfected to generate a recombinant adenovirus. HEK293A cells were infected using this recombinant adenovirus, and then TIPE2 gene level was tested by western blot method.

RESULTS AND CONCLUSION: Based on results of PCR, digestion identification and sequencing, the obtained cDNA was the coding sequence region of TIPE2. Western blot findings showed that the recombinant adenovirus could overexpress TIPE2 gene. These findings indicate that the recombinant adenovirus is constructed successfully and can express TIPE2 gene stably.

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Key words: adenoviridae, gene expression, transfection

中图分类号:

R394.2

张有斌，余云生，沈振亚，周东明. 过表达大鼠TIPE2基因重组腺病毒载体的构建[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(11): 1743-1748.

Zhang You-bin, Yu Yun-sheng, Shen Zhen-ya, Zhou Dong-ming. Construction of a recombinant adenovirus overexpressing rat TIPE2 gene[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(11): 1743-1748.

图/表（结果） 4

2.1 目的基因TIPE2的扩增结果 以反转录合成的cDNA为模版，进行PCR扩增，以PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电脉后，在550 bp处可见一清晰条带，与预期目的片段 555 bp相符(图2A)。

2.2 穿梭质粒pShuttle-Clontech-TIPE2鉴定 挑选单克隆行菌液PCR并行凝胶电泳鉴定后可见，1，2，5，6，7，8号克隆样品可见清晰的阳性条带，与阳性对照条带位置相同(图2B)。抽提的质粒行酶切鉴定后，电泳结果显示1.9 kb与2.7 kb处可见2条明亮条带(图2C)。测序结果显示与NCBI Gene-Bank所公布的基因序列(TIPE2)的CDS区，即从起始密码子(ATG)至终止密码子(TGA)序列碱基完全相同(图2D)。

2.3 重组腺病毒包装载体AdC68-TIPE2的鉴定 目的基因片段TIPE2与人工合成的腺病毒载体AdC68组装并扩增，抽提质粒后同时行BglⅡ、XholⅠ、MunⅠ3种酶切鉴定，根据凝胶电泳与基因组序列比对结果显示，重组腺病毒的序列与预想结果一致(图3)。

2.4 重组腺病毒的包装与鉴定 构建成功的重组腺病毒包装质粒转染HEK293A细胞，于转染后第14天可在培养细胞中形成蚀斑(图4A)，进行大量扩增并纯化(图4B)后，提取病毒基因组行酶切鉴定，凝胶电泳显示条带与预想重组腺病毒基因组序列比对结果完全一致(图4C)。

2.5 重组腺病毒表达目的基因TIPE2结果 蛋白印迹Western blotting检测表达效率结果显示，在26 000处出现特异性条带，其中1×10¹¹VPs感染组亮度最高，随着感染病毒滴度的减少，条带亮度依次减低，且亮度均明显高于对照组(图5)，表明重组腺病毒构建成功；人工合成的重组腺病毒可高效表达TIPE2基因。

参考文献

[1] Zhang G, Zhang W, Lou Y,et al.TIPE2 deficiency accelerates neointima formation by downregulating smooth muscle cell differentiation. Cell Cycle.2013；12(3): 501-510.

[2] Laliberté B, Wilson AM, Nafisi H, et al.TNFAIP8: a new effector for Galpha(i) coupling to reduce cell death and induce cell transformation. J Cell Physiol, 2010. 225(3):865-874.

[3] Freundt EC, Bidere N, Lenardo MJ.A different TIPE of immune homeostasis. Cell, 2008. 133(3): 401-402.

[4] Lou Y, Liu S.The TIPE (TNFAIP8) family in inflammation, immunity, and cancer. Mol Immunol, 2011. 49(1-2):4-7.

[5] Zhang X, Wang J, Fan C, et al.Crystal structure of TIPE2 provides insights into immune homeostasis. Nat Struct Mol Biol, 2009. 16(1): 89-90.

[6] Capone S, D'Alise AM, Ammendola V, et al.Development of chimpanzee adenoviruses as vaccine vectors: challenges and successes emerging from clinical trials. Expert Rev Vaccines. 2013;12(4):379-393.

[7] Hoskote A, Carter C, Rees P, et al. Acute right ventricular failure after pediatric cardiac transplant: predictors and long-term outcome in current era of transplantation medicine. J Thorac Cardiovasc Surg. 2010;139(1):146-153

[8] 张仁福.心脏移植现状及进展[J].医学研究杂志,2008,37(7):4-6.

[9] 胡盛寿,王春生,董念国，等.心脏移植的多中心研究[J].中华器官移植杂志,2012,33(5):264-266.

[10] 肖长波,娄勇,张毅强，等.原位心脏移植3例的围术期治疗[J].中国实用医刊,2013,40(18):57-59.

[11] Sun H, Gong S, Carmody RJ, et al.TIPE2, a negative regulator of innate and adaptive immunity that maintains immune homeostasis. Cell.2008；133(3):415-426.

[12] 蒋丽娜,姚咏明.肿瘤坏死因子α诱导蛋白8家族的研究进展[J].中华损伤与修复杂志:电子版,2011,06(2)：268-278.

[13] 栾樱译,姚咏明,董宁,等.肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8样分子2对小鼠调节性T细胞免疫调节功能的影响[J].中华创伤杂志,2012, 28(4):316-321.

[14] 朱玉楠.免疫负调控因子TIPE2与核蛋白PCNP双向调节在白血病细胞中的生物学作用[D]. 开封:河南大学,2013.

[15] 栾樱译.TIPE2在CD4+CD25+调节性T细胞中的表达及其对免疫抑制功能的影响[D].广州:南方医科大学,2012.

[16] 宋立军.免疫负调控基因IL-37和TIPE2在SLE患者的表达及其意义[D].济南:山东大学,2012.

[17] Sun H, Zhuang G, Chai L, et al.TIPE2 controls innate immunity to RNA by targeting the phosphatidylinositol 3-kinase-Rac pathway. J Immunol.2012;189(6): 2768-2773.

[18] 石春燕,何琼,杨晶晶，等.TIPE2过表达质粒转染大鼠佐剂型关节炎滑膜成纤维样细胞及分析[J].中国免疫学杂志,2013,29(12)：1240-1243,1253.

[19] 章桂忠.Ⅰ.TIPE2负性调控VSMCs功能抗动脉粥样硬化的机制;Ⅱ.TIPE1蛋白在小鼠组织及TIPE1、TIPE2 mRNA在细胞系的表达谱检测[D]. 济南:山东大学,2012.

[20] 刘瑞敏,孙颖川|,张爱红,等.TIPE2在类风湿关节炎发病中的表达及其意义[J].中华微生物学和免疫学杂志,2013,33(3)： 212-215.

[21] 张虎.TIPE2在白血病细胞中的表达及其功能研究[D].开封:河南大学,2012.

[22] 朱江木.肌细胞感染后TIPE2与PCNP分子在JNK1通路中的作用[D].开封:河南大学,2012.

[23] 孙颖川.类风湿性关节炎中PCNP和TIPE2的表达及意义[D].开封:河南大学,2012.

[24] 徐凯,朱其明,冯建鹏.免疫抑制剂的研究进展[J].医学综述,2012, 18(14):2177-2180.

[25] 黄金沐，池惠琼，张忠阳．他克莫司的研究概况[J]. 海峡药学，2010,22(11):148-150．

[26] 郭斌,范明,陈伟高．FK506的临床研究与应用进展[J]．实用临床医学,2002,3(3):114-115.

[27] González-Vílchez F, Vázquez de Prada JA, Paniagua MJ, et al.Rejection after conversion to a proliferation signal inhibitor in chronic heart transplantation. Clin Transplant. 2013;27(6): E649-58.

[28] McCoy K, Tatsis N, Korioth-Schmitz B, et al.Effect of preexisting immunity to adenovirus human serotype 5 antigens on the immune responses of nonhuman primates to vaccine regimens based on human- or chimpanzee-derived adenovirus vectors. J Virol. 2007;81(12): 6594-6604.

[29] Zhou D, Wu TL, Emmer KL, et al.Hexon-modified recombinant E1-deleted adenovirus vectors as dual specificity vaccine carriers for influenza virus. Mol Ther. 2013;21(3): 696-706.

[30] Tatsis N, Lasaro MO, Lin SW, et al. Adenovirus vector-induced immune responses in nonhuman primates: responses to prime boost regimens. J Immunol. 2009; 182(10):6587-6599.

[31] Li H, Tuyishime S, Wu TL, et al. Adeno-associated virus vectors serotype 2 induce prolonged proliferation of capsid-specific CD8+ T cells in mice. Mol Ther. 2011;19(3): 536-546.

引言

TIPE2(Tumor necrosis factor-α-induced protein-8 like-2,TNFAIP8L2)是新近发现的一种新型的抗炎蛋白，通过对T细胞受体(TCR)和T细胞TOLL样受体信号途径实行负向调节，从而对适应性免疫和固有免疫起到负性调控作用，其选择性表达于炎症组织和淋巴组织，可以防止超敏反应的发生，有效地维持机体内环境的稳定，实现免疫平衡^[1]。

TIPE2 隶属于肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(TNFAIP8)家族，TIPE2在人体的各个组织系统中均有表达^[2]。在TIPE2敲除的T细胞的培养过程中，THI细胞的细胞因子γ-干扰素，TH2细胞的细胞因子白细胞介素4均明显升高。其他细胞因子CD25，CD44，CD69也明显增加。相比对照组，TIPE2-/-大鼠的CD4⁺和CD8⁺T细胞的免疫反应明显增强，在外来抗原的刺激下，能产生更多的白细胞介素6，白细胞介素1^{[3。TIPE2通过CASPASE-8调控TCR和TLR信号，在固有免疫和适应性免疫反应中发挥重要的负性调节作用^[4-5]。]}

腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100%的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体，在细胞培养物中重组病毒滴度可达10¹⁴L^-¹进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。因而，腺病毒载体在基因治疗临床试验方面有了越来越多的应用，成为继反转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体^[⁶^]。

心脏移植是治疗终末期心脏疾病的最有效方法，主要是针对晚期充血性心力衰竭和致死性冠脉疾病进行移植手术，作为挽救终末期心脏病患者生命和改善其生活质量的一个治疗手段^[7]。自1967年12月南非开普敦的Barnard医生成功地进行了世界上首例人的原位心脏移植以来，心脏移植从试验探索阶段逐步过渡到临床应用阶段^[8]。术后生存率逐年提高，据2012年国际心肺移植学会年报报道，心脏移植术后1，3，5和7年的平均存活率分别为84.5%，78.2%，72.5%和66.2%；中国最大的心脏病治疗中心阜外医院公布的数据显示，心脏移植术后1，3，5和7年的存活率分别是95.0%，91.2%，88.2%和79.9%^[9]。

虽然心脏移植技术已趋于成熟，但排斥和感染仍然是接受心脏移植的患者术后早期最主要的致死原因^[10]。如何防治术后严重的急性排斥反应而不损伤全身免疫功能仍是一大难题。

实验采用抗炎、抗凋亡基因TIPE2转染大鼠同种异体腹腔异位心脏移植模型(Ono模型)诱导心脏移植免疫耐受，预想通过重组腺病毒系统可在Ono模型受体中过表达TIPE2基因，上调CD4⁺CD25⁺调节性细胞的活化增殖，抑制受体对于供心的排斥反应，从而延长移植心脏的存活时间，在有或无半量免疫抑制剂的辅助下，使受体对于供心产生免疫耐受，达到移植物长期存活，为免疫耐受的研究开辟新的研究思路。本部分实验以人工合成的腺病毒载体AdC68为载体，构建重组腺病毒AdC68-TIPE2，并使其在人胚肾293A细胞中过表达。

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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2012年7月至2013年4月在中国科学院上海巴斯德研究所完成。

材料：SD大鼠由上海斯莱特动物中心提供。

实验方法：

目的基因的获取：取SD大鼠外周血，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，提取总RNA，使用ABi反转录试剂盒反转录合成cDNA。根据NCBI Gene-Bank所公布的TIPE2的基因序列(编号NM_001014039.1)的蛋白质编码(CDS)区(碱基序列为第359-913，共555个碱基)，设计两条带酶切位点的引物NotⅠ和KpnⅠ，正义序列：酶切位点保护碱基(AG)，酶切位点(NotⅠ)，TIPE2 NotⅠ-Forward) 5’ taa gcg gcc gcA TGG AGT CCT TCA GCT CAA AGA GTC 3’；反义序列：酶切位点保护碱基(TG)，酶切位点(KpnⅠ) ，(TIPE2 KpnⅠ-Reverse) 5’ tat ggt acc TCA GAG CTT CCC CTC GTC TAG AA 3’。PCR扩增目的基因片段：以反转录合成的cDNA为模版，使用Prime-Star试剂盒扩增目的基因，并在1%琼脂糖凝胶电脉中分离纯化后割胶回收目的基因片段。

穿梭质粒pShuttle-Clontech-TIPE2的构建：将回收的目的基因片段和穿梭质粒pShuttle-Clontech同时用DNA裂解酶NotⅠ和KpnⅠ行双酶切后，使用T₄连接酶将目的基因组装至穿梭质粒中，并转化至感受态大肠杆菌DH5α进行扩增后，挑选阳性单克隆摇菌，菌液PCR进行初步筛选，抽提质粒行酶切鉴定，并将克隆质粒(图1A)送铂尚公司测序。

腺病毒包装载体的构建：将组装成功并鉴定正确的pShuttle-clontech-TIPE2质粒使用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ行双酶切，1%琼脂糖凝胶电脉中分离纯化后割胶回收含有目的基因的片段，使用T₄连接酶连接至人工合成的腺病毒载体AdC68中(图1B)，并转化至感受态大肠杆菌STBL2中进行扩增，挑选阳性单克隆，摇菌，抽提质粒，并使用BglⅡ、XholⅠ、MunⅠ行酶切鉴定。

腺病毒的包装、纯化与鉴定：构建成功的重组腺病毒包装质粒经PacⅠ酶切线性化后，使用Lipofectamine 2000转染试剂盒转染HEK 293细胞，转染至HEK293A细胞进行包装，待出现病毒蚀斑后进行大量扩增并纯化，并提取病毒基因组行酶切鉴定，纯化后的重组腺病毒中加入含10%甘油的PBS中保存于-80 ℃低温冰箱。

重组腺病毒TIPE2基因表达效率的检测：分别将滴度为1×10¹¹VPs，1×10¹⁰VPs、1×10⁹VPs、1×10⁸VPs的重组腺病毒感染等量(大致给出细胞的数目)的HEK293A细胞，并使用1×10¹¹VPs非相关基因的重组腺病毒感染等量293A细胞作为对照组，24 h后收集细胞样品，行蛋白印迹Western blotting检测其表达效率。

主要观察指标：①目的基因TIPE2的扩增结果。②穿梭质粒pShuttle-Clontech-TIPE2鉴定。③重组腺病毒包装载体AdC68-TIPE2的鉴定。④重组腺病毒的包装与鉴定。⑤重组腺病毒表达目的基因TIPE2。

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讨论

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)α诱导蛋白8 (TNFAIP8)是调控凋亡过程的重要分子之一。随着研究深入近来发现，TNFAIP8蛋白在细胞凋亡，信号传递，肿瘤细胞增生、侵袭和转移等生命过程中均具有重要的调节作用^[¹¹^]。TIPE2 (Tumor necrosis factor-α-induced protein-8 like-2，TNFAIP8L2)是于2008年发现的一种新型的抗炎蛋白，隶属于肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(TNFAIP8)家族，通过对T细胞受体(TCR)和T细胞TOLL样受体信号途径实行负向调节，从而对适应性免疫和固有免疫起到负性调控作用，其选择性表达于炎症组织和淋巴组织，可以防止超敏反应的发生，有效地维持机体内环境的稳定，实现免疫耐受^[12-17]。研究发现TIPE2+/+表达质粒明显提升大鼠佐剂型关节炎成纤维样滑膜细胞的TIPE2蛋白表达水平，TIPE2对DR5介导细胞凋亡有重要作用^[18]。TIPE2对单核/巨噬细胞及血管平滑肌细胞功能的负调控作用^[19]。TIPE2参与了类风湿关节炎的发病过程，TIPE2可能是评价类风湿关节炎患者病情严重程度的标志物^[20]。TIPE2基因在白血病患者PBMC中高表达，TIPE2基因的沉默对PCNP和JNK等蛋白的表达有显著影响^[21-23]。

20世纪70年代，免疫抑制剂作为一类可以抑制机体异常免疫反应的药物，广泛应用于防止器官移植后的排斥反应及治疗自身免疫性疾病^[24]。免疫抑制剂通过影响免疫病理反应和免疫应答从而发挥其抑制机体免疫功能的作用，它能抑制如T细胞与B细胞等与免疫反应相关巨噬细胞的增殖与功能，降低抗原抗体反应。临床上常用的免疫抑制剂主要有5类：①细胞因子抑制剂，如环孢素A，西罗莫司等。②DNA合成抑制剂，如硫唑嘌呤，酶酚酸酯等。③单克隆抗体类。④中草药的免疫抑制有效成分。⑤其他免疫抑制剂，如环磷酰胺，芬戈莫德等。

　　1984年，他克莫司的出现是器官移植的又一重要进展。它是从土壤放线菌的发酵产物中分离出来的，是一种具有强大免疫抑制作用的细胞因子抑制剂^[25]。他克莫司与环孢素A同属细胞因子抑制剂，免疫抑制特性相似，但其结构与环孢素A完全不同，作用效果也较环孢素A强10-100倍，并且具有更强的选择性免疫抑制作用。但它同时也可引起高血压、高血糖、白细胞增多、肾功能损伤等并发症，研究开发出安全，有效、低毒的新型免疫抑制剂仍面临严峻的挑战^[26]。

近年来，器官移植排斥反应的转基因治疗研究进展迅速，有望控制移植器官局部免疫反应，而基本保留受体全身免疫反应功能，这也是心脏移植免疫耐受的重要研究方向^[²⁷^]。

腺病毒载体具有可高效地传递和表达基因的能力，已被广泛应用于疫苗的开发，癌症的基因治疗等，但由于人体内广泛存在的预存抗体限制了人腺病毒载体的实际应用和发展。而作者选用的新型腺病毒载体为黑猩猩来源的腺病毒载体，可有效克服这一缺陷，使其携带的外源基因能在体内长期稳定表达^[^28-31^]。

实验拟采用将外源性TIPE2基因通过腺病毒载体转入心脏移植模型(ono模型)大鼠的方法，来研究体内TIPE2表达水平的升高能否减少T细胞的激活和增殖，能否上调调节性T细胞的活化增殖，从而延长移植心脏的存活时间，甚至达到免疫耐受状态，初步揭示TIPE2这一新型基因的表达与小动物心脏移植免疫状态的关系，从而可能为同种异体心脏移植免疫耐受的研究开拓新的前景。

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