脂肪干细胞结合电纺生物膜制备“三明治”样心肌片层

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0015

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (2): 254-260.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0015

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脂肪干细胞结合电纺生物膜制备“三明治”样心肌片层

吴张松¹，朱红霞²，罗志强¹，潘婉淳¹，杨帆¹，林欣燕¹，朱艳霞¹

¹深圳大学医学部，深圳抗衰老与再生医学重点实验室，广东省深圳市 518060；²孝感市妇幼保健院急诊科，湖北省孝感市 432100

收稿日期:2017-08-22 出版日期:2018-01-18 发布日期:2018-01-18
通讯作者: 朱艳霞，博士，副教授，深圳大学医学部，广东省深圳市 518060
作者简介:吴张松，男，1995年生，汉族，安徽省安庆市人，主要从事干细胞与软骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81301597)；深圳新兴战略产业发展专项资金(JCYJ20150525092940984/ JCYJ20160422090807181)；广东省大学生科技创新培育专项项目(pdjh2017b0442)

Combined use of adipose-derived stem cells and electrospun membrane for preparing sandwich-like cardiac cell sheets

Wu Zhang-song¹, Zhu Hong-xia², Luo Zhi-qiang¹, Pan Wan-chun¹, Yang Fang¹, Lin Xin-yan¹, Zhu Yan-xia¹

¹Shenzhen Key Laboratory for Anti-ageing and Regenerative Medicine, Health Science Center, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, China; ²Emergency Department, Xiaogan Maternity & Child Healthcare Hospital, Xiaogan 432100, Hubei Province, China

Received:2017-08-22 Online:2018-01-18 Published:2018-01-18
Contact: Zhu Yan-xia, M.D., Associate professor, Shenzhen Key Laboratory for Anti-ageing and Regenerative Medicine, Health Science Center, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, China
About author:Wu Zhang-song, Shenzhen Key Laboratory for Anti-ageing and Regenerative Medicine, Health Science Center, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81301597; Special Funds for Shenzhen Emerging Strategic Industrial Development, No. JCYJ20150525092940984, JCYJ20160422090807181; Special Funds for the Cultivation of Guangdong College Students Scientific and Technological Innovation, No. pdjh2017b0442

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

细胞片层技术：是组织工程中收获种子细胞的一项新技术，将温度反应性的聚合物共价结合到普通培养皿表面，形成温度反应性的培养皿，在37 ℃培养条件下，培养基表面呈疏水性，细胞可在温度反应性培养皿表面附着、扩展和增殖；当温度降到临界温度32 ℃以下时，聚合物表面变为亲水性，在培养皿表面和培养的细胞之间形成水化层，细胞无需胰蛋白酶的硝化作用便可自动从培养皿表面分离。尽管细胞片层技术已较成熟，但由于单细胞片层薄、机械强度差，在转移过程中极易破碎，给操作带来很大的困难。如果在细胞片层之间置于生物可降解，而且降解产物无毒无害的支撑膜，不仅可为细胞片层内细胞提供更多生长空间，有些生物材料作为细胞外基质，还可供给细胞营养，支持细胞生长，同时还可增加细胞片层的机械强度。理想的细胞片层支撑膜应具有合适的孔隙率、高表面积/体积比及三维多孔结构等，以利于细胞生长及营养物质的交换。

建立一种简易新型的“三明治”样多细胞片层(细胞-膜-细胞)制备方法：以壳聚糖-胶原电纺生物膜作为支持膜，在为细胞生长和营养物质交换提供更多空间的同时，可较容易从温敏培养表面将单细胞片层完整剥离，具有更强机械强度的三明治样多细胞片层易于操作，便于移植，薄层多细胞片层易于贴附于梗死心肌表面，因此，可能是未来一种更具有前景治疗心肌梗死的方法。

背景：越来越多研究表明，组织工程化心肌细胞片层可为心肌梗死后的细胞修复提供一种可靠的治疗方法。

目的：以壳聚糖-胶原电纺膜作为支撑膜、脂肪干细胞作为种子细胞，构建“三明治”样多细胞片层。

方法：制备壳聚糖与Ⅰ型鼠尾胶原质量比分别为7∶3、5∶5的壳聚糖-胶原电纺生物膜。将第4代脂肪干细胞接种于温敏培养皿培养3 d，分别加入两种壳聚糖-胶原电纺生物膜，20 ℃培养15 min；待细胞片边缘卷起后，将电纺膜及细胞片层一同移至另一脂肪干细胞生长完全融合的温敏培养皿表面，有细胞层一面朝上，培养30 min后，加入心肌细胞培养基进行培养。培养2周后，多光子显微镜观察细胞状态，免疫细胞化学、Western blot及流式细胞仪检测细胞心肌组织特异性肌钙蛋白TnI和缝隙连接蛋白Cx43的表达，实时定量PCR仪检测心肌细胞特异性基因表达。

结果与结论：①细胞状态：7∶3壳聚糖-胶原电纺膜不能为细胞增殖提供足够的空间，5∶5壳聚糖胶原膜能为脂肪干细胞的附着和结构塑形提供更好的支持；7∶3壳聚糖-胶原电纺膜组死细胞多于5∶5壳聚糖-胶原电纺膜组；②TnI、Cx43蛋白表达：5∶5壳聚糖-胶原电纺膜组细胞TnI、Cx43蛋白表达多于7∶3壳聚糖-胶原电纺膜组(P < 0.05)；③心肌细胞特异性基因表达：5∶5壳聚糖-胶原电纺膜组细胞α-skA、β-MHC、TnI、Cx43、ANP、GATA-4和Nkx2.5 mRNA表达均高于7∶3壳聚糖-胶原电纺膜组；④结果表明：5∶5壳聚糖-胶原电纺膜作为支架有利于脂肪干细胞的增殖与分化，更适宜构建“三明治”样细胞片层。

ORCID: 0000-0003-3760-7810(吴张松)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 电纺生物膜, 壳聚糖, 胶原, 细胞片层工程, 心肌细胞, 脂肪干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Increasing studies have shown that cell-sheet engineering is a more promising method for the treatment of myocardial infarction.

OBJECTIVE: To construct sandwich-like myocardial cell sheets with electrospun chitosan-collagen membrane as support membrane and with adipose-derived stem cells as seed cells.

METHODS: In this study, we prepared electrospun chitosan-collagen membranes at different mass ratio (7:3, 5:5) as a support membrane. Adipose-derived stem cells at passage 4 that were cultured in a thermo-sensitive petri dish for 3 days were seeded onto the two kinds of electrospun membranes at 20 ℃ for 15 minutes until the cell sheets rolled up. Then, the electrospun membranes and cell sheets with the cell layers facing up were placed together onto another thermo-sensitive petri dish in which adipose-derived stem cells were confluent completely. After 30 minutes of culture, the cell sheets were cultured in myocardial cell medium. Two weeks later, cell morphology was observed using multi-photon microscopy. Immunocytochemistry, western blot and flow cytometry were used to detect the expression of TnI and Cx43 in the myocardium. Real-time quantitative PCR was used to detect cardiomyocyte-specific gene expression.

RESULTS AND CONCLUSION: From the results of scanning electronic microscopy (SEM) and propidium iodide (PI) staining, we could found that ADSCs grew easily on the chitosan-collagen (5:5) membrane, and there were more dead cells on the chitosan-collagen (7:3) membrane than on the chitosan-collagen (5:5) membrane. After 2 weeks of differentiation with the myocardial cell medium, higher troponin I and Cx43 protein expressions were observed on the chitosan-collagen (5:5) membrane (P < 0.05). Moreover, the mRNA levels of α-skA, β-MHC, TnI, Cx43, ANP, GATA-4 and Nkx2.5 were higher in the chitosan-collagen (5:5) membrane group than the chitosan-collagen (7:3) membrane group. All these results indicate that the chitosan-collagen (5:5) membrane is better for the growth and differentiation of adipose-derived stem cells, as well as for sandwich-like cell-sheet construction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Stem Cells, Myocardial Infarction, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

吴张松，朱红霞，罗志强，潘婉淳，杨帆，林欣燕，朱艳霞. 脂肪干细胞结合电纺生物膜制备“三明治”样心肌片层[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(2): 254-260.

Wu Zhang-song, Zhu Hong-xia, Luo Zhi-qiang, Pan Wan-chun, Yang Fang, Lin Xin-yan, Zhu Yan-xia.

Combined use of adipose-derived stem cells and electrospun membrane for preparing sandwich-like cardiac cell sheets

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(2): 254-260.

图/表（结果） 9

2.1 生物膜的形态结构电镜下电纺生物膜具有三维多孔状结构，纤维无规律地纵横在整个支架中，纤维间形成大量孔隙，且孔隙相互贯通。随着电纺液中壳聚糖含量的增加，纤维直径呈略微下降趋势(图1)。

2.2 “三明治”样多细胞片层的形态脂肪干细胞在温敏培养皿中培养3 d后完全汇合，某些区域甚至出现重叠生长；当培养温度从37 ℃下降到20 ℃，20 min后脂肪干细胞从边缘卷起，此时以壳聚糖-胶原电纺膜作为支撑膜，将整个细胞片层从培养表面剥离至另一个细胞生长已汇合的温敏培养皿(图2)。壳聚糖-胶原电纺膜上培养的细胞呈现典型的成纤维细胞细长形态(图3)。此外，可观察到膜表面出现大片细胞融合。

2.3 多细胞片层表面超微结构扫描电镜下可观察到脂肪干细胞沿着纤维增殖，形成沿着纤维方向的丝状伪足样结构(图4)。在局部纤维内也能观察到细胞的生长，可能是细胞在纤维支架内爬行和迁移所致。然而，在预定培养周期内，7∶3壳聚糖-胶原电纺膜并不能提供足够的空间使细胞增殖以达到汇合(图4)，而5∶5壳聚糖胶原膜则能为脂肪干细胞附着和结构塑形提供更好的支持(图4)。

2.4 细胞片层内细胞的活性研究“三明治”样脂肪干细胞片层内细胞的活性，对死细胞进行碘化丙啶染色，活细胞带有绿色荧光蛋白GFP显示绿色。与5∶5壳聚糖-胶原电纺膜上的细胞相比，在7∶3壳聚糖-胶原电纺膜上观察到更多的死细胞(红色)(图5)。整个操作过程中无细胞片层的破坏。

2.5 心肌特异蛋白在不同膜中的表达在经2周分化后，免疫荧光染色显示心肌特异性肌钙蛋白TnI和缝隙连接蛋白Cx43在“三明治”样多细胞片层中的表达(图6)。与7∶3壳聚糖-胶原电纺膜上的细胞相比，在5∶5壳聚糖-胶原电纺膜上有更多的细胞表达TnI和Cx43(红色)。整个操作过程中无细胞片层的破坏。

2.6 心肌特异性蛋白基因表达的定量分析流式分析显示，脂肪干细胞在7∶3壳聚糖-胶原电纺膜上培养分化后，TnI和Cx43蛋白表达率分别为42.25%和40.04%(图7)。然而，在5∶5壳聚糖-胶原电纺膜上培养，TnI和Cx43蛋白表达率分别增加到55.75%和50.3%，这说明5∶5壳聚糖-胶原电纺膜更利于脂肪干细胞的分化。Western blot定量分析结果与流式分析结果一致(图8)。

实时定量PCR结果显示，在5∶5壳聚糖-胶原电纺膜上细胞内α-skA、β-MHC、TnI、Cx43、ANP、GATA-4和Nkx2.5 mRNA的表达均高于7∶3壳聚糖-胶原电纺膜上培养的细胞(图9)。

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引言

近年来，大量研究表明组织工程方法可能是修复由于缺血而造成大面积心肌梗死的一种理想的治疗手段^[1-2]。组织工程支架材料对于心肌细胞再生起到重要作用，然而目前组织工程支架大多存在种子细胞分布不均匀及密度低等问题，严重阻碍工程化组织对损伤部位的修复功能。通过温敏培养获得的细胞片层不需要任何酶进行消化，保留原有细胞间连接，促进细胞间的相互作用，对维持细胞生长和生理功能有着重要作用^[3]，而且，细胞片层可作为一个薄而大的组织替代物用于大面积组织损伤治疗。因此对于心肌大面积梗死后修复，细胞片层被认为是一种极具前景的治疗方法。心肌梗死后大量心肌细胞丢失，此时，需要大量功能性细胞进行替代治疗。以前有研究通过心肌成纤维细胞、心肌细胞和骨骼肌细胞构建细胞片层，但有细胞来源及心律失常等问题^[4]。而通过干细胞构建的多细胞片层不仅可进行心肌细胞分化和新生血管的形成，分化后的干细胞片层可修复心肌梗死后薄层心肌壁，改善心肌收缩功能^[5]。有研究者通过移植单层间充质干细胞片层治疗大鼠心肌梗死，移植后形成一个包含新生血管、未分化细胞和分化心肌细胞的增厚组织^[6]。

尽管细胞片层技术已较成熟，但由于单细胞片层薄、机械强度差，在转移过程中极易破碎，给操作带来很大的困难。如果在细胞片层之间置于生物可降解，而且降解产物无毒无害的支撑膜，不仅可为细胞片层内细胞提供更多生长空间，有些生物材料作为细胞外基质，还可供给细胞营养，支持细胞生长，同时还可增加细胞片层的机械强度^[7-9]。理想的细胞片层支撑膜应具有合适的孔隙率、高表面积/体积比及三维多孔结构等，以利于细胞生长及营养物质的交换。天然生物大分子壳聚糖和胶原是组织工程运用最广的生物材料之一^[10-11]。壳聚糖是一种良好天然高分子生物材料，具有较好的生物相容性、生物可降解性、抗菌性及高度可塑型等特点^[12-14]。细胞外基质为细胞提供了一系列复杂的细胞调节信号分子，而胶原是细胞外基质主要成分之一^[10-11]，胶原可促进细胞黏附于壳聚糖电纺生物膜上，而壳聚糖可增强胶原电纺生物膜的机械强度。研究证实心肌组织特异性肌钙蛋白和缝隙连接蛋白43在心肌细胞中表达，具有高度特异性^[15]，现成为检测心肌表达重要靶点蛋白。

研究建立一种简易新型的“三明治”样多细胞片层(细胞-膜-细胞)制备方法，以壳聚糖-胶原电纺生物膜作为支持膜，在为细胞生长和营养物质交换提供更多空间的同时，可较容易从温敏培养表面将单细胞片层完整剥离，具有更强机械强度的三明治样多细胞片层易于操作，便于移植，薄层多细胞片层易于贴附于梗死心肌表面，因此，是一种更具有前景的心肌梗死治疗方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2016年1至12月在深圳大学医学院抗衰老与再生医学重点实验室完成。

1.3 材料

实验动物：8周龄健康整合含有绿色荧光蛋白基因大鼠，雌雄不拘，体质量200 g左右，由广东医学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(粤)：2014-0140。

主要试剂及仪器：壳聚糖(脱乙酰化90%)、Ⅰ型鼠尾胶原(相对分子质量在1-30万之间)(Sigma)；0.1%胶原酶和0.25%胰蛋白酶(Invitrogen)；碘化丙啶、荧光标记的二抗(Invitrogen)染剂；抗鼠一抗TnI和Cx43抗体(abcom)；高压静电纺丝装置(通力微纳，深圳)；扫描电子电镜(JCM-6000)；温敏培养皿(NUNC)；流式细胞仪(BD FACSCalibur，美国)；荧光显微镜(IX-71，Olympus，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 电纺生物膜的制备前期研究显示在壳聚糖-胶原电纺生物膜中，壳聚糖与Ⅰ型鼠尾胶原质量比分别为7∶3、5∶5电纺生物膜的物理化学特性更适于细胞生长^[16]，因此在此次实验中，将制备7∶3和5∶5壳聚糖-胶原电纺生物膜。具体步骤如下：分别将壳聚糖和Ⅰ型鼠尾胶原按照质量比7∶3和5∶5溶解在50%的2，2，2-三氟乙醇中，室温下搅拌4 h，制备15%壳聚糖-胶原电纺混合液。将电纺液置于高压静电纺丝装置中，调节电压10 kV，针头内径 0.8 mm，外径1 mm，针头与接收装置的距离为14 cm，给液速度为1 mL/h，通过玻璃纸纸覆盖于滚筒上进行电纺丝接收，制备成功的电纺生物膜室温真空干燥。通过扫描电镜观察膜表面结构，测量膜的厚度及纤维直径。

1.4.2 多细胞片层的构建通过改进的方法从表达绿色荧光蛋白大鼠的脂肪组织中分离获得脂肪干细胞并进行鉴定^[17]，将经过4代纯化后的脂肪干细胞用于实验。通过温敏培养皿将脂肪干细胞37 ℃培养3 d至完全长满后，将其置于20 ℃条件下孵育30 min，待细胞片边缘卷起后通过PVDF膜使其转移至另一长满细胞的温敏培养皿，移去PVDF膜，滴加少量培养液培养30 min，使转移的片层黏附后，补加培养基继续培养。此种方式所制备的多细胞片层薄弱，转移过程中易破碎。

1.4.3 “三明治”样多细胞片层构建将脂肪干细胞在温敏培养皿内37 ℃培养3 d至完全长满后，加入经紫外消毒的壳聚糖-胶原电纺膜，降低培养皿温度至20 ℃培养 15 min。待细胞片边缘卷起后，用镊子将电纺膜及细胞片层一同从温敏培养皿表面剥离，移至另一细胞生长完全融合的温敏培养皿表面，有细胞层一面朝上，培养30 min后，加入心肌细胞培养基进行培养。前期研究已证实心肌细胞培养基可诱导脂肪干细胞向心肌细胞分化^[18]。

1.5 主要观察指标

超微结构观察：构建的“三明治”样多细胞片层在4 ℃下2.5%戊二醛固定4 h，随后梯度乙醇脱水，风干过夜。扫描电镜观察细胞在电纺膜上生长状态，同时以无支撑膜的多细胞片层作为对照组。

细胞活性测定：“三明治”样多细胞片层培养2周后，加入10 mg/L 碘化丙啶染色30 min，而后用PBS冲洗3次，每次10 min，多光子显微镜观察细胞状态，并用lasersharp2000软件进行分析。

免疫细胞化学检测：诱导分化2周后，培养的多细胞片层用40 g/L多聚甲醛固定，0.1%TritonX-100透膜，体积分数4%羊血清封闭。一抗为抗鼠TnI和Cx43抗体4 ℃下孵育过夜，PE标记的二抗37 ℃孵育1 h，多光子显微镜进行荧光成像，并用lasersharp2000软件进行分析。流式细胞仪检测心肌组织特异性肌钙蛋白TnI和缝隙连接蛋白Cx43的定量表达，使用FACS Diva和FlowJo软件进行数据分析。

心肌特异性蛋白的表达：多细胞片层诱导培养2周后，RIPA裂解液裂解细胞，将裂解液于4 ℃下12 000 r/min离心5 min，取100 μg蛋白进行SDS-PAGE，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉室温封闭1 h。一抗为抗鼠TnI和Cx43抗体4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL化学发光检测免疫反应性蛋白。

心肌特异性基因的检测：诱导分化2周后的多细胞片层经Trizol裂解提取RNA，cDNA合成试剂盒合成第一链cDNA，实时定量PCR仪对特异性基因进行扩增分析，GAPDH作为内参。

1.6 统计学分析所有实验重复3次，计算其均值及标准差。通过单因素方差分析(ANOVA)和post hoc t 检验方法计算各组之间是否具有显著性差异，单因素方差分析具有显著差异后(P < 0.05)再进行post hoc t 检验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

目前，细胞治疗对于轻度心肌梗死具有一定疗效，但由于心肌细胞再生能力差，细胞移植很难改善大面积心肌梗死。为了提高移植后心肌细胞数量、活性及其功能，提供一种能模拟人体正常心肌组织基质成分和结构，维持生物化学及电生理特性的生长环境，对于移植的细胞尤为重要^[19]。由于细胞片层的获得不需要酶消化，保持着原有细胞之间连接，因此，细胞片层对于大面积心肌梗死可能是一种更好的细胞替代治疗方法^[20]。细胞片层采用温皿培养技术，完全保留原有细胞外基质，拥有完整细胞外基质的细胞片层能够直接黏附在损伤部位，避免了纤维胶和手术缝合给移植手术带来的不便。因此，细胞片层被认为是心肌组织再生的一种更好的组织工程方法^[21-22]。

前期实验中，尝试在没有任何支撑膜情况下构建脂肪干细胞片层^[21]，实验过程中发现很难将细胞片层进行转移和移植。在此次研究中，以无支撑膜的多细胞片层为对照组，通过PVDF膜将细胞片层从温敏培养皿表面剥离，并将其接种到细胞生长已融合的温敏培养皿中，去除PVDF膜以形成多细胞片层。由于多细胞片层薄而机械强度差，结构稳定性差，因此当多细胞片层从温敏培养表面剥离过程中片层极易破损，严重影响了多细胞片层实际运用的可行性^[23]，也很难制备出与生理组织类似厚度和强度的细胞片层。为了提高多细胞片层移植物的厚度及强度，以达到移植部位组织的物理特性，一些研究者采用多次移植的方法，移植10次后可制备约1 mm厚度的可搏动的心肌复合组织^[24]。但多次移植显著增加成本的同时也引发一些并发症。通过引入了壳聚糖-胶原电纺膜作为支持膜，发现随着胶原蛋白比例的增加，膜的亲水性也相应增加，而机械强度随着壳聚糖的增加而增加，但如果壳聚糖含量太高，生物膜反而变得脆弱。由于壳聚糖-胶原电纺膜的多孔纤维结构而具有良好的渗透性，显著增加了细胞间营养物质交换及代谢废物的转移^[24-26]，理论上，可支持很厚的多细胞片层的生长。此外，高度亲水的电纺生物膜具有极强的可塑性，适于不同的解剖结构，可通过简单操作移植单层或多层细胞片层到损伤部位进行治疗。

利用脂肪干细胞构建多细胞片层移植治疗心肌梗死有如下优势：首先，前期实验研究表明，脂肪干细胞具有很强的增殖能力和重叠生长性质^[17]，因此可在生物膜上形成厚的替代物来修复心肌损伤；其次，脂肪干细胞可分泌血管生成相关因子^[27-28]，促进脂肪干细胞片层中新生血管形成；第三，脂肪干细胞多向分化潜能可促进心肌组织重建，改善心肌梗死后心脏功能^[17，29]，因此，由脂肪干细胞构成的移植物在改善心肌梗死后的左心室重塑起到重要作用。当脂肪干细胞片层从温敏表面剥离后，可能由于细胞骨架拉伸后重组，细胞片层变得更紧凑。如果要通过简单方法收获完整的细胞片层，细胞生长完全汇合是非常重要的环节，脂肪干细胞在5∶5壳聚糖-胶原电纺膜上时，经三四天生长便汇合，较7∶3壳聚糖-胶原电纺膜上的脂肪干细胞具有更强的增殖能力；从7∶3壳聚糖-胶原电纺膜的细胞片层中观察到更多的死细胞，其原因可能是壳聚糖分子表面物理化学特性不利于细胞生长。与天然细胞外基质相比，壳聚糖相对疏水，壳聚糖含量更高的电纺膜(壳聚糖-胶原7∶3)接触角更小，这意味着壳聚糖依旧保留其疏水性，没有任何利于生物活性分子黏附的功能基团，不能特异性与细胞进行相互作用。然而，胶原的添加对于壳聚糖电纺生物膜表面特性有重要改进，胶原使膜具有亲水性，因为细胞更容易附着在亲水性强物质的表面上^[30]，因而很大程度上促进了细胞的黏附。因为壳聚糖结构内部存在D-葡糖胺重复单元，再加上其结晶度和形成氢键的能力，因此很难溶于普通的有机溶剂。此外，壳聚糖作为一种阳离子聚合物，严重影响了壳聚糖溶液的流变性^[31]，使壳聚糖溶液很难电纺获得纤维。随着胶原的加入，不仅使可纺性提高，而且电纺膜的机械强度也随之增加，这对细胞片层内细胞功能和移植过程中可操作性有重要意义。

除了促增殖能力，在5∶5壳聚糖-胶原电纺膜上的脂肪干细胞同样展示更好的分化潜能。在以往研究中证实，心肌细胞条件培养基能促进脂肪干细胞向心肌细胞分化^[18，29]，因此在此次研究中采用同样的方法进行诱导分化，所检测到的心肌特异性肌钙蛋白及缝隙连接蛋白43表明心肌肌节及细胞缝隙连接的出现。经过2周诱导培养后，5∶5壳聚糖-胶原电纺膜所构建的“三明治”样多细胞片层上有更多心肌特异性肌钙蛋白及缝隙连接蛋白43的表达，更能促进脂肪干细胞向心肌细胞分化。缝隙连接蛋白43用于偶联各心肌细胞电生理活动，与各心肌细胞之间电信号传导及节律性收缩密切相关。细胞片层表面表达的大量缝隙连接蛋白43可能与片层间快速偶联电传导有关。此外，细胞片层内细胞外基质可作为一种黏附物质加速细胞片层之间紧密附着，以及促进缝隙连接前体蛋白相互作用，刺激细胞片层之间的电传导及功能性缝隙连接形成。

研究中细胞-膜-细胞“三明治”样细胞片层能形成与正常心肌组织类似的致密的组织结构，并且在细胞片层内初步形成细胞间的缝隙连接。壳聚糖-胶原电纺生物膜作为支撑膜使细胞片层的转移更简便，可操作性更强。下一步实验，将所构建的分化的多细胞片层进行大鼠心肌梗死移植治疗，体内检测多细胞片层的修复作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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尽管细胞片层技术已较成熟，但由于单细胞片层薄、机械强度差，在转移过程中极易破碎，给操作带来很大的困难。如果在细胞片层之间置于生物可降解，而且降解产物无毒无害的支撑膜，不仅可为细胞片层内细胞提供更多生长空间，有些生物材料作为细胞外基质，还可供给细胞营养，支持细胞生长，同时还可增加细胞片层的机械强度。理想的细胞片层支撑膜应具有合适的孔隙率、高表面积/体积比及三维多孔结构等，以利于细胞生长及营养物质的交换。天然生物大分子壳聚糖和胶原是组织工程运用最广的生物材料之一。壳聚糖是一种良好天然高分子生物材料，具有较好的生物相容性、生物可降解性、抗菌性及高度可塑型等特点。细胞外基质为细胞提供了一系列复杂的细胞调节信号分子，而胶原是细胞外基质主要成分之一，胶原可促进细胞黏附于壳聚糖电纺生物膜上，而壳聚糖可增强胶原电纺生物膜的机械强度。研究证实心肌组织特异性肌钙蛋白和缝隙连接蛋白43在心肌细胞中表达，具有高度特异性，现成为检测心肌表达重要靶点蛋白。研究建立一种简易新型的“三明治”样多细胞片层（细胞-膜-细胞）制备方法，以壳聚糖-胶原电纺生物膜作为支持膜，在为细胞生长和营养物质交换提供更多空间的同时，可较容易从温敏培养表面将单细胞片层完整剥离，具有更强机械强度的三明治样多细胞片层易于操作，便于移植，薄层多细胞片层易于贴附于梗死心肌表面，因此，是一种更具有前景的心肌梗死治疗方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

脂肪干细胞结合电纺生物膜制备“三明治”样心肌片层

Combined use of adipose-derived stem cells and electrospun membrane for preparing sandwich-like cardiac cell sheets

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