骨髓间充质干细胞促进胰岛再生的作用与研究现状

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现，骨髓间充质干细胞移植入糖尿病大鼠后能够降低其血糖。
目的：综述骨髓间充质干细胞在促进胰岛再生方面的作用与研究现状。
方法：应用计算机检索2003年7月至2011年12月PubMed数据库相关文章，检索词为“bone marrow derive mesenchymal stem cell，islet cells”，并限定文章语言种类为English。同时计算机检索2003年7月至2011年12月万方数据库相关文章，检索词为“骨髓间充质干细胞，胰岛细胞”，并限定文章语言种类为中文。最终纳入符合标准的文献25篇。
结果与结论：目前，移植胰岛治疗糖尿病已取得良好疗效，但由于胰岛来源匮乏和异种或异体来源的胰岛引起免疫排斥反应而难以使众多糖尿患者受益。骨髓间充质干细胞取材方便，容易进行体外分离、培养和纯化，且具有多向分化潜能。若将骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞，可望解决胰岛细胞来源和免疫排斥问题。文章对骨髓间充质干细胞分化为胰岛细胞治疗糖尿病的研究进展进行综述，并指出了存在问题和今后的研究方向。

关键词: 干细胞, 干细胞综述, 骨髓间充质干细胞, 胰岛细胞, 糖尿病

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells transplanted into diabetes mellitus rats can decrease glucose level.
OBJECTIVE: To summarize the research progress in bone marrow mesenchymal stem cells for promotion of islet regeneration.
METHODS: A computer-based online retrieval of PubMed and Wanfang databases was performed to search papers published during July 2003 to December 2011 with the key words bone marrow mesenchymal stem cells, islet cells in English and Chinese. Twenty-five papers were included in the final analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: At present, transplantation of islets has made great advance in treatment of diabetes mellitus. Many patients with diabetes mellitus hardly benefit from islet transplantation because of limited islet origins and the immunological rejections of heterogenous or xenogenous islets. Bone marrow mesenchymal stem cells are characterized by easy to operate, easy in vitro isolation, culture and purification, and multipotential differentiation. Islets induce-differentiated by bone marrow mesenchymal stem cells are expected to solve islet-related problems of the limited origin and immunological rejections. This paper summarizes the research progress in bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of diabetes mellitus and points out the existing problems and further study direction.

Key words: stem cells, stem cell review, bone marrow mesenchymal stem cells, islet cell, diabetes mellitus

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞的研究背景骨髓间充质干细胞是1976年Friedenstein等首次在骨髓中加以分离得到，间充质干细胞是指存在于骨髓基质内的非造血细胞来源的细胞亚群，后来被证实广泛存在于骨髓基质、脂肪、骨实质、胎盘、肝脏及骨骼肌等多种组织中的一群非造血干细胞，该群细胞起源于早期中胚层和外胚层，有高度的自我更新和分化潜能，在不同的诱导条件下可以分化为除造血细胞以外的多种组织细胞，如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、星形胶质细胞、神经细胞、内皮细胞和胰岛细胞等。该群细胞并非是单一的细胞群，而是包含了许多干/祖细胞的混合细胞群^[8]。根据“国际细胞疗法协会(ISCT)”的最新规定，应称其为“多潜能基质细胞”^[9]，根据该规定符合以下标准的细胞群体才可以称为“多潜能基质细胞”：在标准培养条件下黏附于塑料制品生长；表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14(或CD11b)及CD19，也不表达HLA-DR；体外必须有分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞的能力。

随着研究的深入，人们发现间充质干细胞还有独特的免疫学特性，表现出具有很低的免疫原性，并且在体内外都显示了很强的免疫调节能力。而且具备多向分化和组织修复能力，在体内外容易分离培养和扩增。基于以上特点在胰岛移植方面备受关注。

2.2 骨髓间充质干细胞治疗糖尿病的研究现状骨髓间充质干细胞作为一种可扩增的细胞资源，近几年在治疗糖尿病方面得到了广泛的关注。但是目前在骨髓干细胞的分离、培养、转化等方面仍然存在一些问题。

目前，分离骨髓间充质干细胞的常用方法主要有以下几种^[10]：①密度梯度离心法。是应用淋巴细胞分离液通过离心分层，将有核细胞和造血细胞分离，获取界面的有核细胞进行细胞培养。②贴壁筛选法。骨髓间充质干细胞具有贴壁生长特性，而造血细胞则悬浮生长，反复冲洗可去除悬浮生长的造血细胞，就可以收集贴壁生长的骨髓间充质干细胞。在实际工作中，贴壁筛选法多与密度梯度法联合应用，密度梯度离心将大部分的造血细胞分离出去，只收集骨髓中的单核细胞，再通过贴壁培养，换液去除悬浮生长的造血细胞，便可获得较纯的贴壁生长的骨髓间充质干细胞，这是比较理想的分离纯化方法。③细胞表面分子标记分选法。主要是根据骨髓间充质干细胞的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但因目前尚未发现间充质干细胞特异性很强的表面标记物，且这种方法对细胞活性的影响较大、实验条件要求较高、需要骨髓量较大，所以较少应用于骨髓间充质干细胞的分选。④细胞筛选法。主要是根据细胞大小，利用一种有3 μm小孔的塑料培养皿从骨髓中筛选骨髓间充质干细胞。

目前常用Transwell细胞共培养技术在体外将间充质干细胞诱导分化成具有功能的胰岛样细胞。间充质干细胞进入新环境后，对新环境的调节信号做出反应，分化成与新的生长环境相适应的细胞。胰岛细胞合成分泌的多种细胞营养因子如胰岛素、胰高血糖素、葡萄糖转运子2及pdx-1等，以及多种细胞外基质成分、细胞黏附因子和细胞间的相互作用均在间充质干细胞的定向分化成胰岛样细胞上起着重要作用^[11]。

间充质干细胞向胰岛细胞的诱导分化方面，常用实验如下：

体外实验：Choi等^[12]在提取兔的骨髓间充质干细胞加入胰腺的提取物后发现了类似胰岛素分泌细胞的聚集，并且表达4种胰腺内分泌激素，胰岛素分泌细胞还可以释放胰岛素调节血糖；同时证实骨髓源基质细胞表达CD44、CD71分子，但不表达CD34和CD45分子。Oh等^[13]采用体外横向分化技术，将骨髓来源的细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞，利用免疫组织化学法鉴定发现，诱导后的胰岛素分泌细胞可以表达胰岛素、胰多肽、生长抑素等多种蛋白和基因。Western blot和酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析证明其可表达胰岛素前体和有活性的胰岛素。在高血糖鼠肾脏被膜下移植入诱导后的细胞可以降低血糖并维持90 h左右。电镜下观察诱导后的细胞和胰岛细胞具有相似的超微结构。由此证实成体骨髓细胞可以在体外诱导分化为胰岛素分泌细胞。

体内试验：Hess等^[14]将骨髓来源的细胞移植到链脲菌素诱导的糖尿病小鼠体内，虽然受者体内一定量的供者胰岛素阳性细胞存活并可以降低糖尿病小鼠的胰腺损伤，但是这些细胞并不能明显降低血糖水平。移植后的细胞大多数聚集在导管和胰岛结构附近，而且它们的出现伴随着分泌胰岛素的胰腺细胞的扩增。由此说明骨髓来源的细胞可以使胰腺再生。Ianus等^[15]将标有绿色荧光蛋白雄性小鼠的骨髓通过尾静脉移植到放射线照射的雌性小鼠体内，无菌条件下喂养4-6周后处死。用胶原酶等消化胰腺获取单个胰岛细胞，并采用免疫组织化学、RT-PCR、胰岛素分泌方法检测，结果移植后的4-6周，受者的胰岛细胞内表达Y染色体和绿色荧光蛋白。而且供者和受者骨髓和外周血的有核细胞内均未检测到绿色荧光蛋白。从胰腺内分离出来的绿色荧光蛋白细胞表达胰岛素Ⅰ、Ⅱ，葡萄糖转运体Ⅱ和胰岛β细胞特有的转录因子胰十二指肠同源异形盒基因(IPF)，而不表达HSC表面标志、胚胎干细胞和间充质干细胞表面标志。体内外实验结果表明，骨髓间充质干细胞不但能够分化为胰岛样细胞而且具有一定的β细胞功能，能够降低血糖，从而为糖尿病患者进行胰岛细胞移植的治疗提供了新思路。

在基因工程方面，通过将外源性胰岛素相关基因导入间充质干细胞内，使其分泌胰岛素，在糖尿病模型体内可以有效的控制血糖并有部分β细胞特性^[16]。但间充质干细胞在体内能否直接转化为胰岛细胞还存在较多的争议。Ianus等通过外周静脉将雄性小鼠的间充质干细胞移植到雌性小鼠体内，得到了可以表达胰岛素的功能完全的胰腺内分泌β细胞。同时CRE-COXP系统也排除了细胞融合的可能。但Choi等将骨髓移植到糖尿病小鼠体内后，虽然在胰腺内检测出了外源性骨髓来源的细胞，但这些外源细胞并不表达胰岛素，不过他们也没有否定间充质干细胞有向胰岛细胞转化的可能。Mathews等^[17]认为，骨髓干细胞只是在胰腺内促进了胰岛的再生。以上不同结论的产生可能与实验者实验设计不同或实验条件不同有关。

总结目前的研究，诱导机制多为以下方法和原理：Schuldiner等^[18]经过一系列的研究发现，胰腺组织与神经组织有相似生长发育机制，认为神经生长因子可能是胰腺发育的关键信号。现阶段实验中体外诱导大多根据此原理。实验过程中发现表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子具有扩增神经干细胞的功能^[19]，所以先用两者将骨髓间充质干细胞诱导成为nestin阳性细胞^[20]，然后添加含有胰岛细胞赖以生存的条件培养液，为诱导骨髓间充质干细胞创造一个适宜的微环境。

有研究表明，间充质干细胞可以在糖尿病鼠的肝脏、胰腺内定植存活，且植入后细胞数无明显差异，考虑可能与局部组织的血管通透性及组织器官的血流分布有关，此外还与组织器官自身表达释放引起间充质干细胞向靶器官迁移的趋化因子有关。常见的趋化因子包括基质金属蛋白酶、血小板衍生生长因子和SDF-1/CXCRE4等，其中SDF-1/CXCRE4对细胞的趋化作用得到了较多的证实。Xu等^[21]报道，带有绿色荧光蛋白的间充质干细胞在体内移植6周后仍能存活。在标记有绿色荧光蛋白的间充质干细胞移植后28 d小鼠胰腺组织内发现了散在的绿色荧光蛋白阳性细胞；这些阳性细胞也能表达胰岛素，提示外源性间充质干细胞可以在糖尿病的小鼠体内转化为胰岛样细胞^[22]。

另有研究发现，骨髓间充质干细胞可以自然的产生一些细胞因子和生长因子，并可以提高周围细胞的存活率，这就是所谓的旁分泌机制^[23]。新近的研究显示，旁分泌机制已被证实在组织再生和修复过程中扮演着重要角色。因此，有人推测，将骨髓间充质干细胞移植入受体糖尿病动物体内，它是通过像血管再生、细胞保护、抗炎、促有丝分裂及抗凋亡等旁分泌机制抑制受损的B细胞凋亡，并增强内源性B祖细胞的增殖分化。这种假说一旦被证实是正确的，对于糖尿病的分子和基因疗法又将是一个重大的突破。

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引言

糖尿病已成为对人类健康和生活质量危害仅次于癌症的疾病。糖尿病是因胰岛素分泌缺乏和(或)作用缺陷而引起的以血糖水平升高为特征的代谢性疾病。传统治疗糖尿病的方法是服用降血糖药物和注射胰岛素，但药物不良反应及无法避免远期并发症和长期口服药物及使用胰岛素后出现的抵抗现象，最终疗效并不理想。

Fan Zi-yang★, Master, Attending physician, Department of General Surgery, Zhuozhou Hospital, Zhuozhou 072750, Hebei Province, China zzsyypw@163.com

Received: 2012-04-07

Accepted: 2012-05-08

近年来，人们为克服糖尿病采用了以下几种方法：①胰岛素泵的治疗：其原理是将连续实时监测血糖和自动调节胰岛素的输注系统连接起来，模拟生理性胰岛素分泌模式达到治疗目的。但该方法目前存在的主要问题：长期在同一部位使用会引起局部脂肪组织硬化导致胰岛素吸收障碍和局部组织感染，因此需要48-72 h更换输注部位。此外，还需要定期更换电池、导管、笔芯排气等操作，如使用不慎会导致致命的低血糖，而非理想的治疗方法^[1]。②生物人工胰腺-免疫隔离技术：该原理为通过采用一种半通透膜材料包裹胰岛分泌细胞，血糖从血液进入囊内刺激胰岛分泌胰岛素达到调控血糖的目地。所用的微囊材料是决定发挥功能的关键因素之一，微囊材料的生物相容性、微囊内移植物营养物质的缺乏、炎性细胞因子的渗入、微囊移植的部位等制约着微囊化胰岛移植的临床应用。目前还没有较理想的材料，此外调节胰岛素分泌的量是否符合生理需求未完全清楚，其应用受到限制^[2]。③胰腺移植：该方法目前存在的主要问题：手术创伤大、外科并发症发生率高、免疫排斥反应、同时由于免疫抑制剂应用的毒副作用以及对患者生活质量的损害，而非理想的方法^[3]。④胰岛细胞移植：该原理为采用胰岛分离技术分离出胰岛细胞通过外科方法或放射介入法将胰岛细胞经门静脉移植到肝脏内，发挥胰岛细胞调节血糖的作用。目前存在的主要问题：胰岛细胞最终定居于肝内的微小静脉区，该区的氧分压明显低于胰腺的氧分压影响胰岛细胞的存活；胰岛细胞直接暴露于血循环中引发的即刻血液介导的炎症反应是早期胰岛细胞损害的主要原因；与胰岛输注有关的并发症如：出血、栓塞、胆道穿刺伤、一过性转氨酶升高等；需要应用免疫抑制剂，而常用于实体器官的免疫抑制剂对胰岛β细胞具有毒性；此外在部分病例胰岛细胞移植后功能逐渐丧失，其原因仍不清楚，可能是多因素作用的结果，包括：排斥反应、自身免疫性疾病复发、移植胰岛的微环境不理想、容易暴露于药物的不良反应中、移植存活的胰岛细胞数量不足、胰岛功能衰竭。

有研究表明，移植后胰岛的血管重建开始于第2，3天，并在2周内完成^[4]。然而，Mattsson等^[5]的研究发现，移植胰岛内的微血管密度明显低于内源性胰岛的微血管密度，并由于缺血缺氧而造成胰岛细胞的凋亡和坏死，从而引起移植后功能性β2细胞数量的减少。因此，游离胰岛移植后的血管再生和微循环的重建是胰岛存活的前提。目前仍有诸多问题尚未解决^[6]。

那究竟还有没有更理想的方法呢？人们试图找到新的胰岛细胞来源用于移植，其中

研究较多的是异种胰岛和干细胞来源的胰岛。异种胰岛虽可大量获得且能导入相关人基因，但不同种系间严重的排斥反应使之仍处在动物实验阶段。胚胎干细胞、成体干细胞在一定的条件下都可以转分化为产胰岛素细胞，伦理学和转分化效率不高的问题仍未解决。

近年来研究发现骨髓间充质干细胞是一种具有多分化潜能的细胞，可分化为3个胚层来源的多种组织细胞，具备多向分化和组织修复的能力，在一定条件下可分化为包括胰岛细胞在内的各种胰腺细胞。在体内外容易分离和扩增，实验表明，骨髓还是胰腺内分泌干细胞的一个居所^[7]。此外，骨髓间充质干细胞还具有独特的免疫优势，具有较低的免疫原性和较强的免疫调节能力，而取自受体自身的骨髓间充质干细胞又能有效解决免疫排斥问题。骨髓间充质干细胞较容易获得，由于骨髓间充质干细胞的独特优势而备受关注，有可能在胰岛移植方面取得突破性进展。现介绍该项领域的研究现状及进展。