急性脊髓损伤后差异蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.010

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (41): 7248-7254.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.010

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

急性脊髓损伤后差异蛋白的表达

徐磊磊¹，周义军¹，宋兴华¹，丁俐文²，陈江涛¹，王翀¹，甘雨灵¹，朱晓萌¹

¹新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²新疆医科大学，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2013-03-26 修回日期:2013-06-19 出版日期:2013-10-08 发布日期:2013-11-01
通讯作者: 宋兴华，博士，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 Songxinghua19@163.com
作者简介:徐磊磊★，男，1987年生，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事外科学(骨科)的研究。 xll5666@163.com
基金资助:
国家自然科学基金(81160218/H0605) *“不同时间点鞘内注射甲基强的松龙治疗大鼠急性脊髓损伤的蛋白组学实验研究”

Differential protein expression after acute spinal cord injury

Xu Lei-lei¹, Zhou Yi-jun¹, Song Xing-hua¹, Ding Li-wen2, Chen Jiang-tao¹, Wang Chong¹, Gan Yu-ling¹, Zhu Xiao-meng¹

¹The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2013-03-26 Revised:2013-06-19 Online:2013-10-08 Published:2013-11-01
Contact: Song Xing-hua, M.D., Doctoral supervisor, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Songxinghua19@163.com
About author:Xu Lei-lei★, Studying for master’s degree, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China xll5666@163.com
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81160218/H0605*

摘要/Abstract

摘要：

背景：在质谱分析中，任何一种同位素标记相对和绝对定量试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比，而在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114-121)的峰，因此可以分析得到相关蛋白质的定量信息。
目的：建立大鼠急性脊髓损伤后脊髓组织差异蛋白质谱，应用同位素标记相对和绝对定量技术联合LC-MS/MS质谱技术从分子水平来探索脊髓差异蛋白的表达情况。
方法：取8只SD大鼠，参照Allen’s等方法建立大鼠急性脊髓损伤模型，随机分为脊髓损伤后0 h组和8 h组，每组各4只。损伤后取脊髓组织，用同位素标记相对和绝对定量技术分析大鼠急性脊髓损伤后脊髓组织的差异蛋白质。
结果与结论：共鉴定到了220个差异表达的蛋白，上调的差异蛋白数是116个，下调的差异蛋白有104个。其中相关神经再生的差异蛋白12个，其中上调的有7个，下调的有5个。提示实验中检测到的多种差异蛋白及表达明显的神经生长因子可能作为急性脊髓损伤的生物标记物或可能作为临床管理监测急性脊髓损伤的损伤进程、靶向治疗及评估疗效的有力证据。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 急性脊髓损伤, 神经再生, 蛋白质组学, 同位素标记相对和绝对定量, 质谱分析, 神经生长因子, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In mass spectrometry analysis, the same protein in different samples labeled with isobaric tags for relative and absolute quantitation presents the same mass-to-charge ratio, while in the tandem mass spectrometry analysis, the ion signal shows different mass-to-charge ratio (114-121). Thus the quantitative information of the related proteins can be obtained.
OBJECTIVE: To establish the protein spectrum of spinal cord tissue differences proteins after acute spinal cord injury, and to explore the spinal differential protein expression on the molecular level using isobaric tags for relative and absolute quantitation combined with LC-MS/MS mass spectrometry technique.
METHODS: Eight Sprague Dawley rats were selected to establish the acute spinal cord injury models using Allen’s method. The rats were randomly divided into 0 hour spinal cord injury group and 8 hours spinal cord injury group, four rats in each group. The spinal cord tissues were collected after injury, and the spinal cord tissue differences proteins were analyzed with isobaric tags for relative and absolute quantitation technique after acute spinal cord injury.

RESULTS AND CONCLUSION: Totally 220 differentially expressed proteins were identified in this research, the number of up-regulation proteins was 116 and the number of down-regulation proteins was 104. There were 12 differential proteins related to neural regeneration, and among the 12 proteins, there were seven up-regulation proteins and five down-regulation proteins. The various identified differential proteins and significantly expressed nerve growth factors in this experiment can be used as the biomarkers of acute spinal cord injury or used as the strong evidence for the clinical management and monitoring of the injury process and target therapy of acute spinal cord injury, as well as the effect evaluation.

Key words: spinal cord injuries, nerve regeneration, proteomics, mass spectrometry

中图分类号:

R318

徐磊磊，周义军，宋兴华，丁俐文，陈江涛，王翀，甘雨灵，朱晓萌. 急性脊髓损伤后差异蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(41): 7248-7254.

Xu Lei-lei, Zhou Yi-jun, Song Xing-hua, Ding Li-wen, Chen Jiang-tao, Wang Chong, Gan Yu-ling, Zhu Xiao-meng. Differential protein expression after acute spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(41): 7248-7254.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠8只，分为2组，实验过程无脱失，均进入结果分析。

2.2 同位素标记相对和绝对定量标记结果 使用同位素标记相对和绝对定量技术对SD大鼠急性脊髓损伤后脊髓组织8 h组和0 h组进行蛋白质组学研究共鉴定出差异蛋白220个。其中上调蛋白数量为116个，下调蛋白数量为104个，见表2，图1。

2.3 相关神经再生的差异蛋白 从众多差异蛋白中重点找出相关神经再生的差异蛋白12个，其中上调的有7个包括：Atl1 Atlastin-1，Gnaq Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha，Cd9 CD9 antigen，LOC100364190 mKIAA0868 protein-like，Apoa1 Apolipoprotein A-I，Acsl6 Isoform 1 of Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 6，Aspa Aspartoacylase；下调的有5个包括：Kif5c kinesin heavy chain isoform 5C，Ywhah 14-3-3 protein eta，Synaptosomal-associated protein 25，Pls3 Plastin-3，Omg oligodendrocyte myelin glycoprotein，见表3。这些差异蛋白相对分子量在27 483-210 679之间，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 质谱分析结果 实验中共鉴定了12个相关神经再生因子的差异蛋白，鉴定到的“谱图编号+肽段序列”图有196个，现以Protein Atl1 Atlastin-1的一个肽段名为AGPVQVLIVK的“谱图编号+肽段序列”图为例说明质谱分析结果，见图2。

图2为肽段碎片离子强度信息，图中黑色线条表示未匹配到的离子，红色字符表示匹配到的a，b型离子，蓝色字符表示匹配到的y离子，其中实线高度表示离子的强度，虚线引出的是相应离子的注释说明。图中的红色字符表示带1个氨基酸残基的b型离子，离子M/Z为376.25,即所对就横坐标的具体M/Z值，电荷Z(+)为1。蓝色字符表示带1个氨基酸残基的y型离子，离子M/Z为 1 107.54，电荷Z(+)为1。

参考文献

[1] Beattie MS,Hermann GE,Rogers RC,et al.Cell death in models of spinal cord injury. Prog Brain Res.2002; 137: 37-47.
[2] Pietraszkiewicz F,Tysiewicz-Dudek M.Epidemiology of spinal injuries in lubuskie province. Ortop Traumatol Rehabil.2010; 12(5):435-442.
[3] Emery E,Aldana P,Bunge MB,et al.Apoptosis after traumatic human spinal cord injury. J Neurosurg.1998; 89: 911–920.
[4] Wyndaele M,Wyndaele JJ.Incidence, prevalence and epidemiology of spinal cord injury:what learns a worldwide literature survey.Spinal Cord. 2006;44(9):523-529.
[5] Tsutsumi S，Ueta T，Shiba K，et a1．Effects of the second national acute spinal cord injury study of hish-dose methylprednisolone therapy on acute cervical spinal cord injury-results in spinal injuries center. Spine.2006; 31(26):2992-2996.
[6] Wasinger VC,Cordwell SJ,Cerpa-Poljak A, et a1. Progress With geneproduct mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis.1995;16: 1090-1094．
[7] Gonealves A，Benueci F．Clinical application of proteomics in breast cancer:state of the art and perspectives．Med Princ Praet.2011;20(1):4-18．
[8] Lubieniecka JM,Streijger F,Lee JH,et al.Biomarkers for severity of spinal cord injury in the cerebrospinal fluid of rats. PLoS One. 2011; 6(4): e19247.
[9] Zhang J. Proteomics of human cerebrospinal fluid -the good, the bad, and the ugly.Proteomics Clinical applications. 2007;1: 805–819.
[10] Adib-Conquy M,Cavaillon JM.Stress molecules in sepsis and systemic inflammatory response syndrome. FEBS Letters. 2007; 581: 3723-3733.
[11] Tilleman K, Deforce D, Elewaut D.Rheumatology: a close encounter with proteomics. Rheumatology (Oxford).2005;44: 1227-1226.
[12] Castagnola M，Piceiotti PM，Messana I，et a1．Potential applications of human saliva as diagnostic fluid．Acta Otorhinolaryngol Ital.2011;3l(6):347-357．
[13] Wise Yong,胥少汀，苟三怀.大剂量甲基强的松龙治疗急性脊髓损伤[J]. 中国脊柱脊髓损伤杂志，2000,10(5):304-305.
[14] Costa S,Planchenault T,Charriere-Bertrand C,et al.Astroglial permissivity for neuritic outgrowth in neuron-astrocyte cocultures depends on regulation of laminin bioavailability. Glia.2002;37:105-113.
[15] Hu J,Qian J,Borisov O,et al.Optimized proteomic analysis of a mouse model of cerebellar dysfunction using amine-specific isobaric tags. Proteomics. 2006; 6(15):4321-4334.
[16] Ostasiewicz P,Zielinska DF,Mann M,et al.Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.J Proteome Res. 2010; 9(7):3688-3700.
[17] Ross PL,Huang YN,Marchese JN,et al.Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics.2004; 3(12):1154-1169.
[18] Jain MR,Bian S,Liu T,et al.Altered proteolytic events in experimental autoimmune encephalomyelitis discovered by iTRAQ shotgun proteomics analysis of spinal cord. Proteome Sci. 2009; 7:25.
[19] Hu YE, Mao JH, Zhu Y, et al. Nerve growth factor pretreatment against glutamate-induced hippocampal neuronal injury: action mechanism of phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10. Neural Regen Res. 2010;5(1):5-9.
[20] Shi ED, Wang BC, Sun QS. Nerve growth factor and injured peripheral nerve regeneration. Neural Negen Res 2008; 3(11): 1273-1276 .
[21] Sang CL,Tai GY,Yong Y,et al.Analysis of spinal cord proteome in the rats with mechanical allodynia after the spinal nerve injury. Biotechnol Lett.2003; 25(24): 2071-2078.
[22] Lin R, Roseborough G,Dong Y, et al.DNA damage and repair system in spinal cord ischemia.J Vasc Surg. 2003;37 : 847-858.
[23] Grant JE,Hu J,Liu T,et al.Post-translational modifications in the rat lumbar spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis.J Proteome Res. 2007; 6(7):2786–2791.
[24] Brandel JP.Clinical aspects of human spongiform encephalopathies, with the exception of iatrogenic forms. Biomed pharm acother.1999;53(1) : 14-18.
[25] Col lins S,Boyd A,Fletcher A,et al.Creutzfeldt-Jakob disease: diagnosis utility of 14-3-3 protein immunodetection in CSF. J Clin Neurosci.2000;7(3): 203-208.
[26] Hashiguchi M,Sobue K,Paudel HK.14-3-3 Zet a is an efector of Tau protein phosp horylation.J Biol Chem.2000;275( 33) : 25247-25254.
[27] Sekine Y, Takeda K, Ichijo H. Ichijo, The ASK1-MAP kinase signaling in ER stress and neurodegenerative diseases, Curr Mol Med. 2006, 6: 87-97.
[28] Kawamoto Y, Akiguchi I, Nakamura S,et al.Li nks 14-3-3 proteins in Lewy bodies in Parkinson disease and diffuse Lewy body disease brains.J Neuropathol Exp Neurol, 2002, 61( 3) : 245-253.
[29] Takeda K, Matsuzawa A, Nishitoh H, et al. Roles of MAPKKK ASK1 in stress- induced cell death.Cell Struct Funct. 2003;28: 23-29.
[30] Yang C, Ren Y, Liu F, et al.Ischemic preconditioning suppresses apoptosis of rabbit spinal neurocytes by inhibiting ASK1–14-3-3 dissociation. Neuroscience Letters.2008: 267-271
[31] Komuro Y,Takeda K,Ichijo H.[Regulatiory mechanism of cell dealth through ASK1].Seikagaku.2004;76(11):1458-1462.
[32] Masutani H, Ueda S, Yodoi J. The thioredoxin system in retroviral infection and apoptosis.Cell Death Differ.2005;12 (1):991-998.
[33] Shao LE, Tanaka T, Gribi R, et al. Thioredoxin-related regulation of NO/NOS activities, Ann NY Acad Sci. 2002;962: 140-150.
[34] Song JJ,Rhee JG,Suntharalingam M,et al.Role of glutaredoxin in metabolic oxidative stress. Glutaredoxin as a sensor of oxidative stress mediated by H2O2.J Biol Chem. 2002;277:46566-46575.
[35] Park HS, Cho SG, Kim CK,et al.Heat shock protein hsp72 is a negative regulator of apoptosis signal-regulating kinase 1, Mol Cell Biol.2002;22 :7721-7730.
[36] Goldman EH，Chen L, Fu H. Activation of apoptosis signal-regulating kinase 1 by reactive oxygen species through dephosphorylation at serine 967 and 14-3-3 Dissociation. J Biol Chem.2004;279 :10442-10449.
[37] Wang P, Cao X, Nagel DJ, et al.Nagel, Guoyong Yin, Activation of ASK1 during reperfusion of ischemic spinal cord, Neurosci Lett. 2007;415:248-252.
[38] Liu Y, Yin G, Surapisitchat J, et al.Surapisitchat. Laminar flow inhibits TNF-induced ASK1 activation by preventing dissociation of ASK1 from its inhibitor 14-3-3.J Clin Invest. 2001;107:917-923.

引言

急性脊髓损伤是一种严重的神经系统创伤，随着交通及建筑事业的迅速发展，脊柱骨折合并脊髓损伤已成为骨科领域中常见的疾患，且其发生率有逐年上升的趋势。据统计发达国家的脊髓损伤发病率为每年28.3-45人/百万人，中国发病率虽较低，每年约6.7人/百万人，但每年也有1万余人遭此损伤。在美国每年大约发生1万例新的脊髓损伤，且大多数患者是青年人，每位患者一生中治疗费用超过200万美元^[1]。相对其他国家，波兰为发病率较低，也达到14.5人/百万^[2]。虽然临床工作者竭尽全力抢救治疗，使其死亡率从20世纪初期的50%左右降低到目前的6%^[3]，但神经损伤后的功能恢复仍不能令人满意。近来针对脊髓损伤的研究已广泛开展，但并未取得实质性进展^[4]。因此急性脊髓损伤的治疗目前仍是一个世界性的医学难题，至今尚未发现满意的挽救损伤脊髓功能的方法^[5]。

澳大利亚Wilkins首先提出蛋白质组学(proteomics)的定义，并于1995年首次发表了关于蛋白质组学的概念的文章^[6-7]。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，在蛋白质多肽谱和基因产物图谱技术的基础上发展起来的一门学科，旨在阐明生物体全部蛋白的表达模式及功能，具体包括蛋白质的表达情况、存在方式、结构、功能和相互作用等。通过检测蛋白质在不同环境、不同药物作用、各种疾病及病理生理过程中的变化，来阐述这些外在因素对细胞代谢的影响，分析改变的蛋白质在各种疾病过程中发挥的作用，解释各种病理生理过程的分子机制^[8-10]。蛋白质组学研究内容分为3类，即表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和差异蛋白质组学^[11-12]。

目前对急性脊髓损伤后其治疗的8 h时间窗限制仍没有明显突破。美国全国急性脊髓损伤研究联合委员会表明在伤后8 h内对其进行及时有效的治疗能明显改善急性脊髓损伤患者的运动、感觉功能^[13]。所以实验应用同位素标记相对和绝对定量技术联合LC-MS/MS质谱技术从分子水平来探索SD大鼠急性脊髓损伤后0 h和 8 h的脊髓差异蛋白的表达情况。

神经生长因子是一种感觉和交感神经元生长必须的蛋白质，可以维持感觉和交感神经的生存，促进神经细胞的生长和分化，也可以促进伤口愈合^[14]。实验寻找急性脊髓损伤后的脊髓中差异表达的神经生长因子，为急性脊髓损伤的继发性损伤机制和有效治疗方法奠定基础。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年5至12月在新疆医科大学第一附属医院实验动物中心完成。

材料：选用2月龄SD雄性大鼠8只，体质量为 250-350 g(平均300 g)，由新疆医科大学第一附属医院实验动物中心提供，许可证编号：SCXK(新)2011-0004。动物实验方法符合动物伦理学要求(伦理审批号20120220005)。

方法：

动物实验分组及模型建立：将8只2月龄SD雄性大鼠随机分为2组，即脊髓损伤后0 h组、脊髓损伤后8 h组，每组各4只。参照Allen’s等方法建立大鼠急性脊髓损伤模型。

样品制备：脊髓损伤造模完成后，分别于损伤后 0，8 h截取损伤脊髓段(以脊髓损伤为中心长度为 1 cm，约500 mg)组织块，用生理盐水冲洗干净并清除脊髓硬脊膜，称质量后置入2 mL速冻管中并做好相应标记，然后用液氮快速冷冻，再置入-80 ℃深低温冰箱保存备用。

样本检测：

从样品中提取蛋白：称取适量的样品加入500 μL蛋白裂解液溶解后，分别添加终浓度为1 mmol/L 的PMSF、2 mmol/L的EDTA，5 min后，添加终浓度 10 mmol/L的DTT；超声15 min后，离心20 min，取上清；上清液在56 ℃条件下加入终浓度10 mmol/L DTT处理1 h，还原打开二硫键；加入终浓度55 mmol/L IAM暗室静置45 min，进行半胱氨酸的烷基化封闭；加入适量冷丙酮，在-20 ℃静置2 h；再次离心20 min，丢弃上清液；沉淀在200 μL 0.5 mol/L TEAB中超声溶解 15 min；最后离心20 min后取上清液用于定量。样品蛋白质信息见表1。

蛋白质浓度测量(Bradford定量)：准备BSA标准品的标准曲线，9管的标准品量(0.2 g /L BSA)依次为：0，2，4，6，8，10，12，16，20 μL，向每管添加纯水，使最终体积为20 μL。管1是不含蛋白的参照，其他管分别含有0.4，0.8，1.2，1.6，2，2.4，3.2，4 μg蛋白。向每管添加180 μL protein assay reagent，混合，室温培养10 min后；用酶标仪测量595 nm下的吸光度，以管1作参照物，读出每个样品的吸收率。

SDS电泳：配置12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶。每个样品分别与2×loading buffer混合，95 ℃加热5 min。每个样品上样量为30 μg，Marker上样量10 μg。120 V恒压电泳120 min。电泳结束后，考染液染色2 h，再用脱色液脱色3-5次，30 min/次。

蛋白质酶解：每个样品精确取出100 μg蛋白后；按蛋白∶酶=20∶1的比例加入Trypsin，37 ℃酶解4 h后；按上述比例再补加Trypsin 1次，37 ℃继续酶解8 h。

同位素标记相对和绝对定量标记：胰蛋白酶消化后，用真空离心泵抽干肽段；再用0.5 mol/L TEAB复溶肽段，按照手册进行同位素标记相对和绝对定量标记后；每一组肽段被不同的同位素标记相对和绝对定量标签标记，室温培养2 h；再将标记后的各组肽段混合，用SCX柱进行液相分离。

SCX分离：采用岛津LC-20AB液相系统、分离柱为4.6×250 mm型号的UltremexSCX柱对样品进行液相分离。将标记后抽干的混合肽段用4 mL bufferA (25 mmol/L NaH₂PO₄ in 25%ACN,pH2.7)复溶。进柱后以1 mL/min 的速率进行梯度洗脱：先用buffer A洗脱 10 min，接着逐渐混入5%-35% buffer B (25 mmol/L NaH₂PO₄，1 mol/L KCl in 25%CAN， pH 2.7)洗脱11 min，最后逐渐混入35%-80% bufferB 洗脱1 min。整个洗脱过程在214 nm吸光度下进行监测，经过筛选得到20个组分。每个组分分别用StrataX除盐柱除盐，然后冷冻抽干。

基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MSMS分析：与质谱仪相结合的液相系统为nanoACQuity(Waters)，包括Symmetry C18柱(规格5 μm，180 μm×20 mm)和BEH130 C18柱8/32(规格1.7 μm, 10 0 μm×100 mm)两部分。SymmetryC18柱用于肽段吸附和除盐，BEH130 C18柱用于分离。所用的流动相A液(水∶乙腈∶甲酸= 98∶2∶0.1)和B液(水∶乙腈∶甲酸=2∶98∶0.1)中都加入一定比例的校正液(ThermoFisherScientific)。每次上样量为2.25 μg(9 μL)，用A液以2 μL/min的流速洗脱 15 min，进行肽段吸附和除盐。接下来用含5%B液的流动相以300 nL/min流速洗脱1 min，开始建立洗脱梯度：40 min内B液梯度线型从5%升至35%，再5 min从35%升至80%，然后80%持续洗脱5 min，最后2 min恢复柱料。使用的机器为TripleTOF 5600(AB SCIEX, Concord, ON)，离子源为Nanospray IIIsource(AB SCIEX, Concord，ON)，放射器为石英材料拉制的喷针(New Objectives，Woburn，MA)。数据采集时，机器的参数设置如下：离子源喷雾电压2.5 kV，氮气压力为 206.85 kPa，喷雾气压103.425 kPa，喷雾接口处温度150 ℃；扫描模式为反射模式，分辨率≥30 000；积累250 ms的从2+到5+的离子挑选其中强度每秒积累超过120分的前30个进行扫描，3.3 s为一个循环；第2个四极杆(Q2)的传输窗口设置为100 Da为100%；脉冲射频电的频率为11 kHz；检测器的检测频率为40 GHz；每次扫描的粒子信号以4个通道分别记录共4次后合并转化成数据；对于同位素标记相对和绝对定量类项目，离子碎裂的能量设置为(35±5) eV；母离子动态排除设置为：在一半的出峰时间内(约18 s)，相同母离子的碎裂不超过2次。

数据分析及处理：经检测得到的原始质谱数据与“IPI大鼠蛋白数据库”比对找出蛋白序列号，然后通过Mascot蛋白质鉴定软件找出具体的蛋白。IPI大鼠蛋白数据库是由EBI(欧洲生物信息研究所，全称EMBL - European Bioinformatics Institute)负责维护的蛋白数据库之一。Mascot是一个蛋白质鉴定软件，曾被Frost/Sullivan研究机构评为生物质谱软件的黄金标准。该项目中使用的软件版本为Mascot2.3.02。

主要观察指标：①同位素标记相对和绝对定量标记结果。②相关神经再生的差异蛋白。③质谱分析结果。

讨论

近年来，世界各地研究人员用芯片技术加上蛋白质谱技术研究差异蛋白组学。因高通量蛋白差异分析困扰了许多研究者，由美国ABI公司开发的同位素标记相对和绝对定量技术，解决这一难题^[15-16]。同位素标记相对和绝对定量技术是一种功能十分强大的绝对和相对定量研究的方法^[17-18]。在质谱分析中，任何一种同位素标记相对和绝对定量试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比，而在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114-121)的峰，因此可以分析得到相关蛋白质的定量信息。

神经生长因子具有调节发育中神经元存活和促进成熟神经系统可塑性的作用^[19-20]。研究发现神经生长因子在神经再生过程中也起着重要的促进作用，分泌神经生长因子的成纤维细胞移植到脊髓后，可以引起脊髓初级感觉传入神经轴突、局部运动神经轴突、蓝斑核脊髓轴突的出芽。脊髓损伤后，神经生长因子及其受体表达增加，从而激活机体的自身保护机制，使损伤局部的神经生长因子浓度增高，加强对神经元的保护作用，减轻脊髓损伤。

实验表明，SD大鼠脊髓受损伤后，可以导致与其相关的脊髓组织蛋白质的表达发生一定的变化^[21-23]。这次实验中，急性脊髓损伤的脊髓损伤组织中有12种相关神经再生的蛋白质存在差异表达。突触前膜上的突触小体相关蛋白(Isoform SNAP-25b of Synaptosomal- associated protein 25, SNAP-25)在轴突的生长、形成、小泡与质膜的融合过程中起着重要的作用。

其中14-3-3蛋白(14-3-3 protein)是高度保守的酸性蛋白家族，最初在脑脊液提取物中被发现。其相对分子质量在25 000-30 000，有7种亚型，各亚型之间有高度的同源性。在神经系统中含量最丰富, 约占全部可溶性蛋白质的1%。14-3-3 蛋白对众多的靶蛋白具有调节作用, 主要依赖于磷酸化方式。14-3-3 蛋白主要参与信号转导、细胞内蛋白质的转运、细胞增殖周期和凋亡的调节、细胞骨架构建等，尚有一些作用目前还不清楚。脑脊液中 14-3-3 蛋白的浓度极低。神经组织的损害会导致它在脑脊液中的出现，其浓度可能与神经元破坏程度成正比^[24]。

目前越来越多的研究表明，14-3-3蛋白的表达与神经系统疾病的发生发展有关。脑脊液中14-3-3蛋白的检测在国外已广泛用于对克雅脑病的辅助诊断，且被认为是最有价值的诊断标志^[25]。Hashiguchi等^[26-27]的研究表明14-3-3蛋白的存在促进Tau蛋白的磷酸化，从而破坏微管的稳定性，而神经元纤维缠结(NFTs)由大量成对螺旋状的过度磷酸化微管相关Tau蛋白等组成，是阿尔茨海默病的主要病理特征。所以认为14-3-3蛋白各亚型的作用将有利于对阿尔茨海默病的发病机制的了解。Kawamoto等^[28-29]发现14-3-3蛋白与lewy小体结构密切相关，推测14-3-3蛋白参与帕金森病的病理形成过程，而细胞内Lewy小体的形成是帕金森病患者脑部最显著的病理特征。Yang等^[30-35]报道，细胞凋亡信号调节激酶1和14-3-3蛋白调节脊髓损伤后缺血再灌注损伤中有重要作用。采用随机对照试验证明脊髓缺血再灌注损伤处理组比对照组中的细胞凋亡信号调节激酶1和14-3-3分解量明显降低，依此认为脊髓缺血再损伤中14-3-3有保护作用。

这次实验基于同位素标记相对和绝对定量技术对SD大鼠急性脊髓损伤后脊髓组织蛋白质的检测，发现脊髓损伤后8 h组相比脊髓损伤0 h组的脊髓中14-3-3蛋白表达明显下调，差异有显著性意义(P < 0.05)。通过对其GO分析，14-3-3蛋白与神经再生的生物学功能有关。14-3-3蛋白参与的分子生物学过程有：儿茶酚胺代谢、蛋白质转运、调节神经再生、有丝分裂、细胞凋亡、类固醇激素降解、调节突触传递和皮质类固醇激素信号传递等。作者认为14-3-3蛋白对急性脊髓损伤后其神经再生有不可忽视的作用，其表达量在急性脊髓损伤的治疗中可能作为一个重要监测指标。但其具体功能机制还有待进一步证实^[36-38]。

实验中可能影响研究结果的因素有：样本量较少，可能需要大样本的验证；实验只做了脊髓组织相关蛋白质的的检测，深入研究需要对动物脑脊液相关蛋白质进行对比检测研究；实验只应用了同位素标记相对和绝对定量联合LC-MS/MS技术来鉴定蛋白质，进一步研究需要免疫组织化学和Western blot的验证检测来支持；实验若应用于临床，则更需要临床脑脊液蛋白质组学相关试验的支持。

结论：作者认为基于同位素标记相对和绝对定量的神经蛋白质组学研究为研究神经系统损伤性相关疾病提供了广泛而有用的分子生物学信息。实验中检测到的多种差异蛋白及表达明显的神经生长因子可能作为急性脊髓损伤的生物标记物或可能作为临床管理监测急性脊髓损伤的损伤进程、靶向治疗及评估疗效的强有力证据。因急性脊髓损伤的治疗目前仍是一个世界性的医学难题，至今尚未发现满意的挽救损伤脊髓功能的方法^[5]。本实验对脊髓损伤相关神经再生的差异蛋白做了初步的探讨，对于从分子水平的急性脊髓损伤的损伤机制、治疗时间窗、药物及给药途径尚待进一步研究。

急性脊髓损伤后差异蛋白的表达

Differential protein expression after acute spinal cord injury

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[1]	肖阳, 龚立琼, 费静, 李雷激. 电针干预面神经损伤模型兔面神经核团中神经生长因子及其受体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1253-1259.
[2]	黄传俊, 邹煜, 周晓婷, 朱扬清, 钱伟, 张卫, 刘星. 携带脐带间充质干细胞的RADA16-BDNF水凝胶支架定向移植促进脑出血大鼠神经功能恢复[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 510-515.
[3]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[4]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[5]	罗选翔, 经历, 潘彬, 冯虎. 甲钴胺联合鼠神经生长因子促进脊髓型颈椎病术后神经功能的恢复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 719-722.
[6]	林若慧, 陈赛楠, 叶云金, 陈娟, 谢丽华, 黄景文, 葛继荣, 李生强. 基于TMT蛋白质组学分析骨疏康胶囊治疗骨质疏松模型大鼠的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5141-5147.
[7]	路坦, 常耀辉, 尉娜. 脂氧素A4对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的神经保护[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(26): 4175-4179.
[8]	谢阳, 吕志宇, 张淑江, 龙婷, 李作孝. 重组腺病毒介导神经生长因子转染实验性自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠少突胶质细胞的凋亡及髓鞘化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3678-3683.
[9]	蔺海旗, 陈亮, 唐璐, 翁锡全, 林文弢. 尿液蛋白质组学评估机体病理性变化的意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3259-3266.
[10]	胡万东, 何佳林, 张隆盛, 廖文波. 胸椎黄韧带骨化患者的差异蛋白组学研究[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2625-2629.
[11]	颜南, 司晓凤, 曾亮, 田伟, 单广东, 熊礼硕, 杨炜杰, 王正东. 神经生长因子干预大鼠骨骼肌卫星细胞增殖及α-肌动蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2030-2035.
[12]	史正亮, 张华, 范志勇, 马维, 袁鹤, 杨冰. 几丁糖/聚乙烯醇导管联合脑源性神经营养因子缓释微球修复大鼠周围神经缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1555-1559.
[13]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.
[14]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
[15]	张聪, 赵岩, 杜小宇, 杜欣瑞, 庞廷娟, 付怡凝, 张浩, 张步洲, 李筱贺, 王利东. 青少年特发性脊柱侧凸腰主弯患者腰椎-骨盆的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1155-1161.