骨髓间充质干细胞向功能性神经元的横向分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.001

中国组织工程研究 ›› 2012, Vol. 16 ›› Issue (49): 9121-9127.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.001

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 下一篇

骨髓间充质干细胞向功能性神经元的横向分化

黄保胜¹，王天路¹，李立新²，谢青松²，田和平²，张寅¹

¹南京明基医院神经外科，南京医科大学附属医院，江苏省南京市 210019；²南京医科大学第一附属医院神经外科，江苏省南京市 210029

收稿日期:2012-08-28 修回日期:2012-09-13 出版日期:2012-12-02 发布日期:2012-09-13
通讯作者: 王天路，主任医师，南京明基医院神经外科，南京医科大学附属医院，江苏省南京市210019 timu.wang@benqhospital.com
作者简介:黄保胜★，1982年生，硕士，主治医师，美国宾夕法尼亚大学医疗中心高级研究学者，主要从事中枢神经损伤与修复的临床与应用基础研究。 bosen.huang@benqhospital.com
基金资助:
南京市卫生局医学科技发展项目资助(QKK10194)，南京明基医院科研启动项目(SRD20100008)

Trans-differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into functional neurons

Huang Bao-sheng¹, Wang Tian-lu¹, Li Li-xin², Xie Qing-song², Tian He-ping², Zhang Yin¹

¹Department of Neurosurgery, BenQ Medical Center, Nanjing Medical University, Affiliated Hospital of Nanjing 210019, Jiangsu Province, China; ²Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Received:2012-08-28 Revised:2012-09-13 Online:2012-12-02 Published:2012-09-13
Contact: Wang Tian-lu, Chief physician, Department of Neurosurgery, BenQ Medical Center, Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210019, Jiangsu Province, China timu.wang@benqhospital.com
About author:Huang Bao-sheng★, Master, Attending neurosurgeon, Department of Neurosurgery, BenQ Medical Center, Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210019, Jiangsu Province, China bosen.huang@benqhospital.com
Supported by:
Medical Technology Development Project of Nanjing Health Department, No.QKK10194*; Scientific Research Staring Foundation of Nanjing BenQ Medical Center, No.SRD20100008*

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞定向分化为神经干细胞并探讨提高分化效率的方法，具有重要的理论与实际应用意义。
目的：建立以不同诱导方法横向分化大鼠骨髓间充质干细胞为功能神经元的方法。
方法：分离、纯化得到骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物。将骨髓间充质干细胞分为神经营养因子诱导组、化学诱导组和对照组，骨髓间充质干细胞分别加入脑源性神经营养因子和碱性成纤维细胞生长因子、二甲亚砜和丁香茴醚、PBS进行诱导。
结果与结论：神经营养因子诱导组和化学诱导组诱导后的细胞均表达神经元特异性烯醇化酶和微管相关蛋白2，且2组细胞的表达量接近(P > 0.05)，而对照组未发现神经元特异性烯醇化酶和微管相关蛋白2阳性表达。膜片钳系统检测发现神经营养因子诱导组诱导后的细胞具有神经细胞特征性的动作电位和兴奋性突触后电流，而化学诱导组和对照组均未发现动作电位和兴奋性突触后电流。提示脑源性神经营养因子联合碱性成纤维细胞生长因子是一种诱导骨髓间充质干细胞横向分化为功能神经元的可靠方法。

关键词: 定向分化, 骨髓间充质干细胞, 神经干细胞, 电生理, 神经元, 脑源性神经营养因子, 兴奋性突触后电位, 神经元特异性烯醇化酶, 微管相关蛋白2

Abstract:

BACKGROUND: It has the important theoretical and practical significance to induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural stem cells and to investigate the method to improve the differentiation efficiency.
OBJECTIVE: To investigate the method of trans-differentiation of bone mesenchymal stem cells into functional neurons.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and purified from rat bone marrow by density gradient centrifugation and adherent culture. Expression of bone marrow mesenchymal stem cells surface marker was detected by flow cytometry. All bone marrow mesenchymal stem cells were divided into three groups: neurotrophic factor induction group, chemical induction group and control group. The bone marrow mesenchymal stem cells in the neurotrophic factor induction group were induced with brain-derived neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor, the cells in the chemical induction group were induced with dimethyl sulfoxide and butylated hydrochloride, and the cells in the control group were induced with PBS.
RESULTS AND CONCLUSION:The bone marrow mesenchymal stem cells in the induction groups could express neuron specific enolase and microtubule-associated protein-2, and there was no significant difference of the expression rate between these two groups (P > 0.05), while in the control group, no expression of neuron specific enolase and microtubule-associated protein-2 was detected. Patch clamp system detection showed that the induced bone marrow mesenchymal stem cells in the neurotrophic factor induction group could express action potential with the characteristics of neural cells and excitatory postsynaptic currents. There were no electrophysiologica characteristics in the chemical induction group and control group. It indicates that brain-derived neurotrophic factor combined with basic fibroblast growth factor is an effective method of inducing bone marrow mesenchymal stem cells to trans-differentiate into functional neurons.

中图分类号:

R394.2

黄保胜，王天路，李立新，谢青松，田和平，张寅. 骨髓间充质干细胞向功能性神经元的横向分化[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(49): 9121-9127.

Huang Bao-sheng, Wang Tian-lu, Li Li-xin, Xie Qing-song, Tian He-ping, Zhang Yin. Trans-differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into functional neurons[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2012, 16(49): 9121-9127.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞的形态及细胞表面标志物鉴定原代培养的骨髓间充质干细胞接种24 h后开始有细胞贴壁，贴壁细胞有伪足伸出，呈现多个细胞聚集样表现。骨髓间充质干细胞经过3代纯化扩增后细胞呈长梭形，成纤维样细胞，完全融合后类似形成漩涡状结构，见图1。

注：细胞呈长梭形，成纤维样细胞，完全融合后类似形成漩涡状结构
Figure 1 Passage 3 rat bone marrow mesenchymal stem cells (×400)
图1 培养的第3代大鼠骨髓间充质干细胞(倒置相差显微镜观察，×400)

培养的骨髓间充质干细胞可以稳定传代至第10代，流式细胞仪检测结果显示其表面标志物CD34和CD45表达阴性；而间充质干细胞相对特异性标志CD44和CD105强阳性表达。

2.2 骨髓间充质干细胞定向诱导后得到的神经元样细胞经过神经营养因子和化学诱导的骨髓间充质干细胞诱导培养14 d后，细胞呈现出双极或多极神经元样形态，伸出突触，部分细胞呈现网状结构。

a: After differentiated for 14 d, neuron specific enolase staining is positive

骨髓间充质干细胞定向诱导后得到的神经元样细胞经过神经营养因子和化学诱导的骨髓间充质干细胞诱导培养14 d后，细胞呈现出双极或多极神经元样形态，伸出突触，部分细胞呈现网状结构。

免疫细胞化学鉴定显示神经营养因子组和化学诱导组诱导14 d后神经元特异性烯醇化酶蛋白及微管相关蛋白2蛋白表达均阳性，见图2。

b: After differentiated for 14 d, microtubule-associated protein-2 staining is positive
注：骨髓间充质干细胞诱导培养14 d呈双极或多极神经元样，部分细胞呈现网状结构
Figure 2 Neuron-like cells after directly induced with bone marrow mesenchymal stem cells for 14 d (immunocytochemical staining, ×400)
图2 骨髓间充质干细胞定向诱导14 d后得到的神经元样细胞(免疫细胞化学染色，×400)

2.3 骨髓间充质干细胞定向诱导后得到的神经元样细胞的电生理功能

2.3.1 动作电位利用膜片钳系统在电流钳模式下记录到神经营养因子组的神经元样细胞出现动作电位，而化学诱导组和对照组的神经元样细胞未出现动作电位，见图3。

Figure 3 The action potential of the induced neuron-like cells detected with patch clamp system

图3 膜片钳系统检测诱导后神经元样细胞的动作电位

利用膜片钳系统检测发现神经营养因子组诱导分化后的神经元样细胞能记录到自发兴奋性突触后电流，而化学诱导组和对照组诱导后的神经元样细胞均没有记录到自发兴奋性突触后电流，即没有自发的电流。

将神经营养因子组诱导后的神经元样细胞的自发兴奋性突触后电流与从大鼠体内海马取获取的正常神经元的自发兴奋性突触后电流相比较发现两者的波形类似，但神经营养因子组诱导后的神经元样细胞的自发兴奋性突触后电流幅度较小，频率也较正常神经元的自发兴奋性突触后电流低。

Figure 4 Spontaneous excitatory postsynaptic current of the induced neuron like cells detected by patch clamp system

图4 膜片钳系统检测诱导后神经元样细胞的自发的兴奋性突触后电流

参考文献

[1] Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 1992;255(5052):1707-1710.

[2] Ferrari G, Cusella-De Angelis G, Coletta M, et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science. 1998;279(5356):1528-1530.

[3] Grigorian AS, Gilerovich EG, Pavlichenko NN, et al. Effect of transplantation of mesenchymal stem cells on neuronal survival and formation of a glial scar in the brain of rats with severe traumatic brain injury. Bull Exp Biol Med. 2011;150(4): 551-555.

[4] Nikitina VA, Chausheva AI, Zhanataev AK, et al. Assessment of DNA damage in human bone marrow cells and multipotent mesenchymal stromal cells. Bull Exp Biol Med. 2011;151(4): 550-552.

[5] Kim BJ, Seo JH, Bubien JK, et al. Differentiation of adult bone marrow stem cells into neuroprogenitor cells in vitro. Neuroreport. 2002;13(9):1185-1188.

[6] Yang HJ, Xia YY, Wang L, et al. A novel role for neural cell adhesion molecule in modulating insulin signaling and adipocyte differentiation of mouse mesenchymal stem cells. J Cell Sci. 2011;124(Pt 15):2552-2560.

[7] Wu YX, Wang Y, Ben XM. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(1):11-14.

吴玉新,王燕,贲晓明.表皮生长因子干预小鼠非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成及向神经元样细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(1):11-14.

[8] Shakhbazau AV, Petyovka NV, Kosmacheva SM, et al. Neurogenic induction of human mesenchymal stem cells in fibrin 3D matrix. Bull Exp Biol Med. 2011;150(4):547-550.

[9] Li XF, Zhao JM, Su W, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(10):1721-1725.

李晓峰,赵劲民,苏伟,等.大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(10):1721-1725.

[10] Ba YC, Tang JZ, Fan Y, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(6):1050-1055.

巴迎春,唐建中,范艳,等.脊髓损伤亚急性期移植神经干细胞:损伤脊髓5-羟色胺的表达[J].中国组织工程研究,2012,16(6): 1050-1055.

[11] Iwanami A, Kaneko S, Nakamura M, et al. Transplantation of human neural stem cells for spinal cord injury in primates. J Neurosci Res. 2005;80(2):182-190.

[12] He XY, Shen HY, Xiang P, et al. Zhongguo Yundong Yixue Zazhi. 2010;29(2):208-210.

贺晓玉,沈慧勇,项鹏,等.人神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的影响[J].中国运动医学杂志,2010,29(2):208- 210.

[13] Yang QG, Zhang Q, Chen YP, et al. Functional recovery of njured sciatic nerve by ntraperitoneal injection of multiwalled carbon nanotubes. Neural Regen Res. 2011;6(7):505-509.

[14] Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 1997;276(5309):71-74.

[15] Rogers TB, Pati S, Gaa S, et al. Mesenchymal stem cells stimulate protective genetic reprogramming of injured cardiac ventricular myocytes. J Mol Cell Cardiol. 2011;50(2):346-356.

[16] Boxall SA, Jones E. Markers for characterization of bone marrow multipotential stromal cells. Stem Cells Int. 2012;2012: 975871.

[17] Sher L. The role of brain-derived neurotrophic factor in the pathophysiology of adolescent suicidal behavior. Int J Adolesc Med Health. 2011;23(3):181-185.

[18] Li L, Xu Q, Wu Y, et al. Combined therapy of methylprednisolone and brain-derived neurotrophic factor promotes axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury in rats. Chin Med J (Engl). 2003;116(3): 414-418.

[19] Chen L, Zhang ZG, Chen B, et al. Brain-derived neurotrophic factor induces neuron-like cellular differentiation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood cells in vitro. Neural Regen Res. 2011;6(13):972-977.

[20] Fan CG, Zhang QJ, Han ZC. Zhonghua Shenjing Waike Zazhi. 2005;21(7):387-392.

范存刚,张庆俊,韩忠朝.人脐带间充质干细胞向神经细胞分化的研究[J].中华神经外科杂志,2005,21(7):387-392.

[21] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 2000;61(4):364-370.

[22] Cronberg T, Rundgren M, Westhall E, et al. Neuron-specific enolase correlates with other prognostic markers after cardiac arrest. Neurology. 2011;77(7):623-630.

[23] Guo Y, Gong HS, Zhang J, et al. Remarkable reduction of MAP2 in the brains of scrapie-infected rodents and human prion disease possibly correlated with the increase of calpain. PLoS One. 2012;7(1):e30163.

[24] Zhou JY, Zhang QJ. Zhonghua Shenjing Waike Zazhi. 2008 ; 24(3):216-219.

周剑云,张庆俊.人脐带间充质干细胞向神经细胞分化过程中ILK的表达变化及意义[J].中华神经外科杂志, 2008,24(3):216- 219.

[25] Deng W, Obrocka M, Fischer I, et al. In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP. Biochem Biophys Res Commun. 2001;282(1): 148-152.

[26] Kuo YC, Chiu KH. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 2011;32(3): 819-831.

[27] Zeng R, Hu ZB, Guo WT, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(6):1030-1034.

曾荣,胡资兵,郭伟韬,等.依达拉奉体外定向诱导人间充质干细胞向神经元样细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2009, 13(6):1030-1034.

[28] Wilkins A, Kemp K, Ginty M, et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells secrete brain-derived neurotrophic factor which promotes neuronal survival in vitro. Stem Cell Res. 2009;3(1):63-70.

[29] Conforti E, Arrigoni E, Piccoli M, et al. Reversine increases multipotent human mesenchymal cells differentiation potential. J Biol Regul Homeost Agents. 2011;25(2 Suppl):S25-33.

[30] Honglin Q, Liu RL. Researches on application of stem cell therapy in exercise-induced spinal cord injury recovery. Adv Intell Soft Comput. 2012;119:95-101.

[31] Park WB, Kim SY, Lee SH, et al. The effect of mesenchymal stem cell transplantation on the recovery of bladder and hindlimb function after spinal cord contusion in rats. BMC Neurosci. 2010;11:119.

[32] Guo ZY, Jiang XD, Xu RX, et al. Zhonghua Shenjing Yixue Zazhi. 2005;4(6):545-550.

郭再玉,姜晓丹,徐如祥,等.骨髓基质细胞源性神经干细胞体外分化及电生理特性的研究[J].中华神经医学杂志,2005,4(6): 545-550.

[33] Mareschi K, Novara M, Rustichelli D, et al. Neural differentiation of human mesenchymal stem cells: Evidence for expression of neural markers and eag K+ channel types. Exp Hematol. 2006;34(11):1563-1572.

引言

1992年，Reynol等^[1]首先发现了神经干细胞，并逐渐应用于神经系统损伤修复。然而外源的神经干细胞不易获取，活体组织中获取具有危险性，胚胎中获得又涉及伦理争议，不能满足脑脊髓等中枢神经损伤治疗的临床需要。因此，寻找一种新的神经干细胞或者神经细胞来源对于中枢神经损伤修复具有至关重要的意义。

骨髓间充质干细胞是一种由中胚层发育而来的成体干细胞，具有很强的自我更新和多向分化能力^[2-4] 。自体骨髓间充质干细胞来源充足，无伦理争议，移植后无排异反应，并且骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为骨、脂肪、胰岛等细胞，在特定条件下还能横向分化为神经细胞，为人们利用骨髓间充质干细胞修复中枢神经损伤带来了希望^[3] 。目前骨髓间充质干细胞神经方向分化的方法众多且均能得到神经元样细胞，虽然多种方法均能促使骨髓间充质干细胞神经方向横向分化，然而对分化来的神经元样细胞是否具有正常神经元的电生理功能缺乏深入研究，对何种诱导方法可得到具有正常电生理功能、可产生动作电位、形成突触连接的神经元缺乏深入研究^[5] 。

具有正常电生理功能，可产生动作电位说明该细胞处于静息期，激活后具有细胞活力，可形成突触连接说明该神经元可与其他神经元互相关联，传递神经信号，这三方面对一个神经元是否具有功能至关重要[6-8]。

因此，实验在无菌条件下分离并培养骨髓间充质干细胞，尝试分别利用神经营养因子和化学物质诱导骨髓间充质干细胞向神经方向分化，并对诱导后细胞进行形态和电生理功能鉴定，为骨髓间充质干细胞横向分化为功能神经元寻找一种可靠高效的诱导方法，从而为骨髓间充质干细胞最终移植治疗脊髓等中枢神经损伤奠定基础。

材料方法

设计：随机对照细胞学实验。
时间及地点：于2011年5月至2012年4月在南京医科大学附属明基医院中心实验室完成。
材料：
实验动物：清洁级雄性SD大鼠10只，鼠龄三四周，体质量约80 g，动物均购于上海实验动物中心，动物质量合格证号：SYXK(沪)2007- 0005，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
细胞培养及分化诱导检测的主要试剂及仪器：

实验方法：
骨髓间充质干细胞的分离培养：参照李晓峰等^[9]介绍的方法，采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法分离培养出骨髓间充质干细胞。无菌条件下，取大鼠股骨骨髓，用密度为 1.073 g/mL的percoll分离(400×g×20 min)骨髓间充质干细胞，取界面处细胞层，离心后洗涤以2×10⁵/cm²的密度接种，72 h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3 d换液一次。细胞长到80%融合时，用0.25%胰酶消化细胞，离心后弃去上清，1∶2的比例进行传代培养。

骨髓间充质干细胞的形态学观察：在倒置相差显微镜下每日观察原代细胞和传代细胞的生长况和形态特征。

骨髓间充质干细胞的表面标志物检测：待骨髓间充质干细胞扩增培养到第3代时，用0.25%胰酶消化细胞，离心后弃去上清，收集1×10⁶个细胞情，用40 g/L多聚甲醛固定，分别加入单克隆抗体CD34-FITC，CD45-PE，CD105-FITC和CD44-PE，置4 ℃孵育30 min，PBS洗2次，用BD的aria 2/3流式细胞仪检测抗体的表达情况。

骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的诱导分化：传至第3代的骨髓间充质干细胞，取2×10⁵骨髓间充质干细胞按 3 000/cm²的浓度接种于6孔培养板，培养板中事先放有经0.1%多聚赖氨酸包被的无菌盖玻片，神经营养因子诱导组、化学诱导组和对照组骨髓间充质干细胞分别加入含20 μg/L脑源性神经营养因子和20 μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子的L-DMEM培养基，体积分数为2%二甲亚砜、2%丁香茴醚的L-DMEM培养基，含有PBS的L-DMEM培养基。在37 ℃、体积分数5% CO₂完全湿度条件下培养每隔3 d换液1次，连续培养14 d后，PBS洗2遍。

免疫细胞化学染色和免疫荧光染色观察诱导后细胞中神经元特异性烯醇化酶和微管相关蛋白2的表达：将已消毒的盖玻片置于6孔培养板中，按2×10⁷ L^-¹的细胞浓度将细胞接种于培养板中进行细胞爬片，培养6 h，待细胞贴壁后，加用培养液稀释的DADS液，使终浓度30 mg/L，阴性对照组则为常规培养液。3 d后进行免疫细胞化学染色对诱导分化后的细胞表达神经元特异性烯醇化酶进行鉴定，用免疫荧光方法对微管相关蛋白2进行鉴定。

常规免疫细胞化学方法，具体方法：一抗孵育(PBS配，湿盒)4 ℃过夜或37 ℃ 60 min。阴性对照用一抗来源血清，PBS清洗标本3次，各1 min，二抗孵育(湿盒) 37 ℃ 30 min。PBS清洗标本，链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶液(湿盒)37 ℃孵育30 min，再次PBS清洗标本3次，各5 min，DAB显色(避光，镜下观察至棕色)3- 10 min。蒸馏水洗2次，各1 min。苏木精复染0.5- 1.0 min。自来水洗 10 min左右。体积分数95%乙醇脱水1.0-2.0 s，树胶封固。显微镜观察诱导后细胞中神经元特异性烯醇化酶和微管相关蛋白2的阳性表达。神经营养因子组和化学诱导组分别随机选择10个视野，计数诱导14 d神经元特异性烯醇化酶蛋白和微管相关蛋白2蛋白的表达阳性率。

诱导后细胞的电生理功能检测：取诱导分化后的骨髓间充质干细胞用膜片钳系统记录其电生理特性。分别在电压钳的模式下检测各组诱导后细胞自发的兴奋性突触后电流。在电流钳的模式下，记录静息膜电位、动作电位。

记录动作电位和自发兴奋性突触后电流的电极内液成分：135 mmol/L葡萄糖酸钾，0.5 mmol/L CaCl₂， 2 mmol/L MgCl₂，5 mmol/L KCl，5 mmol/L EGTA， 5 mmol/L HEPES，5 mmol/L Na₂ATP)。

灌流液成分：117 mmol/L NaCl，3.6 mmol/L KCl，2.5 mmol/L CaCl₂，1.2 mmol/L MgCl₂，1.2 mmol/L NaH₂PO₄，25 mmol/L NaHCO₃，11 mmol/L葡萄糖(pH 7.4，使用氢氧化钠配制)。胞内注射去极化的电流(0.5-1.1 nA，300 ms)产生动作电位，自发兴奋性突触后电流的钳制电压在-70 mV。

主要观察指标：骨髓间充质干细胞形态学观察、免疫细胞化学法检测定向分化后的骨髓间充质干细胞神经标志物神经元特异性烯醇化酶及微管相关蛋白2的表达情况和膜片钳系统监测诱导后细胞的电生理功能。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0软件完成统计分析，计量资料用x(_)±s表示，组间比较行两独立样本t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，人们对中枢神经损伤修复的研究多选用神经干细胞作为种子细胞尝试细胞移植治疗^[10-13]。由于神经干细胞受限于来源不足和涉及伦理学争议，人们迫切需要找到一种来源广泛并无伦理争议临床应用前景广阔的神经细胞来源。骨髓间充质干细胞来源广泛，无伦理争议，具有广阔的应用前景，但对各种诱导方法促使骨髓间充质干细胞横向分化出神经细胞是否具有正常神经元的功能尚存在分歧。因此本实验分别选用脑源性神经营养因子联合碱性成纤维细胞生长因子和丁香茴醚联合二甲亚砜两种方法诱导骨髓间充质干细胞横向分化为神经细胞并探讨其电生理功能特性，为骨髓间充质干细胞横向分化为功能神经元探索一种有效的诱导方法。

实验采用Prockop等^[14]的方法采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法获取骨髓间充质干细胞，经过3代纯化，细胞纯度较高，因骨髓间充质干细胞尚无特异性的表面标志物，实验利用几个相对特异的表面标志物抗体对所培养的细胞进行了鉴定，结果提示与以往文献报道相一致^[15-16]。

脑源性神经营养因子是一种碱性蛋白，在中枢神经系统内合成并广泛存在于脑组织包括大脑皮质、海马、纹状体、下丘脑和小脑，其中以海马和皮质中含量最高^[17-19]。脑源性神经营养因子通过其特异性受体酪氨酸激酶参与细胞的分化、黏附、增殖与成熟等重要的生物学过程，可以促进神经元的发育、损伤后的修复和再生及维持其存活。碱性成纤维细胞生长因子内皮细胞及平滑肌细胞合成的多肽分子，在体外能促使细胞增殖，是干细胞神经方向分化的必要条件^[20]。因此实验选择脑源性神经营养因子和碱性成纤维细胞生长因子联合作为细胞因子诱导组的诱导剂，诱导骨髓间充质干细胞神经方向定向分化。丁香茴醚和二甲亚砜是Woodbury等^[21]最早采用的骨髓间充质干细胞神经方向分化的经典化学诱导剂，因此选择它们作为化学诱导剂。

实验首先利用神经细胞特异性表面标志物对各组诱导得到的细胞进行鉴定，并进一步利用膜片钳技术检测神经元的电生理功能。神经元特异性烯醇化酶为一种胞浆蛋白，是神经元的特异性表面标记物^[22]。微管相关蛋白2为一种微管相关蛋白，广泛存在神经元的轴突中，神经元的胞体和轴突间营养物质的运输都依赖于微管蛋白功能^[23]。因此，微管相关蛋白2的表达是神经元具备功能的必要条件。本次实验选用这2种蛋白，利用免疫细胞的方法检测了所诱导分化的细胞表达神经元特异性标记物，在形态学方面进行鉴定诱导得到的神经元样细胞。

近年来对骨髓间充质干细胞跨胚层向神经元进行了探索研究，二甲亚砜、丁香茴醚等化学物质、部分中药、以及自由基清除剂细胞因子都相继被应用于骨髓间充质干细胞神经方向诱导分化的实验^[24-29]。单纯骨髓间充质干细胞移植治疗中枢神经损伤的疗效不理想^[30-31]。国内学者郭再玉等^[32]利用脑源性神经营养因子联合全反式维甲酸对骨髓间充质干细胞诱导分化来的神经元作了离子通道方面的检测，发现分化后的细胞膜特性较诱导前有显著改变(P < 0.01)，且分化的神经细胞具有快速激活、快速失活的电压依赖性Na⁺通道，类似神经细胞的电生理特性。Mareschi等^[33]研究发现虽然分化前后细胞都显示出具有K⁺通道电流，但是在分化的细胞上该电流的峰值明显高于未分化的细胞，这说明在分化后的细胞上K⁺通道增加了。K⁺能稳定神经元细胞膜上的静息膜电位，参与了细胞的电流激活，从而反映细胞的状态如何。上述研究发现给人们进行骨髓间充质干细胞源神经元电生理功能研究带来了信心。

在此工作基础上，本次实验利用2种诱导分化促使骨髓间充质干细胞横向分化得到的神经细胞进行电生理特性实验发现神经营养因子诱导组神经元样细胞能成功的被诱导出动作电位，但是化学诱导组和对照组细胞未出现动作电位，这进一步肯定了郭再玉等^[32]关于在神经元样细胞上存在Na⁺通道和K⁺通道的研究结果，并且具有与神经元类似的活性，能被兴奋刺激产生动作电位，同时神经营养因子诱导组神经元样细胞出现自发兴奋性突触后电流，虽然其频率和幅度尚未达到正常的神经元的电流，分析可能是骨髓间充质干细胞源性神经元尚属于一种早期功能神经元，利于体内移植。而化学诱导组和对照组没有发现自发兴奋性突触后电流。说明脑源性神经营养因子联合碱性成纤维细胞生长因子促使骨髓间充质干细胞分化后的神经元样细胞不仅具有神经元的基本电生理特性，而且可以产生兴奋性突触后电流，能形成突触以及突触连接，具有基本的突触传递功能，这为利用骨髓间充质干细胞作为种子细胞修复中枢神经损伤奠定了基础。

因此，细胞因子和化学物质两种方法均能诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，但是只有细胞因子联合应用(脑源性神经营养因子联合碱性成纤维细胞生长因子)的方法才能诱导出骨髓间充质干细胞源功能神经元，为下一步研究利用骨髓间充质干细胞作为种子细胞构建组织工程神经复合物移植修复中枢神经损伤、恢复神经功能奠定了基础。

骨髓间充质干细胞向功能性神经元的横向分化

Trans-differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into functional neurons

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[2]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[3]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[4]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[5]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[6]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[7]	管倩, 栾佐, 叶豆, 杨印祥, 汪兆艳, 王倩, 姚瑞芹. 人少突胶质前体细胞传代过程中形态学的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1045-1049.
[8]	王丰, 周立宇, 赛吉拉夫, 齐士斌, 马艳霞, 韦善文. CaMKⅡ-Smad1促进外周神经的轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1064-1068.
[9]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[10]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[11]	谢阳, 张淑江, 刘梦兰, 罗映, 杨洋, 李作孝. 雷帕霉素保护实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓神经元的作用途径[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 695-700.
[12]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[13]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[14]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.
[15]	路毅, 邓文冲. 不同运动方式对大脑结构及认知功能的调节作用及差异[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3252-3258.