2.1 去细胞肌肉生物支架的大体观察 采用两化学方法构建的去细胞肌肉生物支架外形大体与构建前的肌肉组织相同，体积有所缩小，颜色变浅变淡，呈半透明的磨玻璃样，见图1。物理冻融法构建的去细胞肌肉生物支架体积无明显变化，颜色呈淡红色，基本不透明。

2.2 苏木精-伊红染色观察各组去细胞肌肉生物支架 化学方法组、改良化学组去细胞后遗留纵向排列大致平行、交织成网的结构，化学方法组组织结构连续性较改良化学组差，间隙大小及走向大致相同，无残留肌细胞，见图2。物理冻融组去细胞肌肉生物支架残留纤维束较粗，间隙较小，有部分残留死亡的肌细胞，横纹消失，结构完整性破坏。

2.3 Masson染色观察各组去细胞肌肉生物支架 化学方法组、改良化学组去细胞肌肉生物支架原位去细胞处理后残留胶原纤维大致呈平行走行，肌肉纤维基本完全清除，余留大小大致相同的空隙。物理冻融组去细胞肌肉生物支架残留骨架略成波浪样平行，有片状残留肌纤维，空隙大小不均，见图3。

2.4 荧光显微镜观察各组去细胞肌肉生物支架内骨髓间充质干细胞及细胞计数 荧光标记后的第3代骨髓间充质干细胞培养24 h后贴壁良好，呈梭形、星形或多角形，边界光滑清晰；细胞核呈圆形或椭圆形的均匀、柔和的淡蓝色。支架内的细胞透过去细胞肌肉生物支架于接种后7，14 d均可见其圆形及椭圆形淡蓝色细胞核及注射点的少量的高亮的死细胞，颜色较未接种支架内的荧光标记细胞稍浅，见图4。

细胞存活计数结果示，骨髓间充质干细胞在去细胞肌肉生物支架中大量存活，第1天各组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；第7天，化学方法组、改良化学组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，两组明显高于物理冻融组(P < 0.01)；第14天，化学方法组与物理冻融组、改良化学组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，物理冻融组低于改良化学组(P < 0.05)，见表1

综上可以认为以化学方法构建的去细胞肌肉生物支架接种骨髓间充质干细胞存活数多于物理冻融方法，两种化学方法之间细胞存活数差异无显著性意义。

2.5 扫描电子显微镜观察各组去细胞肌肉生物支架 见图5。

各组去细胞肌肉生物支架均可见良好的三维空间结构，内部管径结构直径20-30 μm，物理冻融组纤维条索结构旁可见残余肌肉组织，骨髓间充质干细胞能够贴附在去细胞肌肉生物支架内表面生长，细胞间互有接触，细胞表面亦可见不规则突起，细胞与支架能在体外相容，并存活至少2周。

2.6 各组去细胞肌肉生物支架生物力学测试结果 物理冻融组最大载荷测试及最大拉伸位移均大于化学方法组(P < 0.05)，与改良化学组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，3组弹性模量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.7 各组去细胞肌肉生物支架的孔隙率 3组孔隙率比较，物理冻融组孔隙率(87.86±1.03)%低于化学方法组(95.52±2.67)%及改良化学组(92.44±0.78)%(P < 0.05)，后两组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

设计：随机对照实验。
时间及地点：于2011年11月至2012年6月在解放军兰州军区兰州总医院骨研所完成。
材料：
主要试剂、仪器：
Main reagents and instruments:

实验动物：SD大鼠6只，雌雄不拘，体质量260- 289 g，平均274 g，由兰州大学SPF实验动物中心提供，动物生产许可证：SCXK(甘)2009-0004号，在SPF条件下饲养实验大鼠，饲喂全价小鼠颗粒饲料，自由采食和饮水。
实验方法：
去细胞肌肉生物支架的构建及分组：6只SD大鼠，采用3%戊巴比妥钠过量处死，体积分数75%乙醇浸泡 30 min后，沿脊柱后正中线剪开皮肤、筋膜、暴露肌肉，在脊柱两侧取梭形椎旁肌，小心去除筋膜及残余肌腱后将梭形肌修剪成3段，共36小段，随机分配为3组按照不同方法构建去细胞肌肉生物支架。
化学方法组^[3-4]：①第1步：浸泡于蒸馏水中，置于汽浴恒温振荡器以50 r/min速度、调节水温37 ℃摇48 h。②第2步：浸泡于3% TritonX-100溶液中，置于汽浴恒温振荡器以50 r/min速度、调节水温37 ℃摇48 h。③第3步：重复第1步内容。④第4步：浸泡1% SDS溶液中，置于汽浴恒温振荡器以50 r/min速度、调节水温37 ℃摇48 h 。⑤第5步：灭菌后PBS振荡漂洗24 h，-20 ℃冻存备用。
物理冻融方法^[7]：将竖脊肌浸于3%NaCI溶液中 10 min后，继浸于液氮(-196 ℃)中至温度平衡，取出后在蒸馏水复温至溶冰，重复浸于液氮中至温度平衡，取出后移至生理盐水中复温、PBS漂冼后，轻轻挤压肌条以排出肌浆。
改良化学方法：参考Mligiliche 等^[3-4,8]的方法，结合本实验室情况作如下改良：①第1步：20倍肌肉体积三蒸水浸泡，水平摇床50 r/min振荡24 h。②第2步：10倍肌肉体积 1% SDS浸泡，恒温摇床37 ℃ 50 r/min振荡24 h。③第3步：20倍肌肉体积三蒸水浸泡，水平摇床50 r/min振荡24 h。④第4步：10倍肌肉体积3%TritonX-100浸泡，恒温摇床37 ℃ 50 r/min振荡24 h。以上各步骤均采用每隔8 h换同样液体，同时清除漂浮物及杂质。⑤第5步：20倍PBS浸泡，水平摇床50 r/min振荡24 h，再冲洗3遍后，-20 ℃保存备用。
去细胞肌肉生物支架复合冷灭菌：接种前进行复合冷灭菌(即采用低剂量射线辐照加乙醇灭菌)：⁶⁰Coγ射线辐照剂量10 kGy达到合格灭菌标准。移植前分别浸泡体积分数75%乙醇5 min、PBS及无血清DMEM漂洗 30 min 2次后置于培养皿中，备用。
苏木精-伊红染色：将去细胞肌肉生物支架常规构建石蜡切片、苏木精-伊红染色，光镜下观察各组组织内部走行及排列顺序，以及肌细胞清除情况。
Masson染色：将石蜡切片脱水，Weigert铁苏木精漂染5-10 min，流水冲洗数分钟，1%盐酸乙醇分化，流水冲洗数分钟，丽春酸性品红染5-10 min，蒸馏水洗，1%磷钼酸中染1-3 min，不水洗直接入亮绿5 min，1%冰醋酸处理数分钟，依次过体积分数95%、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果判断：胶原纤维呈绿色，肌纤维呈红色。
骨髓间充质干细胞的提取：在SD大鼠椎旁肌制备去细胞肌肉生物支架之前提取，具体方法：6只SD大鼠用3%戊巴比妥钠过量处死，备皮后体积分数75%乙醇浸泡15 min置于提前紫外照射30 min的超净工作台，剪开皮肤、钝性分离筋膜、肌肉。分别取去掉两端的胫骨、股骨骨干置于无血清DMEM中，用5 mL针抽取反复冲洗骨髓腔至骨干由粉红变淡白为止。过20 μm细胞筛后加入60% Percoll工作液离心(1500 r/min，10 min)吸出细胞层，PBS洗涤(1000 r/min，5 min)2次后接种于含体积分数10%-15%血清的完全培养基后分皿培养，在恒温37 ℃含体积分数5% CO2孵箱里贴壁培养。3 d换液1次，7-10 d细胞融合大于80%时进行一次传代。以表面标记物检测鉴定为干细胞。
接种细胞于各组去细胞肌肉生物支架：取第3代对数生长期骨髓间充质干细胞接种前24 h进行荧光Hoechest33342(工作终浓度2 mg/L)染色标记^[9]，细胞计数控制密度约1×10⁵，用微量注射器吸取细胞悬液约0.5 mL，多点注射入3组去细胞肌肉生物支架，并留针1 min。置孵箱20 min后，沿培养皿周围轻轻加入全培养基10 mL，继续孵育培养。
细胞存活计数：每次观察前将各组去细胞肌肉生物支架重新置于新培养皿中，缓慢加入8-10 mL 含体积分数12%胎牛血清的DMEM，以排除背景干扰。分别观察3组1，7，14 d荧光标记的细胞存活情况。随机抽取视野上、中、下各4处点共12点作为观察点，在荧光显微镜40倍物镜视野下拍照并记录细胞数纳入统计学处理。
扫描电子显微镜观察：将植入骨髓间充质干细胞共培育14 d后的去细胞肌肉生物支架常规3%戊二醛固定，PBS(pH值7.2)清洗后，乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯中间液过渡后临界点干燥仪干燥，粘贴样本放入离子溅射仪镀金膜后入镜观察。
生物力学测试：静载荷拉伸实验参数控制：在室温条件下进行，试样夹持长度3 mm，拉伸速度2 mm/min，得到各组去细胞肌肉生物支架的最大载荷、最大拉伸长度及弹性模量纳入统计学分析。
孔隙率测定：完成以上检测后，将剩余各组去细胞肌肉生物支架低压真空冷冻干燥48 h，修剪成大致相同体积(V₀)，测量并记录其质量。将一定质量(m₀)的去细胞肌肉生物支架，浸入无水乙醇中至饱和，取出拭去表面液体称质量(m₁)，计算各组相对孔隙率，并作统计学处理。

主要观察指标：各组去细胞肌肉生物支架的孔隙率、组织学及生物力学检测结果。
统计学分析：所有数据采用SPSS 19.0统计软件处理，数据以x(_)±s表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，计数资料采用χ2检验,P < 0.05为差异有显著性意义。

1   目前构建去细胞肌肉生物支架的方法有化学方法、物理冻融法和冷冻法。比较化学方法、物理冻融法和改良化学方法构建去细胞肌肉生物支架的组织学和生物力学的差异。
2   实验综合考量清除肌细胞及尽量多保留外基质，采用10倍肌肉组织体积的1%SDS及3%TritonX- 100对化学法进行优化改良，增加其用量，缩短反应时间，保持反应温度，并间隔8 h换液保持其浓度，保证有效时间内清除肌细胞；20倍蒸馏水低渗破膜时改用室温条件下水平摇床，既降低反应温度和速度，减少细胞外基质的破坏，又减少对同一仪器长时间使用的耗损。
3   不足：采用改良化学方法制备去细胞肌肉生物支架，与物理冻融和化学方法在组织学，生物相容性、细胞存活数、孔隙率、生物力学方面比较。但支架的分子构成、体内生物相容性及移植体内后的降解率仍需进一步研究。

良好的生物支架应有如下指标：生物相容性好、高孔隙(90%左右)、机械强度适宜、可塑性强、稳定性高。构建去细胞肌肉生物支架的物理冻融法与化学法各有优劣：物理冻融法所需时间短，更好保留了细胞外基质的纤维连接蛋白及层粘蛋白，机械强度相对较高，最大荷载（1.72±0.26）N，但质脆而缺乏弹性，肌细胞清除不彻底，孔隙率(87.86±1.03) %及内部空间相对低，免疫原性较大，这也是造成种植细胞存活数（11.58 ± 4.27）个偏低的原因之一；而化学方法能彻底清除肌细胞，免疫原性低，孔隙率更高（95.52±2.67）%，但构建周期长，化学去污剂变性去除肌细胞的同时对种子细胞贴附生长相关的细胞外基质也有不同程度破坏，故本实验化学方法组第14天荧光细胞计数（14.33 ± 3.34）个相对改良化学组下降明显。化学方法变性肌肉组织，采用去污剂SDS及TritonX-100达到蛋白分离作用。TritonX-100 与SDS作用机制相似，通过阴离子吸附在蛋白质疏水区，形成胶束结构，使蛋白质分子以复合物的形式进入水相，达到蛋白分离效果。综合考量清除肌细胞及尽量多保留外基质，本实验采用10倍肌肉组织体积的1%SDS及3%TritonX-100对化学法进行优化改良，增加其用量，缩短其反应时间，保持反应温度，并间隔8h换液保持其浓度，保证有效时间内清除肌细胞；20倍蒸馏水低渗破膜时改用室温条件下水平摇床，一是降低反应温度和速度，减少外基质的破坏，也可以减少同一仪器的长时间使用的耗损。