骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化过程中Wnt信号通路的调控效应

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.10.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞的成脂肪分化与成骨分化比例的失衡与许多骨疾病密切相关，而近些年发现Wnt信号通路在调控骨髓间充质干细胞的分化方向中起重要作用。

目的：通过Wnt信号通路PCR基因芯片观察大鼠骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞后相关基因表达的变化，寻找Wnt信号通路中调控骨髓间充质干细胞分化的靶基因。

方法：采用大鼠第3代骨髓间充质干细胞分别进行成骨诱导和成脂诱导，7 d后用Trizol萃取培养瓶中的细胞总RNA，倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征及成骨诱导后和成脂诱导后细胞形态特征。采用Wnt信号通路PCR芯片(大鼠)进行基因芯片检测，以未诱导组为对照，计算成脂肪诱导，成骨诱导后相关基因上调/下调的比值。

结果与结论： ①倒置显微镜下观察，传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞经成骨诱导后向成骨细胞方向分化，经成脂诱导后向脂肪细胞方向分化。②与未诱导组相比，骨髓间充质干细胞成脂诱导后Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk-1，kremen，FZD1，FZD7)等15个(ratio>2)，下调的基因(sFrp 5，β-catenin，Dvl3，Tcf7)等16个(ratio<0.5)。成骨诱导后，Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk1，kremen，β-catenin，Wnt11)6个，表达下调的基因(sFrp5，sFRP4，Fzd1)等15个。提示Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞成脂细胞分化和成骨细胞分化中发挥重要作用。

关键词: 脂肪细胞, 成骨细胞, Wnt信号通路, 骨髓间充质干细胞, 基因芯片, DKK-1

Abstract:

BACKGROUND: Disequilibrium of proportion of adipogenesis and osteogenesis from bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) is associated with many bone diseases. However, it has been demonstrated that Wnt signaling pathway could play an important role in regulation of BMSC differentiation.

OBJECTIVE: To investigate the different gene expression profiles and to find the target gene on Wnt signaling pathway of the BMSCs, after being induced to osteoblasts and adipocytes respectively using Wnt signaling pathway PCR array.

METHODS: The third-passage BMSCs, after being induced to osteoblasts and adipocytes respectively for 7 days. The total mRNA of MSCs was extracted by Trizol. BMSC morphology was observed following osteogenic and adipogenic induction under an inverted microscope. Gene array was detected by rat Wnt signaling pathway PCR array. Non-induction group served as controls. The ratio of increase/reduction gene of osteoblasts and adipocytes was calculated.

RESULTS AND CONCLUSION: Under an inverted microscope, BMSCs with high homogenicity were obtained following passage 3. BMSCs differentiated into osteoblasts following osteogenic induction, and into adipocytes following adipogenic induction. Compared with non-induction group, fifteen genes (Dkk1, kremen, FZD1, FZD7, et al.) were expressed up-regulated (ratio > 2) and 16 (sFrp 5, β-catenin, Dvl3, Tcf7, et al.) genes down-regulated (ratio < 0.5) when the third-passage BMSCs were induced to adipocytes. Six genes (Dkk1, kremen, β-catenin, Wnt11, et al.) were expressed up-regulated and 15 genes (sFrp5, sFRP4, Fzd1, et al.) down-regulated when BMSCs being induced to osteoblasts. Above-mentioned results suggested that Wnt signaling pathway plays an important role in the osteoblast and adipocyte differentiation from BMSCs.

中图分类号:

R394.2

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参考文献

引言

材料方法

讨论

骨髓间充质干细胞是骨髓中一类能自我增殖并分化为多种组织细胞，如脂肪细胞，成骨细胞，软骨细胞等的潜能细胞。骨髓间充质干细胞的分化方向及其调控机制在骨质疏松症的发生机制中有重要意义。临床上，在骨质疏松患者骨髓中可见脂肪细胞增多，而成骨细胞减少。并且两者有此消彼长的关系。从分子水平，PPARγ(脂肪细胞分化和形成关键基因)负性抑制成骨分化转录因子RUNx2^[9]。骨髓间充质干细胞的分化方向受多种因素，多个信号途径的调节。其中Wnt信号通路通过旁分泌或者自分泌的方式影响细胞的分化和增长。正常功能状态下，大部分胞质内的β-catenin被束缚在由细胞膜向胞内伸出的E-钙黏着蛋白上，而其余部分与大肠腺瘤样蛋白和轴素多聚蛋白复合物结合，有利于胞浆中GSK-3β(糖原合成酶激酶)磷酸化与上述复合物结合的β-catenin，被磷酸化后的β-catenin易被泛素-蛋白酶体系统降解，从而保持胞质内游离β-catenin浓度处于相对较低的状态。当Wnt信号通路活化时，Wnt与细胞表面特异性受体Frizzlde，低密度脂蛋白受体相关蛋白5或6(low density lipoprotein5/6，LDL5/6)结合形成功能性连接受体复合体，使胞浆内的Dishevelled(Dvl)高度磷酸化从而被激活，活化后的Dvl蛋白抑制了GSK-3β活性，继而拮抗GSK-3β对β-catenin的磷酸化、降解作用，使胞质内β-catenin含量积聚并移至核内，与核内转录因子TCF/LEF家族相连接，从而控制下游靶基因的转录和表达^[10-12]。其中Wnt1，Wnt3a，Wnt8，Wnt10b参与经典的Wnt信号途径。Wnt5a，Wnt11，Wnt7a激活非经典的Wnt信号途径。除上述经典Wnt/β-catenint通路外，一些Wnts蛋白可通过非特异性途径激活其他的信号通路，如Wnt/Ca²⁺通路和Wnt/polarity(细胞平面极性通路)等通路^[13]。目前的研究已发现众多的胞内外蛋白质分子参与Wnt信号的转导与调节。Wnt信号通路的胞外拮抗物有两大类家族。第一类包括sFRP(secreted Frizzled- related protein)和WIF(Wnt inhibitory factor)-1及Cerberus。第二类是Dickkopf(Dkk)家族。但只有Dickkopf(DKK)家族，主要是DKK-1参与并抑制Wnt经典传导途径。胞外的DKK1蛋白与细胞膜上的LRP5/6结合后再结合Kremen，促使胞膜LRP6内陷，使其从Wnt受体复合物脱离，阻止经典Wnt信号下传，抑制了Wnt信号通路效应^[14]。骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化是个复杂的过程。Wnt信号通路控制骨髓间充质干细胞的分化方向和早期的分化潜能^[15-18]。Wnt经典信号途径对于骨髓间充质干细胞的成骨作用取决于其分化阶段，一旦骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞系时，经典的Wnt信号途径促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞并抑制其分化为成熟的成骨细胞^[19-22]。在成骨分化过程中Wnt11，FZD6，sFRP2，sFRP3和Ror2等上调，Wnt9a和FZD7等下调^[15]。同时Wnt信号通路调控骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。经典的wnt信号通路通过抑制成脂分化的关键因子PPARγ和CEBP/α从而抑制其向脂肪细胞分化^[23]。在成脂分化过程中Wnt10b，Wnt1，FZD1，FZD7，β-catenin减少，而DKK1，sFRP 4，sFRP 5，Wnt5b上调^{[5, 24-25]}。 Wnt信号通路对骨髓间充质干细胞向脂肪细胞方向分化的调节也刺激了其向成骨细胞的分化^[26]。本实验中骨髓间充质干细胞在成脂诱导剂(MDI)的干预后DKK-1基因的表达与阴性对照组比较增高了22.50倍，Kremen基因的表达增高了2.27倍，同时β-catenin基因的表达下调0.89倍，dvl3，lef1，tcf7基因的表达分别下调了7.49，3.55，2.42倍。提示DKK-1蛋白参与了骨髓间充质干细胞的脂肪分化过程，并促使了骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的分化。DKK-1可能是通过抑制Wnt经典信号通路从而促进脂肪形成。sFRP是一种分泌型糖蛋白家族，同时也是Wnt蛋白的另一类对抗物。它能与Wnts蛋白相结合从而阻止了Wnts连接到相应的受体。抑制了经典和非经典的Wnt信号通路的活化^[27]。sFRP 4，sFRP 5基因在体外实验成脂分化过程中被强烈的诱导^[24-25]。与上述研究不一致，sFRP 2，4，5，Frzb(sFRP 3)基因在成脂分化诱导条件下分别降低了4.82，16.74，46.31，2.42倍。而且Wnt9a，Wnt6，Wnt5b分别下调8.52，2.75，2.53倍。但Wnt11，Wnt分别上调10.1，2.93倍。FZD 4上调7.62倍，FZD 7上调2.19倍，Fzd1下调3.77倍。其机制不太清楚，可能与Wnt非经典途径与Wnt经典信号通路之间的相互作用有关^[28-30]。cyclin D1.D2基因下调2.82，2.45倍。可能是在骨髓间充质干细胞成脂分化过程中抑制Wnt经典信号途径下调了cyclin D1和cyclin D2^[31]。骨髓间充质干细胞在成骨诱导的条件下DKK-1基因上调了15.9倍，kremen上调2.40倍。而DVL3，LEF1，TCF7无改变。提示在成熟的成骨细胞Wnt经典信号通路必须下调以促使矿化基质的形成^[32]。在成骨诱导条件下，sFRP 4，5分别下调4.07，24.92倍，Wnt11上调10.07倍，Wnt9a，Wnt5b，wnt2b分别下调2.44，4.55，7.27倍。而β-catenin上调1.31倍，beta-TrCP1下调2.09倍。提示骨髓间充质干细胞在成骨分化过程中可能存在经典Wnt信号通路和非经典的Wnt信号通路之间的相互作用^[28-30]。Frizzleds(Fzd)是能与Wnts结合的细胞表面受体^[33]。成骨分化过程中Fzd6基因下调4.59倍。同时fzd1下调2.88倍，可能与不同的Fzd有不同的功能有关^[34]。本实验初步筛选出骨髓间充质干细胞成脂肪分化和成骨分化过程中在Wnt信号通路的基因表达情况，结果提示，研究抑制Dkk-1，kremen，促进β-catenin等靶基因和蛋白的表达，可为筛选药物及抗骨质疏松机制研究提供有价值的参考方向。

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