胆囊收缩素促坐骨神经再生的可能机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期实验发现，八肽胆囊收缩素能促进大鼠坐骨神经损伤后的再生，但具体机制仍不清楚。

目的：筛选有效指标，尝试从神经生长因子及神经再生微环境的角度分析八肽胆囊收缩素促进大鼠坐骨神经再生的机制。

方法：选择健康SD大鼠，制备坐骨神经单侧离断伤模型后随机分为2组，八肽胆囊收缩素治疗组造模后连续7 d腹腔注射八肽胆囊收缩素8 nmol/kg，对照组腹腔注射等量生理盐水。检测两组大鼠局部神经生长因子蛋白表达、脊髓诱导型一氧化氮合酶水平、血清超氧化物歧化酶活性和丙二醛浓度，同时检测脊髓凋亡细胞数。

结果与结论：八肽胆囊收缩素治疗组大鼠局部神经生长因子蛋白表达高于对照组(P < 0.01)，脊髓诱导型一氧化氮合酶和凋亡细胞数低于对照组(P < 0.01)，血清超氧化物歧化酶活性高于对照组且丙二醛浓度低于对照组(P < 0.01，0.05)。说明胆囊收缩素促进坐骨神经再生的可能机制包括保护神经元、抗细胞凋亡、抑制炎性反应、抗NO及氧化反应、抗丙二醛减轻自由基损伤等方面外，还可刺激神经生长因子的表达和释放。

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关键词: 组织构建, 组织工程, 坐骨神经损伤, 神经再生, 胆囊收缩素, 神经生长因子, 诱导型一氧化氮合酶, 超氧化物歧化酶, 丙二醛, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that cholecystokinin octapeptide (CCK-8) can promote the regeneration after sciatic nerve injury in rats, but the exact mechanism remains unclear.

OBJECTIVE: To screen effective indicators and analyze the mechanism of CCK-8 promoting sciatic nerve regeneration from the perspective of nerve growth factor and nerve regeneration microenvironment.

METHODS: Healthy Sprague-Dawley rats, for the preparation of unilateral sciatic nerve transection injury model, were randomly divided into two groups. In the CCK-8 group, the animal model received intraperitoneal injection of CCK-8 (8 nmol/kg) for consecutive 7 days, while the control group was injected with equal volume of normal saline. The nerve growth factor expression, inducible nitric oxide synthase in the spinal cord, serum superoxide dismutase activity and malondialdehyde concentration, as well as apoptotic cells in spinal cord were all detected.

RESULTS AND CONCLUSION: In the CCK-8 group, nerve growth factor expression was higher than that in the control group (P < 0.01), while inducible nitric oxide synthase and the number of apoptotic cells were lower (P < 0.01), serum superoxide dismutase activity was higher but malondialdehyde concentrations was lower (P < 0.01, 0.05). The mechanisms of CCK-8 promoting sciatic nerve regeneration include protecting neurons, anti-apoptosis, inhibiting inflammatory response, anti-NO and anti-oxidation, reducing malondialdehyde, and alleviating free radical damage, as well as stimulating nerve growth factor expression and release.

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Key words: sciatic nerve, cholecystokinin, apoptosis, nerve growth factor

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 纳入96只实验大鼠均进入结果分析。

2.2 局部神经生长因子蛋白的表达 免疫组化实验神经生长因子蛋白阳性信号呈棕黄色，细胞结构呈蓝色。结果发现八肽胆囊收缩素治疗组损伤侧远端坐骨神经组织神经生长因子蛋白表达阳性呈棕黄色着色(图1A1)，在对照组损伤侧远端坐骨神经组织神经生长因子蛋白少许表达，着色淡(图1A2)。

从神经生长因子的表达面积和密度看，八肽胆囊收缩素治疗组神经生长因子蛋白表达优于对照组(表1)，差异有显著性意义(P < 0.01，图2)。说明坐骨神经损伤后，应用八肽胆囊收缩素可促进局部神经生长因子的分泌、表达。

2.3 脊髓诱导型一氧化氮合酶的表达 免疫组化检测结果以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，八肽胆囊收缩素治疗组诱导型一氧化氮合酶表达(图1B1)较对照组少(图1B2)，两组对比差异有非常显著性意义(P < 0.01，表1，图3)。说明坐骨神经损伤后应用八肽胆囊收缩素能减少诱导型一氧化氮合酶表达，进而促进神经再生。

2.4 血清超氧化物歧化酶及丙二醛浓度测定结果 两组对比差异有显著性意义(P < 0.05，0.01)，与对照组比，八肽胆囊收缩素治疗组血清超氧化物歧化酶活性高，血清丙二醛浓度低(表1，图4)。说明坐骨神经损伤后应用八肽胆囊收缩素能提升体内超氧化物歧化酶活力，降低有害物质丙二醛的浓度，进而提高了机体清除氧自由基的能力，改善氧化应激状态。

2.5 脊髓细胞凋亡指数比较 TUNEL法细胞核染色呈棕黄色者为阳性细胞，即凋亡细胞，两组脊髓细胞凋亡指数比较差异有非常显著性意义(P < 0.01，表1，图5)。八肽胆囊收缩素治疗组神经细胞凋亡(图1C1)较对照组少(图1C2)。说明坐骨神经损伤后应用八肽胆囊收缩素能减少脊髓细胞凋亡。

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引言

胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)是1928年Ivy等发现的一种可刺激狗胆囊收缩的小肠提取物，40多年后才证实其化学本质是氨基酸多肽^[1]。最初发现的CCK33是由33个氨基酸残基组成的，其相对分子质量为3 198，后来陆续发现了CCK58、CCK39、CCK12、CCK8、CCK4等，其中CCK58、CCK8是人体内胆囊收缩素主要的分子形式，而八肽胆囊收缩素(CCK8)则是具有胆囊收缩素所有生理功能的最小分子形式^[2]，对于胆囊收缩素的实验都是用八肽胆囊收缩素为代表进行的。

以往胆囊收缩素大多被作为一种胃肠道主要调节激素来研究的^[3]，但随着研究的深入，其在神经系统中的作用越来越引起人们的重视。目前关于胆囊收缩素的神经保护研究多集中在中枢神经系统领域或体外神经细胞方面^[4-6]。胆囊收缩素在脑内含量丰富，分布较为广泛，在调节疼痛、神经内分泌，提高认知、空间、学习记忆等方面发挥重要作用^[7-8]。

杨蓬勃等^[4]为了探讨胆囊收缩素参与学习记忆的机制，以海人酸毁损双侧Meynert核建立大鼠学习记忆障碍模型，用避暗回避实验进行行为学检测，免疫组织化学染色观察Meynert核毁损后大鼠海马结构内胆囊收缩素阳性神经元的变化，结果Meynert核损毁大鼠海马结构内胆囊收缩素阳性神经元显著减少，证实胆囊收缩素参与了Meynert核毁损后大鼠学习记忆的下降。李娟等^[6]发现八肽胆囊收缩素能促进体外培养的新生小鼠大脑皮质神经元的生长，延长其存活时间。另有学者证实胆囊收缩素能诱导活体内神经生长因子(nerve growth factor，NGF)蛋白及mRNA的合成，是参与神经保护及修复的重要物质^[9-11]。以上研究均说明胆囊收缩素是一种内源性的神经保护因子，这种观点已被学术界认可。

由于神经再生缓慢，所以促进周围神经损伤后的再生是临床研究重点，也是难点，关于胆囊收缩素在周围神经损伤中应用的相关研究也已经开展。刘丽丽等^[12]发现八肽胆囊收缩素对硝普钠所致大鼠周围神经元NO损伤有保护作用，其作用机制可能与上调神经生长因子及生长相关蛋白43表达有关。作者前期也进行了一系列研究，建立了坐骨神经损伤大鼠模型，通过大体观察、坐骨神经功能指数恢复率、神经电生理检测、组织学光镜观察、再生有髓神经纤维计数恢复率及腓肠肌湿质量恢复率等多种指标的测定，证实了胆囊收缩素有神经保护、促周围神经损伤后的修复与再生等作用^[13-15]。而神经再生和一系列神经生长因子及神经再生微环境关系密切^[16-19]，例如：周围神经损伤后局部微环境中来源于许旺细胞和体液中的神经生长因子浓度过低，远不足以维持神经元胞体的存活；切断坐骨神经使诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOs)活性增强，进一步催化合成过量的NO，导致神经细胞死亡和功能缺失；神经损伤后，机体组织产生的氧自由基形成脂质过氧化物丙二醛，对神经、肌肉的结构、功能和代谢造成损伤……，作者这次实验尝试从这方面入手，进一步探讨胆囊收缩素促坐骨神经再生的可能机制。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年9月在福建省莆田学院骨科研究所实验室完成。

材料：

实验动物：选择健康SD大鼠96只，鼠龄8-10周龄，体质量150-165 g，雌雄不拘，清洁级。SD大鼠由中科院上海实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(沪)2002-001。

实验过程中对动物处置符合2006年科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。

方法：

动物模型制备：实验采用坐骨神经单侧离断伤的模型，包括神经纤维、神经束膜及神经外膜的完全损伤，相当于SanderlandⅤ度损伤。

具体操作方法：大鼠麻醉应用100 mg/kg盐酸氯胺酮注射液腹腔注射，麻醉成功后，常规消毒，从大鼠的右侧股后部切口进入，分离肌层，游离坐骨神经，在梨状肌下缘0.5 cm处离断坐骨神经。将大鼠右侧坐骨神经离断后，以表面血管走行为标志，用11-0无创伤尼龙线缝合神经外膜4针，逐层关闭切口。该模型简单，直观，效果确切，所致伤情稳定，重复性好，能满足实验要求。

分组干预：SD大鼠96只建立坐骨神经离断伤模型后随机分为2组，八肽胆囊收缩素治疗组(n=48)造模后腹腔注射八肽胆囊收缩素8 nmol/kg，1次/d，连续7 d；对照组(n=48)造模后腹腔注射等量生理盐水，1次/d，连续7 d。每组48只大鼠中12只用于检测局部神经生长因子蛋白表达、12只用于检测脊髓诱导型一氧化氮合酶水平、12只用于检测血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性和丙二醛浓度，剩余12只于检测脊髓凋亡细胞数。每组均以右侧为损伤侧，左侧为正常对照。

局部神经生长因子蛋白表达的免疫组化检测：八肽胆囊收缩素治疗1周时，两组各随机取12只大鼠麻醉后处死，取损伤侧远端坐骨神经组织6 mm，用40 g/L的多聚甲醛溶液固定，常规石蜡切片，厚度为4 μm。每个实验动物取切片6张，每组12只动物共取切片72张，按照兔抗大鼠神经生长因子抗体说明书中提示的免疫组化法检测神经生长因子蛋白，图像分析仪计算机自动计数，在图像分析仪下，观察各组标本，在每一例标本中选10个高表达的视野，摄取图像，观察神经生长因子的表达面积和密度 (Image pro plus软件)，并对其进行分析。

脊髓诱导型一氧化氮合酶的免疫组化检测：八肽胆囊收缩素开始治疗后10 d，两组分别取12只大鼠麻醉处死，插管灌注，相应脊髓节段取材、固定过夜、包埋切片，用兔抗大鼠诱导型一氧化氮合酶多克隆抗体疫组织化学EnVision法检测诱导型一氧化氮合酶表达变化。

血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛浓度测定：八肽胆囊收缩素开始治疗后10 d，两组分别取12只大鼠，空腹采取尾静脉血3 mL，迅速离心，4 000 r/min离心10 min，用移液器抽取上清液，按试剂盒说明书操作测定血清超氧化物歧化酶和丙二醛浓度，超氧化物歧化酶值用NU(亚硝酸盐单位)为单位表示，丙二醛值用nmol/L为单位表示。

脊髓凋亡细胞数的检测：八肽胆囊收缩素开始治疗后14 d，两组分别取12只大鼠麻醉处死，取相应脊髓节段，TUNEL法检测细胞凋亡。

按凋亡检测试剂盒使用说明对切片进行染色，高倍镜(×400)下观察，每张切片随机选取5个高倍视野，计算出平均阳性细胞百分数，计算公式：凋亡指数=凋亡细胞核数/总细胞核数。

主要观察指标：八肽胆囊收缩素治疗组及对照组大鼠损伤侧远端坐骨神经局部神经生长因子蛋白表达；脊髓诱导型一氧化氮合酶活性变化及脊髓凋亡细胞数；血清超氧化物歧化酶活性及丙二醛浓度。

统计学分析：统计分析采用SPSS 21.0统计软件完成。计量资料采用x(_)±s描述，两组间的比较采用t 检验，以P < 0.05表示为差异有显著性意义。

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讨论

周围神经损伤后能否成功再生，主要取决于是否具有适合离断神经生长再连接的微环境条件和未凋亡的中枢神经元数目及活力^[20-22]。而神经生长因子是构成良好微环境的重要因素，在神经损伤后具有保护神经元、促进轴突再生的作用^[23-24]。坐骨神经损伤后，许旺细胞分泌神经生长因子^[25-27]，其在微环境中含量高低直接影响到受损神经的修复效果。

定位于第17对常染色体上的Ⅱ型一氧化氮合酶称为诱导型一氧化氮合酶，是一种同工酶，分别存在于内皮细胞、巨噬细胞、神经吞噬细胞及神经细胞中^[28-29]。诱导型一氧化氮合酶只在细胞受到刺激被激活后才表达，其生产NO能持续相对较长时间(几小时到几天)^[30-31]。诱导型一氧化氮合酶以存在于白细胞等炎症细胞的细胞质中为代表(也发现于脑、胰、视网膜、肝、肺、心脏或肾脏等许多器官组织)，与炎症、肿瘤、退行性变等许多疾病有关^[32-34]。近年发现诱导型一氧化氮合酶是损伤修复和炎症反应过程中催化产生NO最主要的一种一氧化氮合酶，参与神经再生和突触可塑性等病理生理过程^[35-37]，诱导型一氧化氮合酶表达的表达增高将影响、减慢神经的再生^[38-40]。

文献报道血清中超氧化物歧化酶，丙二醛水平变化都是与外周神经损伤有关^[41-43]。丙二醛为脂质过氧化物的最终产物，其水平的高低可反映出组织中脂质过氧化物反应的程度。超氧化物歧化酶是机体细胞内重要内生性的自由基清除酶，是机体免受氧自由基损害的主要防御酶,催化超氧自由基转化为氧和过氧化氢。超氧化物歧化酶活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而丙二醛的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。测定丙二醛水平、总超氧化物歧化酶活性反映了机体脂质过氧化的程度以及机体清除自由基的能力。这种氧化应激状态，决定着周围神经的结构和功能损伤严重程度。

本实验筛选有效指标，检测到坐骨神经损伤后，应用胆囊收缩素可减少神经元细胞凋亡，减少诱导型一氧化氮合酶生成，促进局部神经生长因子分泌、表达，提升体内超氧化物歧化酶活力，降低体内有害物质丙二醛水平，从而较确切达到保护神经、促神经修复和再生。既往关于胆囊收缩素的研究多集中在中枢神经系统(脑、脊髓)的基础医学领域或体外神经细胞方面。本实验基于临床应用的思路，把胆囊收缩素用于坐骨神经损伤方面的研究，研究胆囊收缩素能够促进周围神经系统损伤后修复与再生的机制，有助于开发治疗周围神经损伤的高效新型药物，有实际的临床意义。

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