胚胎干细胞移植治疗脑血管疾病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：胚胎干细胞移植是否能够成为脑血管疾病治疗有效的方法已成为目前研究的热点。
目的：探讨胚胎干细胞分化神经前体细胞移植治疗脑血管疾病的效果及可行性。
方法：分别建立帕金森病、缺血性脑损伤以及血管性痴呆大鼠模型，并进行胚胎干细胞体外培养，诱导分化为神经前体细胞，将胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入相应脑血管疾病模型大鼠脑内，观察脑血管病变大鼠的旋转行为学变化、脑组织病理变化以及海马结构的变化和神经细胞数目的变化。
结果与结论：胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入帕金森病大鼠脑内后，阿朴吗啡诱发的旋转次数逐渐减少，呈下降趋势，纹状体多巴胺的含量明显增高。胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入缺血性脑损伤大鼠脑内后，能够长期存在于脑内，并迁移、分布于受损的海马，构成海马结构，进一步分化为神经元，并且受损海马内的神经细胞数量明显增加。说明移植的胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的胚胎干细胞可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆功能，增强神经的可塑性，诱导自身定向迁移并分化为成熟神经元。

关键词: 器官移植, 器官移植学术探讨, 胚胎干细胞, 脑血管疾病, 移植, 干细胞, 神经前体细胞, 帕金森病, 脑缺血, 血管性痴呆

Abstract:

BACKGROUND: Whether embryonic stem cell transplantation can be an effective method for treatment of cerebrovascular disease has become a hot spot.
OBJECTIVE: To investigate the effect and feasibility of embryonic stem cell-differentiated neural precursor cell transplantation for the treatment of cerebrovascular disease.
METHODS: The rat models of Parkinson’s disease, ischemic brain injury and vascular dementia were established and the embryonic stem cells were in vitro cultured and induced to differentiate into the neural precursor cells. The embryonic stem cell-differentiated neural precursor cells were transplanted into the rat brains with corresponding cerebrovascular disease, and then the rotational behavior changes, pathological changes in the brain tissue as well as changes in the hippocampal structure and the number of nerve cells in the rats with cerebrovascular disease were observed.
RESUTLS AND CONCLUSION: After the embryonic stem cell-differentiated neural precursor cells transplanted into the rat brains with Parkinson’s disease, the frequency of apomorphine-induced rotation was decreased and in the downward trend, while the striatal dopamine levels were significantly increased. After transplantation of embryonic stem cell-differentiated neural precursor cells into the rat brains with ischemic brain injury, the cells could survive for a long time, and then migrated and distributed in the injured hippocampus to form the hippocampal structure; the cells could differentiate into neurons, and the number of nerve cells in the injured hippocampus was significantly increased. The results indicate that the transplanted glial cell line-derived neurotrophic factor gene-modified embryonic stem cells can improve the learning and memory function of vascular dementia rats, enhance neural plasticity, and induce self-directed migration and differentiation into mature neurons.

Key words: organ transplantation, organ transplantation academic discussion, embryonic stem cells, cerebrovascular diseases, transplantation, stem cells, neural precursor cells, Parkinson’s disease, cerebral ischemia, vascular dementia

中图分类号:

R318

马向薇. 胚胎干细胞移植治疗脑血管疾病[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.022.

Ma Xiang-wei. Embryonic stem cell transplantation for treatment of cerebrovascular diseases[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.022.

图/表（结果） 1

2.1 胚胎干细胞移植治疗帕金森病闫晓明等^[9]将胚胎干细胞诱导分化为神经前体细胞后移植入帕金森病模型大鼠纹状体中，并进行深入研究。将30只帕金森病模型大鼠随机分为2组，每组15只大鼠，其中实验组组帕金森病大鼠给予移植胚胎干细胞分化的神经前体细胞治疗，另一组大鼠则给予注射生理盐水设立对照。移植后进行大鼠行为学检测以及纹状体内多巴胺和3，4-二羟基苯乙酸含量的检测。移植后第2周、第4周各进行一次大鼠的旋转行为学变化检测，腹腔注射阿朴吗啡溶液，5 min后用大鼠旋转行为测试仪连续记录受试大鼠40 min的旋转圈数，并进行统计分析。移植后大鼠处死后，即刻采用高效液相色谱法测定大鼠移植侧脑纹状体多巴胺和3，4-二羟基苯乙酸含量。

研究结果显示，胚胎干细胞分化神经前体细胞移植前2组大鼠的行为学变化无明显差异，实验组大鼠旋转行为为(10.38±1.51)圈/min，对照组大鼠旋转行为为(10.28±1.61)圈/min；移植后2周，胚胎干细胞分化神经前体细胞移植治疗帕金森病大鼠旋转行为为(8.63±0.96)圈/min，移植后4周，帕金森病大鼠旋转行为为(7.01±0.61)圈/min；而对照组帕金森病大鼠移植后2周旋转行为为(10.15±1.58)圈/min，移植后4周旋转行为为(9.85±1.26)圈/min。胚胎干细胞分化神经前体细胞移植至帕金森病大鼠脑内后，随着时间的延长，阿朴吗啡诱发的旋转次数逐渐减少，呈下降趋势，且移植前后旋转行为学变化具有显著性意义 (P < 0.01)。胚胎干细胞分化神经前体细胞移植至帕金森病大鼠脑内后，纹状体内多巴胺含量为(2.64±0.52) mmol/g，3，4-二羟基苯乙酸含量为(1.27±0.21) mmol/g，而生理盐水对照组帕金森病大鼠纹状体多巴胺含量为(0.87±0.03) mmol/g，3，4-二羟基苯乙酸含量为(0.32±0.01) mmol/g，二者的结果差异具有显著性意义(P < 0.01)。

唐军等^[13]同样对胚胎干细胞分化神经前体细胞移植治疗帕金森病大鼠的旋转行为学进行了实验研究，将6-羟多巴胺双点微量注射于大鼠左侧大脑建立帕金森病模型大鼠，培养大鼠胚胎干细胞以及无血清神经诱导，分化为神经前体细胞后移植至脑内，移植后1周给予腹腔注射阿朴吗啡，观察帕金森病大鼠行为学变化。结果显示，胚胎干细胞分化神经前体细胞移植帕金森病大鼠纹状体后3，4，5，6周，大鼠旋转次数较移植前明显减少，每周检测旋转次数与移植前比较均明显减少，且差异有显著性意义(P < 0.01)；移植后3-6周，每次检测旋转次数的比较也均有明显差异，且差异有显著性意义(P < 0.05)。

贡志刚^[14]在实验研究中对胚胎干细胞分化神经前体细胞移植帕金森病大鼠进行了旋转行为学分析。结果显示，移植后2周，40%帕金森病大鼠出现旋转次数减少，移植后6周时，帕金森病大鼠旋转次数与移植前相比较下降25.8%，并且逐渐呈下降趋势。

帕金森病是老年中枢神经系统退行性疾病之一，对帕金森病发病机制以及治疗方法的研究依赖于成功的帕金森动物模型的建立，目前，采用的帕金森病模型建立方法主要有6-羟多巴胺大鼠颅内注射损毁黑质纹状体系统，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶动脉注射损毁黑质纹状体神经元，此外还有三价铁离子模型、机械损伤模型、病毒感染模型、黑质免疫损伤模型等^[15-18]。

帕金森病目前的治疗方法药物治疗、外科治疗可以在一定程度上改善患者的震颤、强直等症状，但由于该病主要病理改变是中脑黑质中多巴胺能神经元渐进性变性坏死，导致神经递质多巴胺的缺乏，从而引起锥体外系功能失调，行为障碍，故上述治疗方法无法阻止疾病的进展。病损修复治疗被认为是解决问题的根本办法。文章研究显示胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入帕金森病大鼠脑内，纹状体多巴胺和3，4-二羟基苯乙酸含量明显升高，表明移植的神经前体细胞在大鼠体内分化成多巴胺神经元并能分泌相关递质，从而发挥治疗的作用。

2.2 胚胎干细胞移植治疗脑缺血马杰等^[10]对胚胎干细胞分化为神经前体细胞移植治疗小鼠缺氧缺血性脑损伤进行了研究，实验对象为7 d龄小鼠，建立缺氧缺血性脑损伤小鼠模型，并将胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入小鼠损伤侧脑室，同时设立对照组，给予移植磷酸盐缓冲液进行对比分析。对2组移植小鼠进行脑组织病理学、聚合酶链式反应、X-gal染色以及免疫荧光组织化学检测。

研究结果显示，脑组织聚合酶链式反应检测可见胚胎干细胞衍生细胞内有lacZ基因表达，在移植后的脑组织内也可见lacZ基因表达，但在磷酸盐缓冲液移植的脑组织内未见lacZ基因表达，表明胚胎干细胞衍生细胞存在于移植后的脑组织中。脑组织病理学检测可见，移植8个月后，磷酸盐缓冲液移植后的脑组织内右侧海马细胞明显减少，出现神经细胞变性坏死、胶质细胞反应性增生的病理改变，而胚胎干细胞分化神经前体细胞移植后小鼠，右侧海马神经细胞密度明显高于磷酸盐缓冲液移植后，与正常神经细胞密度相似。移植后8个月，X-gal染色以及免疫荧光组织化学检测可见，X-gal染色阳性的蓝绿色胚胎干细胞衍生细胞分布于小鼠脑内，主要存在于海马，并构成海马结构，免疫荧光组织化学检测见神经丝蛋白阳性细胞主要分布于海马，并构成海马结构。胚胎干细胞分化的神经前体细胞移植入缺氧缺血性脑损伤小鼠脑内后，长期存在于脑内，并迁移、分布于受损的海马，构成海马结构，经进一步免疫荧光检测可分化为神经丝蛋白阳性的神经元。

杨敏等^[11]也对胚胎干细胞分化为神经前体细胞移植治疗小鼠缺氧缺血性脑损伤进行了研究，建立缺氧缺血性脑损伤小鼠模型，并将胚胎干细胞进行体外培养和分化，将胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入小鼠损伤侧脑室，对小鼠进行脑组织病理学、聚合酶链式反应、X-gal染色以及免疫荧光组织化学检测。结果显示，小鼠胚胎干细胞在特定条件下，能成功诱导分化为神经前体细胞，细胞移植后，经聚合酶链式反应检测和X-gal染色发现能长期存在于脑内，并迁移、分布于受损海马，构成海马结构，经进一步免疫荧光检测发现可分化为神经元，同时病理学检测亦发现细胞移植后受损海马内的神经细胞数量明显增加。

杨建华等^[12]同样对胚胎干细胞分化为神经前体细胞移植治疗小鼠缺氧缺血性脑损伤进行了研究，实验利用缺氧缺血性脑病小鼠模型，将小鼠胚胎干细胞分化为神经前体细胞移植至缺氧缺血性脑病小鼠脑内，移植后观察12周，应用酶学的方法检测LacZ基因标记的经诱导的胚胎干细胞在脑内的存活和迁移情况。结果显示，胚胎干细胞分化神经前体细胞在中枢神经系统损伤区能够存活，并进行长距离的迁移，与周围组织整合。

海马是大脑内与学习记忆相关的重要部位，研究表明，哺乳动物的海马对缺氧缺血损伤非常敏感，因此，缺血缺氧性损伤，必然导致思维能力、记忆能力等下降。因此，神经前体细胞在缺氧缺血性脑损伤海马内的生存、分化，可能为神经前体细胞移植治疗缺氧缺血性损伤，改善恢复小鼠学习和记忆功能的机制之一。

胚胎干细胞分化神经神经前体细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤的确切机制尚不清楚，缺氧缺血性脑损伤的主要病理改变在海马、额叶皮质和枕叶皮质。有实验研究发现，在体外由神经前体细胞分化来的神经元之间可以形成有功能的突触联系；将神经前体细胞移植至大鼠的海马，由移植细胞分化来的神经元和宿主神经元之间亦可形成功能性突触联系。因此，移植入脑内的神经前体细胞分化为神经元，替代海马损伤或坏死的神经细胞而重建神经通路，可能是其发挥治疗作用的机理之一。另外，海马损伤后，一些神经营养因子的表达上调，这些神经营养因子可能有助于移植的神经前体细胞分化或成熟，从而使其发挥治疗作用。移植细胞的迁移分化亦与受损的脑组织所释放的各种生物信使因子密切相关^[19-22]。

2.3 胚胎干细胞移植治疗血管性痴呆呙登俊等^[8]对胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的胚胎干细胞侧脑室移植对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及其脑组织海马区大脑发育调节蛋白表达的影响进行了研究。实验采用基因克隆技术将胶质细胞源性神经营养因子基因或无义cDNA经过质粒连接后转染大鼠胚胎干细胞，构建胶质细胞源性神经营养因子基因工程细胞或对照基因工程细胞。建立血管性痴呆大鼠模型，分别注入胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的胚胎干细胞、对照基因工程细胞、胶质细胞源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子生理盐水进行比较研究。

研究结果显示，移植胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的胚胎干细胞后3 d，侧脑室周围可见较强绿色荧光分布，治疗后7 d强度减弱，治疗后10 d该处绿色荧光消失，在海马齿状回可见较弱绿色荧光并与罗丹明标记的红色荧光共定位。移植对照基因工程细胞后3 d，仅在在侧脑室周围见绿色荧光分布。且移植胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的胚胎干细胞后血管性痴呆大鼠学习记忆能力明显改善，且海马组织内大脑发育调节蛋白mRNA和大脑发育调节蛋白的表达水平与其它大鼠相比较明显增高。研究表明通过向侧脑室内移植胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的胚胎干细胞可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆功能，增强神经的可塑性，诱导自身定向迁移并分化为成熟神经元。

中枢神经系统的可塑性是治疗血管性痴呆的理论基础，它是指神经系统受损后的结构重塑和功能重建，包括神经干细胞的迁移和分化、神经元突起的伸展以及新突触的建立。突触可塑性被认为是学习记忆的神经生物学基础，树突棘的重塑则被认为是成熟神经元突触结构可塑性最显著的特性。成熟神经元的树突棘内有大脑发育调节蛋白表达，是一种与脑发育相关的蛋白。文章研究显示，胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的胚胎干细胞移植至血管性痴呆大鼠脑内，海马组织的大脑发育调节蛋白表达明显升高，提示大脑发育调节蛋白可能参与了胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的胚胎干细胞移植治疗血管性痴呆的机制，胶质细胞源性神经营养因子可能通过增强突触的可塑性来发挥治疗血管性痴呆的作用。

神经营养因子具有肯定的神经营养作用，能促进受损神经组织的修复，是治疗血管性痴呆的新途径。但神经营养因子为大分子蛋白，静脉给药难以通过血脑屏障，而且成本较高，极大地限制了其临床应用^[23]。若直接将纯化的神经营养因子注入局部脑组织或脑室内，虽能发挥脑保护作用并促进受损神经组织的修复，但一次注射只能维持短效作用，不宜常规实施^[24]。有研究者尝试向干细胞导入神经营养因子基因序列以构建基因工程细胞，并将其植入大脑内以达到治疗痴呆的目的，取得了较好的疗效^[25]。目前常用的干细胞有神经干细胞和骨髓间充质干细胞^[26]，二者均为成体干细胞，其增殖能力不如胚胎干细胞，胚胎干细胞为全能干细胞，在体外增殖快，基因修饰时转染效率高，因此采用胚胎干细胞来构建基因工程细胞更为可行。

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引言

胚胎干细胞是由哺乳动物早期胚胎分离克隆出来的一类未分化的二倍体细胞，可从着床前囊胚期内细胞团和早期胚胎原始生殖嵴的胚胎生殖细胞中分离并进行体外培养。它们能分化成为机体的任何组织细胞，并具有形成嵌合体的能力^[1]。

由于胚胎干细胞是发现较早的一种干细胞，也是惟一具备向几乎所有类型细胞分化能力的细胞，在适宜条件下保持未分化状态并能无限扩增，可为应用研究提供无限的细胞来源。胚胎干细胞在遗传上具有可操作性，即导入外源基因、报告基因或标志基因、诱导基因突变、基因打靶或导入额外的原有基因使之过度表达等，利用该特性可制作各种实验模型并进行各种基因功能分析。胚胎干细胞能被诱导分化为构成机体的任何一种细胞类型，可用于临床细胞、组织和器官的修复和移植治疗^[2-3]。

1998年，美国Thomson从做试管婴儿剩余的胚胎中分离出人胚胎干细胞，并在体外培养成功^[4]。迄今为止，在美国国立卫生研究院注册的人胚胎干细胞株已有70多株，胚胎干细胞具有良好的自我更新能力和发育全能性，能够定向分化细胞为某些特定细胞，如多巴胺能神经元，神经前体细胞、胰腺细胞等，从而为脑血管疾病、糖尿病等提供了一种新的研究方法和治疗措施^[5]。

脑血管疾病是目前最常见的疾病之一，其发生率和死亡率均较高，且多伴有脑部特定区域神经的不可逆性损伤，引起语言表达障碍以及肢体活动障碍，严重者导致瘫痪和记忆力减退以及思维能力的下降，甚至痴呆。而神经细胞损伤多为不可逆性，因此，药物治疗脑血管疾病的效果并不理想，胚胎干细胞能够分化为神经前体细胞，移植后能够改善脑血管疾病引起的各种临床症状，但是尚未有大量的研究报道，对胚胎干细胞诱导分化神经前体细胞移植治疗脑血管疾病仍处于实验研究的阶段，但是具有重要的意义。

文章对胚胎干细胞分化为神经前体细胞移植治疗脑血管疾病，包括胚胎干细胞分化为神经前体细胞移植治疗帕金森病，胚胎干细胞分化为神经前体细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤以及胚胎干细胞分化为神经前体细胞移植治疗血管性痴呆进行研究分析，为胚胎干细胞移植治疗脑血管疾病的机制及效果研究提供可参考的实验数据信息。

材料方法

讨论

诱导胚胎干细胞向不同方向分化是将其应用于临床的前提，因为如果不在体外进行分化的诱导，当将胚胎干细胞移植入体内后，便会产生畸胎瘤。在该领域，研究人员开展了大量的研究，以明确决定细胞分化的基因表达时空关系和外界刺激因子，在此基础上定向诱导产生需要的功能细胞或器官，用于临床替代治疗。

多种因素均能够对胚胎干细胞的分化造成影响，其中包括胚胎干细胞自身的因素，也包括外界的诱导因子及环境因素，因此，胚胎干细胞的定向分化是一个相当复杂的过程，需要多种因素综合作用，才能够获得特定的细胞。

目前，大部分关于胚胎干细胞的研究均以小鼠作为研究对象，因此，对于胚胎干细胞定向分化的研究所得到的有效诱导因子大部分是针对小鼠的。然而，研究发现，用于诱导小鼠胚胎干细胞定向分化的因子对于诱导人类胚胎干细胞向特定细胞的分化并不是都有效，比如在人类胚胎干细胞中，苯丙酸诺龙和转化生长因子只能诱导中胚层的形成，视黄酸、表皮生长因子、骨形成蛋白4和碱性成纤维细胞生长因子促使细胞向外胚层和中胚层分化，然而神经生长因子和肝细胞生长因子促使人类胚胎干细胞向3个胚层的细胞分化，骨形成蛋白4还能诱导人类胚胎干细胞发育为滋养层的细胞。

尽管有许多伦理上的限制，还是有很多科研人员展开了对人类胚胎干细胞临床应用的研究，在细胞替代治疗方面，随着研究的深入，目前已经能够获得一系列特异性细胞，比如神经前体细胞。

胚胎干细胞能经诱导产生神经前体细胞，再分化为有功能的神经元和神经胶质细胞。如果把胚胎干细胞直接作为移植材料，有形成畸胎瘤的危险。神经前体细胞包括神经干细胞和神经祖细胞，既有增殖、分化潜能，又能避免胚胎干细胞生成畸胎瘤的危险，因此，是神经细胞移植的理想材料。

在药物开发方面，人类胚胎干细胞可以作为药物的检验工具。药物的一些与人类密切相关的指标必须进行临床前的体外测定，包括靶向识别和确认、药品成分效果的筛选，这样才能确保药物的安全性。由于使用普通细胞以及动物细胞存在种种弊端，一些新药对人类的各种影响往往直到临床试验才能够获得。人类胚胎干细胞以其较高的复制能力，能够为药物的检验源源不断地提供试验对象。此外，由于利用人类胚胎干细胞可以获取一些特异性的细胞，因此基因的多样性和不同人的差异性对于药物不同的反应也可以在临床前得到解决。所以，人类胚胎干细胞能够实现药物研发程序的彻底改革。

总之，以上的实验研究结果说明胚胎干细胞可以作为稳定的细胞来源用于帕金森病、缺血性脑损伤以及血管性痴呆等脑血管疾病的移植治疗，而其治疗机制尚未完全清楚，有待于专家学者的进一步深入研究，但胚胎干细胞移植治疗脑血管疾病已经展现的巨大的应用前景。