复合胶原海绵材料的体内外止血效果

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

胶原的止血机制：主要包括两个方面，一方面，由于胶原分子具有极强的亲水性，可在接触到创面时吸附创面最初的渗血，使自身紧密黏附于创面并不断聚集渗血形成血痂，阻塞断裂的血管，完成止血过程；另一方面，血液中的血小板可以胶原为平台加速聚集，同时，胶原也可刺激血小板进一步释放凝血因子，进一步加速机体的内源性凝血机制，两方面作用相互加强，可以完成对创面的迅速高效止血。当止血过程结束后，胶原材料还可在机体内自行降解，不需要额外拆除，使用方便。

透明质酸：是存在于哺乳动物细胞外基质的糖胺聚糖，透明质酸的水溶液有很大黏性，在体内可控制细胞和分子的渗透及某些细胞的分化，免疫原性低，不会引起炎症和异体反应，还有良好的生物相容性和生物降解性，被广泛用于止血材料。

钙离子：作为血液凝固不可或缺的一个重要因子，有着重要的生理和生化功能，它通过与蛋白质等生物大分子相互作用，引起这些生物大分子构象的改变，在生物分子中产生活性中心或成为结构中心。从参与到血液凝固与其他凝血因子相比，在止血方面具有双重作用，当血液中钙离子浓度在一定范围内对血液凝固有促进作用，而超过一定范围时，则有明显延缓甚至抗凝作用。

背景：胶原材料具有良好的止血效果，但是单一胶原止血材料的吸水能力有限，血液浓缩效果不佳，所以止血效率并不理想。

目的：观察复合胶原海绵止血材料的体内外止血效果。

方法：以胶原、透明质酸和氯化钙为原料、碳化二酰亚胺为交联剂，制备复合胶原海绵止血材料。①细胞毒性实验：分别以复合胶原海绵止血材料浸提液、苯酚溶液及细胞培养液培养L929小鼠成纤维细胞，培养第2，4，7天，MTT法检测细胞增殖，判定材料毒性；②材料与全血的关系：将兔抗凝血分别滴于复合胶原海绵止血材料、进口止血材料及国产止血材料表面，扫描电镜观察材料与全血的关系；③体外凝血活性：将兔抗凝血分别滴于复合胶原海绵止血材料、进口止血材料及国产止血材料表面，采用凝血指数检测凝血效果；④体内止血效果：钻透18只兔肝叶，随机分3组，分别以复合胶原海绵止血材料、进口止血材料及国产止血材料止血，检测出血时间及出血量。

结果与结论：①复合胶原海绵材料的细胞毒性为1级，合格；②与进口和国产止血材料相比较，复合胶原海绵止血材料既有利于血液中水分继续向纵深吸收又能同时网络血红蛋白、血小板等形成凝血块，还可看到孔隙交替向内部延伸，形成交替复杂的海绵状；③复合胶原海绵止血材料的凝血指数显著低于进口、国产止血材料(P < 0.05)；④复合胶原海绵止血材料组的出血时间及出血量明显低于进口止血材料组、国产止血材料组(P < 0.05)；⑤结果表明，复合胶原海绵止血材料具有的良好止血效果及生物相容性。

ORCID: 0000-0003-4121-5211(孙磊)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 胶原, 透明质酸, 交联, 微观结构, 止血

Abstract:

BACKGROUND: Collagen has good hemostatic effect, but the single collagen hemostatic material has no ideal hemostatic efficiency due to limited water absorption capacity and poor blood concentration effect.

OBJECTIVE: To observe the hemostatic effect of composite collagen sponge in vivo and in vitro.

METHODS: Collagen, sponge and calcium chloride were used as raw materials to prepare composite collagen sponge. (1) Cell toxicity test: Mouse L929 cells were cultured using composite collagen sponge extract, phenol solution and cell culture medium for 2, 4, 7 days. Then, cell proliferation was detected by MTT to evaluate cell toxicity. (2) The relationship between the material and the whole blood: The relationship between the materials and the whole blood was observed by scanning electron microscope among composite collagen sponge, imported hemostatic materials and domestic hemostatic materials, following dripping the rabbit's anticoagulant blood onto the material surface. (3) In vitro coagulation activity: Blood Clotting Index was used to detect the effect of coagulation among composite collagen sponge, imported hemostatic materials and domestic hemostatic materials, following dripping the rabbit's anticoagulant blood onto the material surface. (4) Liver leaves from 18 rabbits were drilled, and then randomly divided into three groups covered with composite collagen sponge, imported hemostatic materials and domestic hemostatic materials, respectively. Bleeding time and bleeding volume were measured.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The cytotoxicity of composite collagen sponge was qualified as grade 1. (2) Compared with imported and domestic hemostatic materials, composite collagen sponge was conducive to blood water absorption but also to the further network hemoglobin and platelet clot formation, and the pores alternately extended to the interior to form the alternating complex sponge. (3) The blood clotting index of composite collagen sponge was significantly lower than that of imported and domestic hemostatic materials (P < 0.05). (4) The bleeding time and bleeding volume of composite collagen sponge were significantly lower than those of imported and domestic hemostatic materials (P < 0.05). Overall, the composite collagen sponge as a hemostatic material has good hemostatic effect and biocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Hyaluronic Acid, Collagen, Hemostasis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

靳少锋，綦惠，舒雄，杰永生，郑蕊，陈磊，孙磊. 复合胶原海绵材料的体内外止血效果[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(2): 216-221.

Jin Shao-feng, Qi Hui, Shu Xiong, Jie Yong-sheng, Zheng Rui, Chen Lei, Sun Lei .

In vivo and in vitro hemostatic effects of composite collagen sponge

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(2): 216-221.

图/表（结果） 3

2.1 复合胶原海绵止血材料的细胞毒性培养第2，4，7天，实验组A值均显著高于阳性对照组(P < 0.05)；与阴性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。根据A值计算培养第2，4，7天实验组组细胞相对增殖率分别为(98.0±8.5)%、(99.0±2.8)%、(96.0±3.6)%，材料细胞毒为1级，合格。

2.2 复合胶原海绵止血材料的微结构及与全血相互作用的观察与进口止血材料和国产止血材料相比较，优化后的复合胶原海绵止血材料具有丰富的多孔结构且空间较大，从横截面看，可看出多孔结构的大小孔分布相对均匀(图1A，B，C)，同时凝血过程中既有利于血液中水分继续向纵深吸收又能同时网络血红蛋白、血小板等形成凝血块；还可看到孔隙交替向内部延伸，形成交替复杂的海绵状(图1D，E，F)。

2.3 复合胶原海绵止血材料的体外凝血活性测定与进口材止血料和国产止血材料相比较，复合胶原海绵止血材料的体外凝血指数显著下降(23.145±1.145，38.126± 2.278，18.285±2.146，P < 0.05)，体外凝血活性测定表明复合胶原海绵止血材料的凝血效果显著提高。

2.4 复合胶原海绵止血材料的体内止血效果在新西兰兔标准肝创伤模型中采用失血量(g)和止血时间(s)作为考察指标，结果见表2所示：与进口止血材料组和国产止血材料组相比较，实验组失血量(g)和止血时间(s)均显著性地减小 (P < 0.05)，这个与体外凝血指数测试的结果相吻合；与进口止血材料组和国产止血材料组相比较，实验组失血量分别减少了25%和100%，止血时间则分别缩短了27%和65.9%，其差异均达到显著水平(P < 0.05)。动物活体实验结果表明，复合胶原海绵止血材料不但明显缩短了肝缺损的止血时间，同时也明显减少了失血量，具有应用于临床止血的潜力。

参考文献

[1]Broekema FI,van Oeveren W,Boerendonk A,et al.Hemostatic action of polyurethane foam with 55% polyethylene glycol compared to collagen and gelatin.Biomed Mater Eng.2016; 27(2-3):149-159.

[2]Yang JC.Causes of Death in Patients with Trauma Emergency Surgery.Chin Foreign Med Res.2016.

[3]Gerdin M,Roy N,Khajanchi M,et al.Validation of a novel prediction model for early mortality in adult trauma patients in three public university hospitals in urban India.BMC Emerg Med.2016;16:15.

[4]Santos Tde S,Abuna RP,Almeida AL,et al.Effect of collagen sponge and fibrin glue on bone repair.J Appl Oral Sci.2015; 23(6):623-628.

[5]Mahesh L,Kurtzman GM,Shukla S.Regeneration in Periodontics: Collagen-A Review of Its Properties and Applications in Dentistry.Compend Contin Educ Dent.2015; 36(5):358-363.

[6]Wang Y,Ni H.Fibronectin maintains the balance between hemostasis and thrombosis.Cell Mol Life Sci. 2016;73(17): 3265-3277.

[7]Six KR,Devloo R,Van Aelst B,et al.A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time.J Vis Exp. 2017;(120). doi: 10.3791/55351.

[8]Fiorica C,Palumbo FS,Pitarresi G,et al.Hyaluronic acid and beta cyclodextrins films for the release of corneal epithelial cells and dexamethasone.Carbohydr Polym. 2017;166: 281-290.

[9]Fan J,Yang J.Preparation and characterization of a chitosan/galactosylated hyaluronic acid/heparin scaffold for hepatic tissue engineering.J Biomater Sci Polym Ed. 2017; 28(6):569-581.

[10]do Nascimento MHM,Ferreira M,Malmonge SM,et al.Evaluation of cell interaction with polymeric biomaterials based on hyaluronic acid and chitosan.J Mater Sci Mater Med. 2017;28(5):68.

[11]Li H,Cheng W,Liu K,et al.Reinforced collagen with oxidized microcrystalline cellulose shows improved hemostatic effects. Carbohydr Polym.2017;165:30-38.

[12]Fernandez RS, Lee A.Effects of methods used to achieve hemostasis on radial artery occlusion following percutaneous coronary procedures: a systematic review.JBI Database System Rev Implement Rep.2017;15(3):738-764.

[13]Smith RB,Coughlin A.Thyroidectomy Hemostasis.Otolaryngol Clin North Am.2016;49(3):727-748.

[14]Kirsch WM,Hudson SM,Crofton A.Composition, preparation, and use of chitosan shards for biomedical applications. Dataroom Biotechnology,2016.

[15]Li J,Wei CP,Wang FM,et al.Preparation and Performance Research of Hemostatic Powder of Chitosan Mixed with Scutellaria baicalensis.Mater Sci Forum.2016;852:1277-1281.

[16]Zhu S,Lu Y,Sinno T,et al.Dynamics of Thrombin Generation and Flux from Clots during Whole Human Blood Flow over Collagen/Tissue Factor Surfaces.J Biol Chem. 2016;291(44): 23027-23035.

[17]Ivanciu L,Stalker TJ.Spatiotemporal regulation of coagulation and platelet activation during the hemostatic response in vivo.J Thromb Haemost.2015;13(11):1949-1959.

[18]Cheng X,Shao Z,Li C,et al.Isolation, Characterization and Evaluation of Collagen from Jellyfish Rhopilema esculentum Kishinouye for Use in Hemostatic Applications. PloS One. 2017;12(1): e0169731.

[19]Pippi R,Santoro M,Cafolla A.The Use of a Chitosan-Derived Hemostatic Agent for Postextraction Bleeding Control in Patients on Antiplatelet Treatment.J Oral Maxillofac Surg. 2017;75(6):1118-1123.

[20]Barba JD,Tranquilan-Aranilla C,Abad LV.Hemostatic potential of natural/synthetic polymer based hydrogels crosslinked by gamma radiation.Radiat Phys Chem.2016;118:111-113.

[21]Diehn K,Dowling M,Raghavan SR,et al.Advanced functional biocompatible polymer putty used as a hemostatic agent for treating damaged tissue and cells.WIPO Patent Application WO,2014.

[22]Wang FM,Wei CP,Lu J,et al.Preparation and Properties Characterization of Modified Chitosan Composited Hemostatic Materials.Mater Sci Forum.2016;852:1271-1276.

[23]Lan G,Lu B,Wang T,et al.Chitosan/gelatin composite sponge is an absorbable surgical hemostatic agent.Colloids Surf B Biointerfaces.2015;136:1026-1034.

[24]Son SR,Sarkar SK,Nguyen-Thuy BL,et al.Platelet-rich plasma encapsulation in hyaluronic acid/gelatin-BCP hydrogel for growth factor delivery in BCP sponge scaffold for bone regeneration.J Biomater Appl.2015;29(7):988-1002.

[25]Zhou Q,Zhang Y,Lin D,et al.The relationships of meteorological factors and nutrient levels with phytoplankton biomass in a shallow eutrophic lake dominated by cyanobacteria, Lake Dianchi from 1991 to 2013.Environ Sci Pollut Res Int.2016;23(15):15616-15626.

[26]Jaikumar D,Baskaran B,Vaidyanathan VG.Effect of chromium(III) gallate complex on stabilization of collagen.Int J Biol Macromol.2017;96:429-435.

[27]Duan L,Yuan J,Yang X, et al.Interaction study of collagen and sericin in blending solution.Int J Biol Macromol.2016;93(Pt A): 468-475.

[28]Nicolás M,Peña E,Malvè M,et al. Mathematical modeling of the fibrosis process in the implantation of inferior vena cava filters.J Theor Biol.2015;387:228-240.

[29]Norouzi M,Shabani I,Ahvaz HH,et al. PLGA/gelatin hybrid nanofibrous scaffolds encapsulating EGF for skin regeneration.J Biomed Mater Res A.2015;103(7):2225-2235.

[30]Huang W,Wang Y,Chen Y,et al.Strong and Rapidly Self-Healing Hydrogels: Potential Hemostatic Materials.Adv Healthc Mater.2016;5(21):2813-2822.

[31]Tan H, Wu B, Li C, et al. Collagen cryogel cross-linked by naturally derived dialdehyde carboxymethyl cellulose. Carbohydr Polym.2015;129:17-24.

[32]Sun L, Li B, Jiang D, et al. Nile tilapia skin collagen sponge modified with chemical cross-linkers as a biomedical hemostatic material. Colloids Surf B Biointerfaces.2017; 159:89-96.

引言

出血是城市交通事故伤的第二大杀手，是战争创伤中的第一大杀手，同时也是创伤患者手术室死亡的主要原因^[1-3]。突发性事故的急救和手术过程中，单纯的外科包扎、手术止血不能完全控制出血，或者因粘连或继发的严重组织损伤，而导致患者再次手术甚至死亡。而快速、有效的止血材料的使用可以明显降低出血量，为患者的抢救、治疗赢得时间，并能够降低并发症、节约成本及降低死亡率^[4]。

胶原止血材料具有抗原性低，与血小板产生血凝作用等特点，因而在医药领域应用十分广泛。胶原的止血机制主要是其对血小板的作用，缩短血栓形成时间。血管受损时，胶原能引起血小板聚集，并能刺激血小板释放一些亚细胞颗粒和分泌物，包括各种凝血因子、凝血因子黏附在受损血管上，以填塞受伤血管，达到止血目的^[5-7]。但是单一胶原止血材料的吸水能力有限，血液浓缩效果不佳，所以止血效率并不理想。透明质酸是存在于哺乳动物细胞外基质的糖胺聚糖，透明质酸的水溶液有很大黏性，在体内可控制细胞和分子的渗透及某些细胞的分化，免疫原性低，不会引起炎症和异体反应，还有良好的生物相容性和生物降解性，被广泛用于止血材料^[8-10]。另外，钙离子结构最为简单，也最容易控制和清除，在正常血液凝固机制中发挥不可替代的作用，血小板胞浆内钙离子浓度的升高是血小板活化的标志，也是血小板活化的初始因素之一，并全程参与到血小板活化、黏附、聚集及血栓形成过程。此次研究的目的是制备含有胶原、透明质酸和氯化钙的复合胶原止血材料，促进其止血效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计动物体内外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年4至11月在北京市创伤骨科研究所完成。

1.3 材料国产止血材料倍菱购自北京益尔康生物工程开发中心；进口止血材料艾微停购自巴德医疗科技(上海)有限公司；新鲜牛跟腱市售；乙醇、乙酸和氯化钠购自北京市化学试剂公司；氯化钙、甘油、碳化二亚胺、胃蛋白酶和透明质酸钠购自sigma公司；DMEM/F-12培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Bioshorp公司；甲醛、苏木精、伊红等组织切片和染色用试剂购自北京赛驰生物科技有限公司；L-929小鼠成纤维细胞由北京市创伤骨科研究所提供；

实验动物：健康成年雄性新西兰大白兔18只，普通级，体质量约为2.0 kg，购自北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂，许可证号：SCXK(京)2006-0003。所有动物实验方案均北京积水潭医院伦理委员会批准。

实验用仪器：冷冻干燥机(上海比朗仪器有限公司)；紫外分光光度计(Perkin Elmer公司)；电热恒温鼓风干燥(上海天恒医疗器械有限公司)；电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)；精密酸度计(上海大普仪器有限公司)；多用振荡器(金坛市科兴仪器厂)；扫描电子显微镜(日本日立公司)；水平摇床(美国精骐)；磁力搅拌器(IKA公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 胶原的提取风干牛跟腱5 g，剪碎，置于0.5 mol/L乙酸溶液中，并加入2.5 g胃蛋白酶，匀浆机匀浆；4 000 r/min离心30 min，取上清，加入20%NaCl 500 mL；4 000 r/min离心15 min，弃上清；取沉淀，约100 mL，加入蒸馏水 400 mL，乙酸15 mL；置于透析袋，透析4 d，每日换水。透析结束后，冷冻干燥保存备用。

1.4.2 复合胶原海绵止血材料的制备将胶原冷冻产物溶于0.3%乙酸，加入0.2 g的透明质酸，搅拌均匀，倒入负压罐，排出气泡后，将混合液倒入模具，溶液厚度为1- 5 mm，冷冻干燥获得防粘连层。胶原冷冻产物溶于0.3%乙酸，加入0.1 g的CaCl₂和0.5 g的甘油，搅拌均匀，浇筑在防粘连层表面，冷冻干燥后，形成2-10 mm的双层复合止血材料，最好将冻干海绵浸入含有50 mmol/L碳化二亚胺的体积分数95%乙醇溶液中，常温浸泡4 h，待反应完成后，用去离子水洗样品数后冻干，⁶⁰Co辐照消毒后备用。

1.4.3 复合胶原海绵止血材料的细胞毒性检测

复合胶原海绵止血材料浸提液的制备：将复合胶原止血海绵(3 cm×3 cm)浸入10 mL的DMEM低糖完全培养液， 37 ℃孵箱内分别孵育48 h，取上清液，2倍稀释。

细胞毒性实验：根据GB/T 16175-2008和GB/T 16886.5-2003/ISO 10993-5:1999规定的方法进行细胞毒性检测。复苏L-929细胞，胰蛋白酶传代至第3代，每孔100 μL，细胞浓度4×10⁷ L^-1铺板，分3组培养，实验组加入复合胶原海绵止血材料浸提液200 μL，阳性对照组加入64 g/L苯酚溶液200 μL，阴性对照组加入细胞培养液200 μL。细胞贴壁1，3，6 d后(即第2，4，7 天测值)。加DMSO 150 μL，震荡 10 min。酶标仪上，490 nm被长下测吸光值，取平均值。每孔加MTT(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育4 h，弃上液控干，每孔加150 μL DMSO，混匀震荡10 min，490 nm酶标仪测定A值。计算细胞相对增殖率：细胞相对增殖率=(实验组A-阳性对照组A)/(阴性对照组A-阳性对照组A)×100%，数值≥100%，为0级，证明无任何细胞毒性，材料合格；数值在75%-99%之间，为1级，极低细胞毒性，材料合格。

1.4.4 复合胶原海绵止血材料与兔全血之间关系的观察取直径7 mm的复合胶原海绵止血材料、国产止血材料和进口止血材料，表面滴加10 µL抗凝兔血，随后将其置于戊二醛溶液中固定，在扫描电镜下观察3种材料与兔全血之间的关系。

1.4.5 复合胶原海绵止血材料的体外凝血活性检测根据Shih等的研究方法^[11]，研究采用凝血指数BCI进行体外凝血测试。将同等质量的国产止血材料、进口止血材料及复合胶原海绵止血材料置于烧杯中，抽取200 µL家兔抗凝全血缓慢滴入样品中，之后加入0.2 mol/L CaCl₂20 µL启动血液凝固，5 min后往烧杯中加入25 mL的去离子水，在 37 ℃恒温下5 min，随后取出溶液，用紫外分光光度计在波长为540 nm下测其吸光度值。另将0.1 mL血液，用水稀释为25 mL后，同波长下所测的A值假定为100为参考值，则凝血指数BCI为：BCI=100×样品A/参考A，凝血指数BCI的数值越低凝血效果越好，各样品重复进行平行实验5次。

1.4.6 复合止血材料的体内止血效果检测将18只新西兰大白兔随机分为3组，每组6只。第1组为实验组，使用复合胶原海绵止血材料；第2组为国内止血材料组，第3组为进口止血材料组。采用3%戊巴比妥钠的耳缘静脉注射麻醉新西兰兔，仰卧固定于手术台上，逐层纵向开腹，无菌纱布吸干腹腔、腹壁上的组织液和血液。暴露肝脏，找到右中叶，在距离下缘约0.5 cm处，以7 mm眼科环钻将肝叶钻透。自由出血25 s后，将止血材料贴附在缺损处，立刻在材料上方铺上预先称质量的无菌纱布，并在纱布上放置铁片压迫。立刻开始计时，每隔40 s，观察1次，如不再渗血，证明血止住，记录时间，为出血时间。纱布称质量，质量差为出血量。

1.5 主要观察指标复合胶原海绵止血材料的体内外止血效果。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0 统计软件进行数据处理，计量资料以x(_)±s表示，两组计量资料之间的比较采用t 检验；组间计量资料均值的比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，均以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

众所周知，出血是外科手术、创面损伤及各种意外事故中的常见现象，会给人们的健康及生活带来诸多风险和危害。同时，出血时血液中渗出的纤维蛋白，造成纤维组织和蛋白的沉积，易发生出血部位粘连，不利于创面愈合。而大的出血则直接威胁人类或动物的生命。调查表明，创伤类患者有大部分一半以上死于大出血。因此快速、理想、有效的止血防粘连材料和方法一直是国内外研究的热点，各国的材料学家和医学家们都在力图研制开发出新型防粘连止血材料，如若材料在防粘连和止血的同时，能够促进组织损伤的修复，则更有利于其的临床应用，但上述材料在面对复杂的创面部位及形状时，或者大面积弥漫性出血时，效果欠佳^[12-15]，因此针对传统止血方式的局限性，开发新型高效止血材料就显得十分必要，理想的止血材料应具备以下特点：止血迅速、无毒性、无抗原性、不增加感染概率、不影响组织愈合、价格便宜。但是目前尚无这种理想材料，因此开发出新一代的快速止血和功能性止血材料势在必行，只要这样才能适应更高的手术要求，为人类健康提供良好保障。

近年来关于止血材料的研究飞速发展，各种止血材料的层出不穷，常用的止血材料有：胶原海绵、氧化再生纤维素、可吸收明胶海绵、壳聚糖等，其中国内外对胶原蛋白止血材料的研究历时很久，研究成果报道较多，开发出诸多剂型，如粉状、片状、纤丝装、棉絮状及海绵状等。将如对于窄而深的创面以粉末或棉絮状填充效果较好，对于宽而浅的创面使用海绵状的材料效果较好。通过采用冷冻干燥技术可以制备适用于临床需要的，冷冻干燥得到的胶原止血海绵表面均一完整，整体呈三维形态，在效果较好，还可以通过改变预冻温度，浓度来调节材料的孔径结构，实现微结构可控。因此，目前冷冻干燥技术被广泛的应用于材料的制备，但是经过人工处理胶原很难保持其自然的状态，相关性能总会有所下降，因此，近些年尝试对胶原材料进行相关改性来提升其性能，进一步优化其性能。

胶原蛋白作为生物止血材料具有其特有的优势，具有或长或短的三螺旋结构、即胶原每根肽链形成一股左手螺旋，其中每3个氨基酸残基形成一个螺旋，3条左手螺旋再形成一个紧密的右手大螺旋。各型胶原的结构差异主要是由多肽链的初级结构，即氨基酸组成和顺序所不同所致，因此导致大分子形态和生物性能差异。分子内及分子间的共价交联结构、典型的(Gly-X-Y)结构(X、Y 分别代表脯氨酸和羟基脯氨酸)。胶原这种结构使胶原具有其特有的性质，如高拉伸强度、生物相容性、生物降解性能、低刺激性、低抗原性和低细胞毒性及促进细胞增殖分化等。决定了它具有重要的生物学功能：它不仅构成细胞外基质的骨架结构；且与细胞相互作用并影响细胞的形态、骨架组装及增殖与分化。而且由于哺乳动物的同型胶原在氨基酸的种类、数目和排列基本相同，因此在止血效果具有明显的作用。目前其止血机制主要包括2个方面：一方面，由于胶原分子具有极强的亲水性，可在接触到创面时吸附创面最初的渗血，使自身紧密黏附于创面，并不断聚集渗血形成血痂，阻塞断裂的血管，完成止血过程；另一方面，血液中的血小板可以胶原为平台加速聚集，同时，胶原也可刺激血小板进一步释放凝血因子，进一步加速机体的内源性凝血机制，两方面作用相互加强，可完成对创面的迅速高效止血，当止血过程结束后，胶原材料还可在机体内自行降解，不需要额外拆除，使用方便^{[11, 16-18]}。由于胶原具有促进血小板聚集和释放凝血因子的作用，是一种非常理想的止血材料，与其他常用止血剂相比，止血效率较高，不良反应小，但是止血时间相对较长，而降解时间短，并且力学强度和亲水性均不佳，甘油可以增加材料的亲水性和柔韧度。钙离子是第Ⅳ凝血因子，参与凝血过程，通过钙离子释放到伤口诱导血小板活化，可以起到缩短止血时间的作用。聚合物的加入有利于延长材料的降解时间，并增强其力学强度。

目前胶原的提取方法分2种：生物材料提取和生物化学工程合成法。目前，从生物材料提取的技术路线相对成熟，具体方法主要包括酶法、酸法、碱法及酶酸混合法等，前3种方法都均存在一些不足，可能会导致胶原的少量变性及三螺旋结构的破坏，采用酸酶结合法从动物组织中提取胶原，将会弥补单一方法所引起的缺陷，而且提纯的胶原纯度满足止血需求，通过生物材料提取胶原，由于内部的共价键被破坏，因此力学强度不足，同时分解较快，需要在用交联剂处理。交联方法可以分为物理交联和化学交联。物理方法改性胶原的优点是可避免残留外源性有毒化学物质，缺点是胶原交联度低，交联不彻底。化学交联法存在着引入外源有毒试剂，残留实际难清除等缺点。但是到目前为止还没有发现对能够满足的各种需求的理想交联剂。

目前，市场上应用的止血材料已从单一的胶原止血材料发展到胶原与其他组分(如壳聚糖、高分子聚合物等)混合的材料，但混合材料的韧性仍旧不理想，实际应用中存在着胶原吸收了血液后会与其他材料相互影响，从而削弱了各自止血效果的缺陷^[19-23]。因此，亟需研制一种在原有单一或复合胶原止血材料的基础上，采用物理或化学的方法复合多种成分组成的新型多功能止血材料，在增强止血效果的同时，提高材料的吸水性和韧性，延缓材料在体内的降解，最大限度地防止粘连并具备一定程度地促进组织修复的功能。透明质酸也属于糖胺聚糖类物质，目前被广泛用于组织工程中。Park等研究了采用水溶的碳化二酰亚胺交联多孔的胶原/透明质酸复合膜。在碳化二酰亚胺的作用下，胶原和透明质酸之间形成了酰胺键和酯键达到交联^[24]。Lee等为了改善传统冷冻干燥法制备胶原基支架孔隙率不足的问题，自制了一种设备，创造出了透明质酸和胶原基生物功能化支架的制备条件，并成功制备出高孔隙率和孔径均一的支架材料，测试表明细胞在其表面具有较快的生长能力^[25]。

实验采用胶原蛋白和透明质酸及氯化钙混合后的复合胶原止血材料^[26]，研究表明透明质酸控制胶原成纤维的形成，通过碳化二酰亚胺交联的胶原蛋白-透明质酸复合材料细胞毒为1级，在可接受范围内；通过实验发现复合胶原止血材料呈白色疏松多孔海绵状，微结构均匀，后续可通过碳化二酰亚胺交联胶原蛋白和透明质酸的时间、浓度、配比等来更进一步优化材料的微结构。此外，体外观察可降解、吸收止血材料的凝血活性和体内失血量、止血时间是评价止血材料的重要指标^[27]，通过与进口止血材料组和国产止血材料组比较，复合胶原止血材料与全血相互作用，形成交替复杂的海绵状，与血液的关系良好；另外，在新西兰兔标准肝创伤模型中采用复合胶原止血材料后，肝缺损的失血量和止血时间则都得到了极大改善，而且复合材料与创面紧密黏附，避免了创面与其他组织的粘连，这可能是由于复合材料加入透明质酸及交联剂后，由亲水作用和保湿作用避免这类情况的发生。

基于复合胶原蛋止血材料良好的止血效果，大量研究及应用以胶原基生物材料，结合细胞种植或添加其他活性物质如各种生长因子等^[28-32]，进一步拓展了其应用范围，因此复合胶原蛋白止血材料在该领域具有重要价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程