胎盘间充质干细胞传代后的增殖能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.018

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (10): 1591-1596.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.018

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

胎盘间充质干细胞传代后的增殖能力

白金萍¹，李秀英²，李雪³，杨麒巍²，刘颖男²，王轶敏^2，4

¹吉林大学基础医学院病理学教研室，吉林省长春市 130021；²吉林大学中日联谊医院中心实验室，吉林省长春市 130033；³延边大学药理教研室，吉林省延边市 133002；⁴吉林省中科生物工程有限公司，吉林省长春市 130012

出版日期:2014-03-05 发布日期:2014-03-05
通讯作者: 王轶敏，博士，唐敖庆特聘教授，博士生导师，吉林大学中日联谊医院中心实验室，吉林省长春市 130033；吉林省中科生物工程有限公司，吉林省长春市 130012
作者简介:白金萍，女，1984年生，吉林省长春市人，汉族，吉林大学在读硕士，主要从事干细胞研究。

Proliferative abilities of placenta-derived mesenchymal stem cells at different passages

Bai Jin-ping¹, Li Xiu-ying², Li Xue³, Yang Qi-wei², Liu Ying-nan², Wang Yi-min^{2, 4}

¹Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China;² Central Laboratory, China-Japan Union Hospital, Jilin University, Changchun 130033, Jilin Province, China; ³Department of Pharmacology, Yanbian University, Yanbian 133002, Jilin Province, China; ⁴Jilin Zhongke Bio-engineering Co., Ltd., Changchun 130012, Jilin Province, China

Online:2014-03-05 Published:2014-03-05
Contact: Wang Yi-min, M.D., Doctoral supervisor, Central Laboratory, China-Japan Union Hospital, Jilin University, Changchun 130033, Jilin Province, China; Jilin Zhongke Bio-engineering Co., Ltd., Changchun 130012, Jilin Province, China
About author:Bai Jin-ping, Studying for master’s degree, Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：胎盘间充质干细胞的增殖能力比骨髓间充质干细胞增殖能力强，但是否每个代次胎盘间充质干细胞的增殖能力都相同尚无定论。
目的：分析不同代次胎盘间充质干细胞的增殖能力。
方法：采用酶消化法分离人胎盘间充质干细胞，并利用流式细胞仪检测干细胞表面标志物，并进行成脂成骨诱导分化。采用细胞计数和BrdU方法检测细胞的增殖能力，根据倍增时间公式计算倍增时间，并进行长期传代。
结果与结论：胎盘间充质干细胞阳性表达CD44、CD90和CD105，阴性表达CD14、CD34和CD45；成脂诱导21 d后油红O染色镜下可见红色脂肪滴，成骨诱导35 d茜素红染色镜下可见钙盐结节。细胞从第1代开始计数，直到第15代共获得3.5×10¹¹个细胞。P5代比P10和P15代胎盘间充质干细胞的增殖能力强，倍增时间短。长期传代，胎盘间充质干细胞传代到第25代时，其中3例标本细胞形态完全发生改变，呈铺路石样；另外2例标本几乎无贴壁细胞。提示胎盘间充质干细胞可以长期传代到第25代，不同代次的胎盘间充质干细胞增殖能力不同，P5代增殖能力明显高于P10和P15代，临床应用应以P5代之前为宜。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 间充质干细胞, 胎盘间充质干细胞, 胎盘, 增殖能力

Abstract:

BACKGROUND: The mesenchymal stem cells which are from the placenta have better proliferative potential than the bone marrow mesenchymal stem cells. It is inconclusive, however, whether placenta-derived mesenchymal stem cells at different passages have the same proliferative ability.
OBJECTIVE: To analyze the proliferative ability of placenta-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Placenta-derived human mesenchymal stem cells were isolated with enzyme digestion, and flow cytometry was used to detect the cell surface markers. After osteogenic and adipogenic induction, cell proliferation detection was carried out using cell counting and BrdU analysis. Cell doubling time was calculated based on formula. The maximum cell passage was determined by long term cell culture until the cell died or differentiated.
RESULTS AND CONCLUSION: CD44, CD90 and CD105 were highly expressed in placenta-derived mesenchymal stem cells, while CD14, CD34 and CD45 were negatively expressed. After 21 days of adipogenic induction, oil red O staining showed red fat droplets; after 35 days of osteogenic induction, alizarin red staining showed calcium nodules. Cell counting started from passage 1 to 25, and cell number reached to 3.5×10¹¹ at passage 15. Cell proliferation at passage 5 was stronger with shorter doubling time than that at passages 10 and 15. When cells reached to passage 25, three specimens completely altered their cell morphology with cobblestone structure, and another two specimens lost adherent features. These findings indicate that
placenta-derived mesenchymal stem cells can be long-term subcultured upon to passage 25. Different proliferation capacities are found in different passages of placenta-derived mesenchymal stem cells. The proliferation ability of passage 5 placenta-derived mesenchymal stem cells is stronger than that of passage 10 and 15 cells. Placenta-derived mesenchymal stem cells at passages 0-5 are the important source for stem cell therapy and tissue engineering.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, placenta, cell proliferation

中图分类号:

R394.2

白金萍，李秀英，李雪，杨麒巍，刘颖男，王轶敏. 胎盘间充质干细胞传代后的增殖能力[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1591-1596.

Bai Jin-ping, Li Xiu-ying, Li Xue, Yang Qi-wei, Liu Ying-nan, Wang Yi-min. Proliferative abilities of placenta-derived mesenchymal stem cells at different passages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(10): 1591-1596.

图/表（结果） 4

2.1 胎盘间充质干细胞形态观察结果 胎盘间充质干细胞为贴壁细胞，细胞贴壁后形态均一，呈长梭形，平行或漩涡状生长，培养3 d后细胞融合度达70%-80%，传代后细胞生长迅速(图1A)，第25代胎盘间充质干细胞镜下形态见图1B。

2.2 间充质干细胞表面标志物的表达 通过流式细胞仪检测，阳性表达CD44、CD105和CD90，不表达CD14、CD34和CD45。表明培养的细胞具备干细胞的表面标志物，分离得到的细胞为胎盘间充质干细胞(图2)。

2.3 成脂成骨细胞分化 胎盘间充质干细胞在加入成脂诱导液后，第4天开始出现卵圆形透亮的小脂滴，随着时间的推移，脂滴逐渐变成大的脂肪滴，诱导21 d后固定，加入油红O染色，在显微镜下可观看到红色脂肪滴。在加入成骨诱导液后，诱导第8天，开始出现小的结节，钙结节逐渐增多，在第35天用茜素红染色，显微镜下可观察到钙盐沉积形成的结节(图3)。

2.4 细胞计数 细胞从第1代开始计数，直到第15代共获得3.5×10¹¹个细胞，根据公式绘制成细胞的生长曲线(图4A)，并通过计数结果计算出P5代细胞的倍增时间是 38.9 h，P10代细胞的倍增时间是48.9 h， P15代细胞的培增时间为69 h。不同代次胎盘间充质干细胞的增殖能力是不同的。

2.5 BrdU检测增殖 使用BrdU掺入到DNA合成期，检测P5、P10和P15代细胞的增殖能力，结果显示P5代细胞与P10和P15代的细胞相比较，其增殖能力较高(P < 0.01， P < 0.001)，P10代细胞的增殖能力也高于P15代(P < 0.05，图4B)。

2.6 细胞传代能力 5例标本均进行长期培养传代(图4C)，其中2例标本传代到P25代，贴壁细胞减少，继续培养72 h后几乎无贴壁细胞。其余3例标本，分别在P25、P25 和P27代出现细胞形态改变，呈铺路石样、贴壁不牢、易消化，但是增殖速度快，1∶3传代培养48 h后，融合度达80%-90%(图1B)。

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引言

在近些年中，间充质干细胞被人们广泛认可，科研学者们无论在临床还是在基础研究中都有涉及干细胞的研究领域。间充质干细胞治疗已经成为一种新的治疗手段被广泛应用于临床^[1-2] 。间充质干细胞是一种多能干细胞，起源于中胚层，具有自我更新和多向分化的潜能，能分化为中胚层多种组织细胞，如脂肪、肌肉、内皮、血管平滑肌、骨和软骨及其他胚层的组织细胞^[3-4] 。间充质干细胞易于在组织中寻找和分离，并且具有优于其他组织细胞较强的增殖能力和低免疫原性及免疫反应抑制能力^[5-7] ，由于具有以上特点，间充质干细胞可以用于异体的组织损伤修复，是组织工程和细胞治疗的理想种子细胞^[8-13] 。
骨髓间充质干细胞已被临床应用于心血管系统、中枢神经系统及免疫系统等疾病的治疗和修复，在癌症和遗传性疾病研究中也有涉及^[14-21] 。然而，骨髓间充质干细胞随着年龄增长其数量降低，而且捐献者数量有限，并且采用侵入操作进行取材，增加患者的痛苦和感染的概率^[22-24] ，所以寻找新的间充质干细胞来代替骨髓间充质干细胞是迫切需要的。
间充质干细胞来源丰富，可来自脂肪、皮肤、周围血液、牙髓、脐带和胎盘^[25-27] 。脂肪、皮肤、周围血液、牙齿来源的间充质干细胞均需要侵入性操作才可以获得，而脐带来源的间充质干细胞体积小，数量有限。胎盘间充质干细胞取材方便，足月的胎盘是胎儿娩出后的废弃物，容易获得并且体积大获得的数量多，科研成本低廉，不涉及社会、伦理等问题^[28-30] ，而且胎盘间充质干细胞有类似于骨髓间充质干细胞的功能和特性，并且具有优于骨髓间充质干细胞的增殖能力，能够大量扩增间充质干细胞的数量。所以，胎盘间充质干细胞比骨髓间充质干细胞更加方便和适用于临床治疗，当组织大面积损伤，需要应用干细胞治疗时，干细胞的数量来源成为至关重要的问题，所以在选择干细胞种类的同时还要对所选择的干细胞增殖能力有所了解。
胎盘间充质干细胞的增殖能力比骨髓间充质干细胞增殖能力强，但是不是每个代次胎盘间充质干细胞的增殖能力都是相同的，目前还没有准确的定论。所以本实验主要对胎盘间充质干细胞的增殖能力进行研究分析，对不同代次进行比较，充分了解胎盘间充质干细胞的增殖能力，选择出增殖能力最强、最能为干细胞治疗提供优质数量来源的干细胞代次，为临床更好的选择胎盘间充质干细胞进行治疗提供了理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2012年3月至2013年5月在吉林大学中日联谊医院完成。

材料：实验所用胎盘来自吉林省中科生物技术公司，5例健康的志愿捐献者，无任何传染病及妊娠并发症史。捐献者年龄范围23-38岁，经产妇同意后，均签署知情同意书，在无菌条件下取新鲜胎盘组织。

实验方法：

胎盘间充质干细胞的分离和培养：在无菌条件下，取一小块胎盘组织，用PBS反复冲洗，剪碎，然后用胶原酶消化。用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基，置于37 ℃、体积分数 5% CO₂的培养箱中培养，3 d后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每三四天换液1次，在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，当达到80%-90%融合时，用胰酶消化，传代培养。

间充质干细胞表面标志物的检测：取第4代的胎盘间充质干细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液。分别加入抗人CD44、CD105、CD90、CD14、CD34和CD45的单克隆抗体，4 ℃孵育30 min，用PBS洗2次后用流式细胞仪检测。

成脂成骨诱导分化：细胞以1×10⁴/cm²的密度接种到12孔培养板中，并置于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中培养，当细胞达到60%-80%融合时分别加入成脂诱导液和成骨诱导液。每三四天换1次液。成脂诱导21 d，用PBS冲洗后，加入体积分数4%的甲醛溶液固定细胞30 min，然后再用PBS洗2次，加入油红O染色。成骨诱导35 d，去除培养基，用PBS冲洗1次，加入体积分数4%的甲醛溶液固定细胞30 min，用蒸馏水冲洗2次后，加入2%茜素红S溶液(茜素S GENMED染色试剂盒)染色，再用蒸馏水冲洗2次，然后在光学显微镜下观察拍照。

细胞计数：细胞从P1代开始计数。用胰蛋白酶消化细胞，计数活细胞数，以1×10⁵个细胞/孔的密度接种在6孔板中，培养4 d后，再用胰蛋白酶消化细胞，计活细胞数，计算从P1到 P15代细胞的增殖速度，通过计数5例标本计算出平均值，并绘制成增殖曲线。通过计数结果分别计算P5、P10和P15代细胞的培增时间。

细胞倍增时间公式：DT=t*[lg2/(lgNt-lgNo)]。

BrdU检测：将细胞制成浓度为2×10⁸ L^-¹的细胞悬液，以100 μL/孔接种于无菌的96孔培养板中。添加BrdU检测试剂严格按照试剂盒说明书操作。

细胞传代能力：将5例胎盘间充质干细胞长期培养并传代，直到细胞不再继续增殖或者其形态发生变化，不再具有干细胞形态时停止传代。

主要观察指标： ①胎盘间充质干细胞形态。②间充质干细胞表面标志物的表达。③胎盘间充质干细胞成脂成骨细胞分化结果。④细胞倍增时间、增殖及传代能力。

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讨论

在组织工程和临床应用干细胞治疗中干细胞种类的选择是决定治疗效果的重要因素，以往常以骨髓间充质干细胞为治疗的首选[^31] ，近年来发现骨髓、脂肪、肌肉、外周血来源的间充质干细胞都起源于中胚层，然而胎盘也来源于中胚层，生物学特性与骨髓间充质干细胞相类似^[32-34] 。而且胎盘是由胚胎发育而成，连接胎儿与母体，为胎儿提供物质交换的场所，胎盘也随着胎儿的发育而成长，它的来源更加原始，所以它的可塑性和分化能力更强^[35-37] 。而且无致畸性，更加安全，比骨髓间充质干细胞具有更大的优势。
胎盘间充质干细胞的分离培养有多种方法，可采用胶原酶消化法，直接种植法，胎盘间充质干细胞悬液梯度离心的方法和流式细胞仪分选等^[38] 。作者预实验采用了两种分离培养方法，第1种是直接种植的方法，第2种是胶原酶消化的方法。实验采用直接种植方法，首先用PBS将胎盘组织上的血渍冲洗干净后，用无菌的镊子将胎盘组织撕碎，然后将碎组织放入含有干细胞培养液的培养皿中培养。4 d后半量换液观察，培养皿中有少量、小的短梭形细胞，细胞折光度弱。1周以后观察细胞，在短梭形细胞周围见有爬出的梭形细胞，但细胞数量不多，周围有小颗粒样物。预实验采用第2种方法，胶原酶消化法，3 d后成功分离培养了胎盘间充质干细胞，细胞呈长梭形，漩涡状生长，折光度好，细胞传代后，生长迅速，与骨髓间充质干细胞具有相似的细胞形态。由于直接种植方法分离培养胎盘间充质干细胞，原代细胞生长缓慢，并且细胞周围有杂质，折光度差，然而采用胶原酶消化的方法能够分离出更多的间充质干细胞，所以实验采用胶原酶消化的方法分离培养胎盘间充质干细胞。细胞分离培养成功后，通过流式细胞分析，分离培养的胎盘间充质干细胞表达干细胞表面标志物，不表达内皮细胞和造血干细胞的标志物^[39-41] 。体外诱导分化实验，成功诱导了脂肪细胞和骨细胞^[42-44] 。
胎盘间充质干细胞具备骨髓间充质干细胞应有的特性，具有多向分化的潜能，能向心肌细胞，表皮细胞肝细胞等分化^[45-47] 。并且增殖能力优于骨髓间充质干细胞，能获得更高数量的细胞数，同时胎盘间充质干细胞具有来源广泛，获取方便，无痛苦，不需要侵入性的操作等特点^[48-50] 。胎盘间充质干细胞的来源也比成人来源的骨髓和脂肪间充质干细胞更加的原始，所以它的可塑性更强，更适合用于组织工程和干细胞治疗，因此胎盘间充质干细胞成为了临床应用干细胞治疗的重要选择之一。在组织工程时常常需要大量的细胞接种，原代获取的数量是远远不够的，间充质干细胞必须具备生长速度快，倍增时间短，传代能力强的特点，进而才能够在体外大量的扩增，满足临床治疗的需要。本实验主要研究胎盘间充质干细胞的增殖能力。通过细胞计数实验对每个代次胎盘间充质干细胞进行细胞计数，了解每个代次细胞生长情况，当细胞传代到P15代时，共获细胞数量为3.5×10¹¹个细胞，然后继续传代，胎盘间充质细胞传代到P25代时，细胞形态发生改变，变成短梭形，与干细胞的形态有差异。所以作者认为胎盘间充质干细胞，能够保持干细胞的形态培养到25代。当细胞从P1代生长到P25代时，细胞以对数生长的方式增殖，到P25代时可想而知会产生大量的间充质干细胞。
然而不同代次的间充质干细胞增殖能力是否相同，当临床应用干细胞治疗时，应该选择哪个代次的间充质干细胞治疗更加合适，这些都是选择干细胞治疗时，应该思考和有待解决的问题。因此作者通过BrdU掺入实验，分别对P5、P10和P15代细胞的增殖能力进行了检测，结果显示P5代间充质干细胞的增殖能力明显高于P10和P15代，实验结果表明，胎盘间充质干细胞在体外培养时，随着细胞代次的增加，细胞会逐渐出现的老化。由于胎盘干间充质细胞在P5代后增殖能力会逐渐的下降，所以作为临床应用时最好选择P5代以下的间充质干细胞进行体外培养。
本实验通过连续培养胎盘间充质干细胞，检测胎盘间充质干细胞的传代能力。但是，当细胞传代培养到第25代时，细胞形态开始发生改变，细胞从以前的长梭形逐渐变成了短缩形，呈铺路石样，折光度好，但是细胞贴壁不牢，易消化，而且生长速度变快，这一现象的出现引起实验者的注意，以往培养其他种类的细胞时，当细胞出现老化或不再增殖时，细胞内会出现老化的颗粒或者细胞形态逐渐改变并且细胞的生长速度变慢甚至不再增殖。然而，实验培养的胎盘间充质干细胞，形态发生改变后，仍保持增殖能力，并且形态经传代后基本保持一致。这些问题引起的思考和猜测，假设细胞已经从干细胞类型转变为其他类型的细胞如内皮细胞等，或者细胞已经老化，或者短缩形的细胞为一些混杂的细胞并不具有特定细胞的性质和表面标记。
根据以上的假设，实验用内皮细胞的表面标志物进行鉴定，发现细胞并不表达内皮细胞特有的表面标志。所以形态改变的细胞，并不是内皮细胞。如果是细胞老化，但是细胞的形态是一致的，并且具有增殖的能力，生长速度快，48 h细胞融合度达80%-90%，并且消化细胞后，对细胞进行传代、冻存和复苏，复苏后得细胞，细胞形态没有改变，仍然保持原有的短缩形，并且生长速度保持不变，应该可以排除细胞老化。推断短缩形细胞会不会是间充质干细胞的结局，目前还没有准确的定论。

胎盘间充质干细胞传代后的增殖能力

Proliferative abilities of placenta-derived mesenchymal stem cells at different passages

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