骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞的动态观察

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.005

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (36): 6409-6416.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.36.005

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骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞的动态观察

冯均伟，王跃，吕波，郝鹏，唐六一，朱建新，朱宗东，谭波

四川省人民医院骨科，四川省成都市 610071

收稿日期:2012-12-10 修回日期:2012-12-17 出版日期:2013-09-03 发布日期:2013-09-03
通讯作者: 王跃，博士，主任医师，硕士生导师，四川省人民医院骨科，四川省成都市 610071 wangyue@medmail.com.cn
作者简介:冯均伟★，男，1982年生，四川省汉源县人，汉族，2012年遵义医学院毕业，硕士，主要从事骨与关节方面的研究。 fjw2@sohu.com

Dynamically observing chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Feng Jun-wei, Wang Yue, Lü Bo, Hao Peng, Tang Liu-yi, Zhu Jian-xin, Zhu Zong-dong, Tan Bo

Department of Orthopedics, People’s Hospital of Sichuan Province, Chengdu 610071, Sichuan Province, China

Received:2012-12-10 Revised:2012-12-17 Online:2013-09-03 Published:2013-09-03
Contact: Wang Yue, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, People’s Hospital of Sichuan Province, Chengdu 610071, Sichuan Province, China wangyue@medmail.com.cn
About author:Feng Jun-wei★, Master, Department of Orthopedics, People’s Hospital of Sichuan Province, Chengdu 610071, Sichuan Province, China fjw2@sohu.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向诱导时间报道不一，对诱导中细胞动态变化进行观察比较的研究较少。
目的：观察兔骨髓间充质干细胞诱导8，11，14，17，20 d向成软骨细胞定向分化的动态变化情况以及诱导成熟时间。
方法：穿刺新西兰大白兔股骨穿刺抽取骨髓，密度梯度离心法分离、培养骨髓间充质干细胞。传至第3代后予以含转化生长因子β1等成分的无血清诱导液定向向软骨细胞诱导。根据不同的诱导时间分成为5组：8 d组、11 d组、14 d组、17 d组及20 d组。通过观察各组细胞形态、甲苯胺蓝染色结果、Ⅱ型胶原免疫组化结果、培养液内多聚蛋白聚糖含量，比较各实验组定向诱导为成软骨细胞的情况。
结果与结论：诱导8 d时细胞形态有较明显改变，14 d时具有明显的软骨细胞形态。诱导培养液在诱导4 d时即可检出少量多聚蛋白聚糖，在8 d时浓度出现明显升高，并保持缓慢升高至20 d。在14 d时，诱导的细胞爬片甲苯胺蓝染色可见异染颗粒；Ⅱ型胶原免疫组化明显阳性表现。提示单层高密度接种的骨髓间充质干细胞，在转化生长因子β1等因子作用下能定向诱导为软骨细胞，诱导早期即可能有少量细胞向成软骨细胞分化，8 d时初步具有软骨细胞的形态、功能特征，14 d时成为较成熟的软骨细胞；诱导过程中细胞保持较高的生物活性。

关键词: 干细胞, 软骨细胞, 转化生长因子β1, 胶原Ⅱ型, 多聚蛋白质类

Abstract:

BACKGROUND: The reported time of bone marrow mesenchymal stem cells induced to differentiate into chondrocytes is different. Few studies have observed and compared the cells’ dynamic transformation during the induction process.
OBJECTIVE: To observe the dynamic differentiation and the mature time of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells which were directionally induced to chondroblasts for 8, 11, 14, 17, 20 days.
METHODS: Bone marrow was aspirated from the femur of New Zeal rabbits, and bone marrow mesenchymal stem cells were isolated by gradient centrifugation. After cultivation and amplification, bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3 were directionally induced to chondrocytes by the serum-free medium containing transforming growth factor beta-1. The experiments were divided into five groups according to different induction time points: 8 days, 11 days, 14 days, 17 days, 20 days. Then cellular morphology, toluidine blue staining, type Ⅱ collagen immunohistochemistry, aggrecan content in induction medium, and chondrogenic differentiation in each group were observed and compared.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells had apparently transformed in morphology at 8 days of induction, and presented obvious chondrocytes’ morphology at 14 days. The aggrecan in induction medium could be detected at a low level at 4 days, significantly increased at 8 days, and maintained slow increasing at 20 days. At 14 days, the metachromatic particles could be found by toluidine blue staining, and the collagen type Ⅱ immunohistochemistry was significantly positive in cell climbing slice. Experimental findings indicate that, bone marrow mesenchymal stem cells that are monolayer cultured in a high density can be induced into chondroblasts at the effect of transforming growth factor beta-1 and other factors. There are a few chondroblasts in the early induction process, then cells begin to have chondrocytes morphology and function after induced for 8 days, and may differentiate to mature chondrocytes at 14 days. In addition, they can keep a high biological activity in the induction process.

Key words: stem cells, chondrocytes, transforming growth factor beta-1, collagen type Ⅱ, polyproteins

中图分类号:

R394.2

冯均伟，王跃，吕波，郝鹏，唐六一，朱建新，朱宗东，谭波. 骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞的动态观察[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(36): 6409-6416.

Feng Jun-wei, Wang Yue, Lü Bo, Hao Peng, Tang Liu-yi, Zhu Jian-xin, Zhu Zong-dong, Tan Bo. Dynamically observing chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(36): 6409-6416.

图/表（结果） 9

2.1 骨髓间充质干细胞观察结果 原代骨髓间充质干细胞贴壁生长缓慢，镜下呈圆球形，24-48 h贴壁细胞逐渐增多的，细胞贴壁后逐渐显现出梭形、纺锤形；逐渐形成呈集落生长区，见图1。

12-14 d后基本铺满瓶底，传代后的细胞贴壁较快，半小时即可见有细胞贴壁，24 h后大部分细胞已贴壁、伸展，逐渐出现梭形形态。传代后骨髓间充质干细胞的生长速度也明显快于原代细胞，一般2-4 d即可铺满瓶底。进行第二三代传代时，达到80%-90%融合的T-25培养瓶中的细胞可传3个瓶中，或是传至1个T-75瓶中。传代的骨髓间充质干细胞分布均匀不再呈集落生长，可见沿胞体长轴呈有序同向分布，局部形成旋涡状。苏木精-伊红染色见细胞为单核细胞，形态呈纺锤形、长梭形，见图2。

2.2 骨髓间充质干细胞诱导后镜下观察结果 诱导 24 h后镜下观察见骨髓间充质干细胞呈典型长梭形，排列较规则，与诱导前相比，局部形成较多似漩涡状排列区。

到第5天时细胞密度更大，间隙不明显，形态变得不规则，排列无明显规律。

诱导至第8天时，细胞排列出现近似软骨细胞的马赛克样排列，见图3，100倍镜下组呈多角形、类圆形、短梭形细胞共同存在。

诱导至第11天时细胞在一些生长密集区域均出现复层生长，复层生长的细胞在镜下折光性强，因而显得更亮。14 d时，复层生长较为明显，出现分布不均的白色发亮区，见图4，在200倍镜下，见白色发亮区为呈复层生长的类圆形细胞。

2.3 骨髓间充质干细胞诱导后甲苯胺蓝染色结果 诱导至第8天的细胞形态部分呈类圆形、三角形、多角形改变，部分仍保持长梭形。

诱导至第11天时，细胞大部分已呈类圆形、三角形、多角形改变，夹杂少许短梭形细胞。

诱导至第14天时，细胞以呈类圆形为主，但也可见其间夹杂有短梭形细胞；此时可见散在的紫红色异染颗粒，分布在细胞的外围，见图6。

诱导至第20天时，在细胞较密集复层生长区可见大量细胞周围出现紫红色异染。

2.4 细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组化结果 见图8-10。

对各诱导时间点的细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组化(诱导至14，17，20 d的爬片细胞生长过于密集，采取将培养瓶中细胞消化后再爬片行Ⅱ型胶原免疫组化)。实验未诱导对照组呈阴性表现，见图8。

诱导至第8天时，可见有细胞胞浆出现较淡黄色染色，个别细胞胞浆出现棕黄色改变，见图9。

诱导至11 d时，更多细胞胞浆棕黄色染色，呈弱阳性表现；诱导至14，17，20 d组，Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性表达，细胞形态与软骨细胞相似，见图10。

2.5 诱导不同时间后培养液中多聚蛋白聚糖含量 以硫酸软骨素标准溶液测量吸光度值制作标准曲线，见图11，溶液浓度Y与吸光度值X间的标准曲线方程为：Y=179.25X-12.468(R²=0.996 8)，标准品浓度与吸光度值间具有良好的线性关系。将各组培养液吸光度值应用标准曲线方程计算，采用SPSS 19.0软件做柱状图可见，未使用过的原诱导液未检测出多聚蛋白聚糖成分；诱导第4天培养液中已经含有少量多聚蛋白聚糖，第8天的诱导液中的多聚蛋白聚糖含量升高幅度明显，14，17，20 d增高幅度不明显，见图12。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2011年2月至2012年4月在四川大学华西医院组织工程与干细胞研究室完成。

材料：

兔骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞实验的主要仪器及试剂：

实验动物：健康约3月龄新西兰大白兔8只，雌雄不限，体质量3.0-4.0 kg，由四川省医学科学院，四川省人民医院动物实验中心提供。实验动物机构许可证号：SYXK(川)2008-110。

实验方法：

骨髓间充质干细胞分离与培养：抽取兔股骨骨髓2 mL，加入含2 mL PBS的15 mL离心管，采用密度梯度分离法提取单核细胞^[3]。

在超净工作台内，缓慢移入4 mL密度调整为 1.077 g/mL的percoll分离液上，400×g离心30 min。离心管内液体分为4层，在第1层和第3层之间有一层狭窄的白色云雾层，骨髓间充质干细胞位于该层，吸取云雾层，移入另一只无菌离心管，并加入5 mL L-DMEM洗涤，吹打后300×g离心15 min。

离心后去除上清液，加入含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM，调整细胞浓度为(1.0-2.0) ×10⁸ L^-¹，将细胞悬液接种于25 cm²培养瓶 (T-25)，标记为原代(P₀)，旋松瓶盖，放入含体积分数5%CO₂、37 ℃孵箱内培养。

每日在倒置相差显微镜下观察P₀骨髓间充质干细胞生长情况，在第4天时首次换液，换液时先轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁细胞漂浮，吸去瓶中液体，每瓶加入5 mL含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM。以后每隔2 d换液。在12-14 d后，骨髓间充质干细胞生长至80%-90%融合时，吸出培养液，加入2 mL PBS冲洗瓶底，加入1 mL胰蛋白酶消化细胞，使瓶底均匀分布一层消化液后即可吸出多余液体，镜下观察细胞缩小变圆，逐渐漂浮，两三分钟后大部分细胞脱壁，加入含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM5 mL终止消化，吹打瓶底，使瓶底细胞悬浮，将细胞悬液移入离心管中，200×g离心10 min，弃去上清。加入含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM 6 mL，吹打管底，使细胞分散均匀，平均接种于2个T-25培养瓶内，补充瓶内培养液至5 mL/瓶，标记为P₁ 放入孵箱内培养。

当P₁骨髓间充质干细胞生长达90%融合时，同法传代至1个T-75大瓶中培养，记为P₂。P₂长满后，可传代P₃至3个T-75大瓶中培养，获取足量种子细胞。

骨髓间充质干细胞成软骨细胞诱导：配制成软骨细胞诱导液，含转化生长因子β1 10 μg/L，胰岛素6.25 mg/L，转铁蛋白6.25 mg/L，地塞米松100 nmol/L，维生素C 50 mg/L，牛血清白蛋白1.25 g/L^[4-6]。P₃骨髓间充质干细胞完全铺满瓶底后，将含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基吸净，PBS冲洗2遍，每瓶中加入不含血清的软骨细胞诱导液10 mL，旋松瓶盖，放入含体积分数5%CO₂、37 ℃孵箱内培养。每天镜下观察细胞变化情况、适时照相。每隔两三天更换诱导液1次，并收集每次所换培养液于无菌瓶内，-20 ℃保存，待诱导完成后进行检测其中的多聚蛋白聚糖含量。同时诱导P₃骨髓间充质干细胞爬片。以上细胞放入含体积分数5%CO₂、37 ℃孵箱内培养，每隔3 d换液1次。每天镜下观察细胞变化情况，在8，11，14，17，20 d时倒置相差显微镜下照相，对比不同时间点诱导后细胞的形态变化。

阿利新蓝比色法检测诱导液换液中多聚蛋白聚糖含量^[7-8]：标准曲线制作：称取硫酸软骨素，加盐酸胍缓冲溶液，制作10，50，100，200，300，400 mg/L浓度梯度标准品，加入EP管，每个EP管加入100 μL盐酸胍缓冲溶液，室温振荡30 min；加入100 μL SAT缓冲液，调整pH<2，加入阿利新蓝工作液300 μL，使多聚蛋白聚糖与阿利新蓝结合形成沉淀，振荡混匀，4 ℃反应1 h；高速离心机12 000 r/min离心15 min，弃上清液；加入300 μL DMSO，吹打后室温振荡30 min，再次12 000 r/min离心15 min，弃上清液，洗去多余未结合的阿利新蓝；加入300 μL溶解液重溶阿利新蓝-多聚蛋白聚糖沉淀，吹打混匀后，分别移入96孔板，每个标准品分别作3个复孔，以溶解液为空白对照。

用酶标仪在600 nm波长处测定吸光度值，将测量数据导入Excell，进行分析，制作硫酸软骨素标准曲线方程。再将诱导过程收集的培养液解冻，按换液时间分为4，8，11，14，17，20 d，及未使用的诱导液共7组。

将各组样品分别取3份，每份100 μL于2 mL EP管内，按上述方法进行检测吸光度值，并采用硫酸软骨素标准曲线方程计算培养液中多聚蛋白聚糖浓度。

成软骨细胞爬片甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化检测鉴定：分别在诱导第8，11，14，17，20天时，各取2张诱导细胞爬片，PBS浸洗1 min×3次，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，取出爬片，PBS清洗；取其中一张诱导细胞爬片行甲苯胺蓝染色，另一张诱导细胞爬片行Ⅱ型胶原免疫组化。

Ⅱ型胶原免疫组化操作如下：取出细胞爬片，PBS浸洗3次，每次5 min；40 g/L多聚甲醛固定30 min后，PBS清洗3次，每次5 min，终止固定；将固定后的细胞爬片用蒸馏水配置新鲜的体积分数3%的H₂O₂，避光室温封闭30 min，清除内源性过氧化物酶；蒸馏水洗3次；滴加山羊血清封闭液，山羊血清工作液为PBS按1∶20稀释液，置于湿盒，室温置放30 min，甩去多余液体；滴加适当浓度(1∶100)的一抗(鼠抗兔)，4 ℃过夜；37 ℃复温30 min，PBS洗3次×5 min；滴加生物素化二抗 (1∶200)，置于湿盒，37 ℃ 孵育30 min。以下过程避光操作：PBS洗3次×5 min；滴加适量的三抗(辣根过氧化物酶)37 ℃，孵育40 min。PBS洗3次×5 min；DAB显色3-10 min(镜下观察显色程度，适时自来水冲洗终止)，自来水充分冲洗；苏木精复染2 min，自来水冲洗；体积分数1%盐酸乙醇分色数秒；依次经过体积分数70%，80%，90%，100%乙醇逐级脱水，每次5 min。TO Ⅰ、TO Ⅱ透明各5 min；中性树胶封固，烘干树胶，显微镜下观察。

主要观察指标：骨髓间充质干细胞诱导后倒置显微镜下形态改变，诱导后甲苯胺蓝染色异染颗粒、Ⅱ型胶原免疫组化阳性表达情况，诱导不同时间后培养液中多聚蛋白聚糖的含量。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 19.0软件完成统计处理，实验数据以x(_)±s表示，并作柱状图比较。

讨论

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力较其他组织来源的干细胞更高^[9]，具有取材方便、对机体损伤小、扩增能力强、低免疫原性等优点。但骨髓中干细胞的含量较低，占骨髓有核细胞总数的0.001%-0.01%^[10]，目前分离骨髓间充质干细胞的方法有流式细胞仪分离法、免疫磁珠分离法、密度梯度离心法、全骨髓培养贴壁筛选法等^[11-14]。较多研究采用密度梯度离心法来分离，本实验采用该方法取得良好效果。对于干细胞的鉴定目前为止尚无明确的特异性抗原标志，其表面抗原标志为非单一性，能表达CD29，CD44，CD49a，CD73 (SH3)，CD90，CD105，CD146，CD271等，不表达CD34，CD45，CD11a，CD19和HLA-DR等^[15-17]，有学者认为这可能与其存在多种功能不同的亚型细胞群相关^[16]。因此，获取的细胞能够向不同的间叶组织细胞分化是干细胞与其他细胞相鉴定的重要途径。本实验获取的细胞能定向分化为软骨细胞，也证实获取的细胞为骨髓间充质干细胞。

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响因素较多，如不同的生长因子、地塞米松、细胞接种密度、力学刺激、低氧条件等^[18-19]，同时还要考虑细胞的营养条件。一般认为生长因子、地塞米松是诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的重要因素。能使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的生长因子有多种：转化生长因子β家族、骨形态发生蛋白家族、胰岛素样生长因子、血小板衍生因子等^[20-23]。这些生长因子单独使用和协同作用都能促进向软骨细胞分化。其中转化生长因子β1是发现较早、作用明确的能够使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化、促进细胞外基质合成的生物活性因子，10 μg/L的转化生长因子β1在促进成软骨细胞诱导方面具有良好的效果^[24-25]。细胞种植密度也是诱导成软骨细胞分化的关键。一般认为较高密度的细胞培养有利于细胞与细胞、细胞与基质间相互作用以及细胞之间的信号传递，并能形成低氧浓度的环境，有利于诱导成软骨细胞。较早的研究中，Johnstone等^[26]首先采用将干细胞离心后形成高密度的小球，再将形成的高密度细胞球进行诱导，成功诱导出软骨细胞。在细胞浓度与诱导因子作用比较方面，Park等^[23]在OPF水凝胶3D环境中行骨髓间充质干细胞成软骨细胞诱导，发现1×10¹⁰ L^-¹的细胞接种浓度能获得较强的Ⅱ型胶原基因表达，且发现转化生长因子β1促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用比细胞密度更重要。

文章中采用单层培养方式诱导细胞，为进一步进行组织工程方法修复软骨缺损获取种子细胞提供可能，但单层培养细胞密度相对较低，需要在细胞完全融合，形成诱导的有利条件时进行诱导。

骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导成功的检测，主要采用Ⅱ型胶原免疫组化、甲苯胺蓝染色及阿利新蓝比色法测量诱导液中多聚蛋白聚糖。Ⅱ型胶原是软骨细胞分泌的特异性物质之一^[27]，Ⅱ型胶原免疫组化也成为鉴定软骨细胞的主要标准。

作者这次实验中，诱导至14 d时Ⅱ型胶原免疫组化为阳性结果。软骨细胞产生的细胞外基质含糖胺聚糖，甲苯胺蓝染色法可将酸性的糖胺聚糖染成紫红色^[28]，在细胞爬片可见异染颗粒呈紫红色^[29]，也具有一定的鉴定软骨细胞的意义。骨髓间充质干细胞诱导至第11天时尚未见到异染颗粒的产生，诱导至第14天时，则可见到异染颗粒的存在，并且在17，20 d进行的甲苯胺蓝染色可观察到这种异染颗粒逐渐增大，形成异染区。这说明骨髓间充质干细胞诱导至第14天时已具有较成熟的软骨细胞功能，并逐渐增强。此外，在不同诱导时间培养液内检测出多聚蛋白聚糖成分，能证实诱导出软骨细胞，其浓度的增高则能说明诱导的软骨细胞数量增加或功能增强。诱导第4天已经有少量的多聚蛋白聚糖合成；诱导至8 d，培养液中的多聚蛋白聚糖有明显升高，此后至第20天一直保持缓慢增高趋势。这说明诱导早期即有分化出成软骨细胞，并随诱导时间增加而产生的软骨细胞越多，这与形态观察的结果是一致的。在诱导过程中还发现细胞能继续增殖形成复层生长，既往的一些研究也有类似的结果^[30]。这种现象证明诱导中的细胞具有较高的生物活性。

骨髓间充质干细胞诱导为成软骨细胞的时间，在不同的研究报道中差异较大，有研究发现诱导7 d即有阳性表达^[31-32]，而多数研究认为14-21 d更明显的阳性表达^[33-35]，这可能与上述各种影响条件、因素的差异有关。对诱导时间的研究，意义在于了解诱导过程中骨髓间充质干细胞发生的生理变化，了解成软骨细胞功能成熟时的形态学、生物学特征性表现，从而有助于对诱导成熟时间的判断^[36-38]。

综上所述，单层高密度接种的骨髓间充质干细胞，在含转化生长因子β1等条件下能定向诱导为软骨细胞，诱导早期即可能有少量细胞向成软骨细胞分化， 8 d时初步具有软骨细胞的形态、功能特征，14 d时成为较成熟的软骨细胞；诱导过程中细胞保持较高的生物活性。

骨髓间充质干细胞体外诱导成软骨细胞的动态观察

Dynamically observing chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

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