过表达胶原三螺旋重复蛋白1促进人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化

doi:10.12307/2026.693

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (19): 4918-4925.doi: 10.12307/2026.693

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过表达胶原三螺旋重复蛋白1促进人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化

周睿1，张雪松2，杨东红1，3，金轶男1，3，杨宇琦1，3，叶之慧1，3

1佳木斯大学口腔医学院，黑龙江省佳木斯市 154000；2佳木斯大学附属第一医院，黑龙江省佳木斯市 154000；3佳木斯大学附属口腔医院正畸科，黑龙江省佳木斯市 154000

收稿日期:2025-06-06 接受日期:2025-09-23 出版日期:2026-07-08 发布日期:2026-02-14
通讯作者: 叶之慧，主任医师，教授，硕士生导师，佳木斯大学口腔医学院，黑龙江省佳木斯市 154000；佳木斯大学附属口腔医院正畸科，黑龙江省佳木斯市 154000
作者简介:周睿，男，1998年生，黑龙江省伊春市人，佳木斯大学在读硕士，主要从事口腔组织再生方面的研究。
基金资助:
黑龙江省教育厅基本科研业务费基础研究项目(2022-KYYWF-0648)，项目负责人：叶之慧

Overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1 promotes proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells

Zhou Rui1, Zhang Xuesong2, Yang Donghong1, 3, Jin Yinan1, 3, Yang Yuqi1, 3, Ye Zhihui1, 3

1Stomatology College of Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China; 2First Affiliated Hospital, Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China; 3Department of Orthodontics, Affiliated Stomatological Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China

Received:2025-06-06 Accepted:2025-09-23 Online:2026-07-08 Published:2026-02-14
Contact: Ye Zhihui, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Stomatology College of Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China; Department of Orthodontics, Affiliated Stomatological Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China
About author:Zhou Rui, Master candidate, Stomatology College of Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China
Supported by:
Research Operating Expenses Project Fund of Education Department of Heilongjiang Province, No. 2022-KYYWF-0648 (to YZH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

胶原三螺旋重复蛋白1：是血管重构、成骨细胞形成和创伤修复的调节因子，与钙化组织的形成显著相关。
牙周膜干细胞：主要分布于牙周膜血管周围，具有多向分化潜能，经过适当的诱导可以向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向分化，在组织再生领域具有广阔的应用前景。

摘要
背景：胶原三螺旋重复蛋白1是骨形成的正向调节因子，但是其在牙周膜干细胞中的作用及机制尚未明确。
目的：探讨胶原三螺旋重复蛋白1对人牙周膜干细胞增殖、成骨分化的影响及作用机制。
方法：体外分离培养人牙周膜干细胞，用过表达胶原三螺旋重复蛋白1慢病毒载体转染细胞，通过CCK-8法和流式细胞术检测过表达胶原三螺旋重复蛋白1对牙周膜干细胞增殖活性的影响；通过碱性磷酸酶活性、茜素红染色检测过表达胶原三螺旋重复蛋白1对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响；采用Western blot检测过表达胶原三螺旋重复蛋白1后细胞外调节蛋白激酶1/2、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2蛋白表达；采用Western blot和qRT-PCR检测阻断细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路后，过表达胶原三螺旋重复蛋白1对牙周膜干细胞成骨分化相关因子Runt相关转录因子2、骨钙素、Osterix表达的影响。
结果与结论：①CCK-8和流式细胞术结果显示，过表达胶原三螺旋重复蛋白1能够促进牙周膜干细胞增殖；②碱性磷酸酶活性、茜素红染色显示，过表达胶原三螺旋重复蛋白1能够促进牙周膜干细胞的成骨分化；③Western blot结果显示，过表达胶原三螺旋重复蛋白1激活了细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路；④Western blot和qRT-PCR结果显示，过表达胶原三螺旋重复蛋白1促进了Runt相关转录因子2、骨钙素、Osterix蛋白和mRNA的表达，当使用细胞外调节蛋白激酶信号通路特异性抑制剂PD98059抑制信号通路激活后，成骨相关因子表达上调出现了一定程度的抑制。以上结果提示：过表达胶原三螺旋重复蛋白1可以促进牙周膜干细胞的增殖和成骨分化，其促成骨分化作用可能与细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路的激活有关。

https://orcid.org/0009-0008-1876-0450(叶之慧)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞治疗, 牙周膜干细胞, 胶原三螺旋重复蛋白1(CTHRC1), 细胞增殖, 成骨分化, 细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)

Abstract: BACKGROUND: Collagen triple helix repeat-containing protein 1 is a positive regulator of bone formation. However, its role and underlying mechanisms in periodontal ligament stem cells remain unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of collagen triple helix repeat-containing protein 1 on the proliferation and osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells and its mechanism of action.
METHODS: Human periodontal ligament stem cells were isolated and cultured in vitro, and the cells were transfected with a overexpressed collagen triple helix repeat-containing protein 1 lentiviral vector. The effect of overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1 on the proliferation activity of periodontal ligament stem cells was determined by CCK-8 assay and flow cytometry. The effect of overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1 on the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells was determined by alkaline phosphatase activity and Alizarin red staining. Western blot assay was used to determine the expression of extracellular regulated protein kinase 1/2 and phosphorylated extracellular regulated protein kinase 1/2 after overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1. Western blot assay and qRT-PCR were used to determine the effect of overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1 on the expression of osteogenic differentiation-related factors Runt-related transcription factor 2, osteocalcin, and Osterix in periodontal ligament stem cells after blocking the extracellular regulated protein kinase 1/2 signaling pathway.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK-8 assay and flow cytometry results showed that overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1 promoted the proliferation of periodontal ligament stem cells. (2) Alkaline phosphatase activity and Alizarin red staining showed that overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1 promoted the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells. (3) Western blot assay results showed that overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1 activated the extracellular regulated protein kinase 1/2 signaling pathway. (4) Western blot assay and qRT-PCR results showed that overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1 promoted the expression of Runt-related transcription factor 2, osteocalcin, and Osterix protein and mRNA. When the extracellular regulated protein kinase signaling pathway-specific inhibitor PD98059 was used to inhibit signaling pathway activation, the upregulation of osteogenic-related factors was suppressed to a certain extent. These results suggest that overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1 can promote the proliferation and osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells, and its osteogenic differentiation-promoting effect may be related to the activation of the extracellular regulated protein kinase 1/2 signaling pathway.

Key words: stem cell therapy, periodontal ligament stem cell, collagen triple helix repeat-containing protein 1 (CTHRC1), cell proliferation, osteogenic differentiation, extracellular regulated protein kinase 1/2 (ERK1/2)

中图分类号:

周睿, 张雪松, 杨东红, 金轶男, 杨宇琦, 叶之慧. 过表达胶原三螺旋重复蛋白1促进人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(19): 4918-4925.

Zhou Rui, Zhang Xuesong, Yang Donghong, Jin Yinan, Yang Yuqi, Ye Zhihui. Overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1 promotes proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(19): 4918-4925.

图/表（结果） 7

2.1 牙周膜干细胞的形态变化 经酶解法分离人牙周膜干细胞，培养7-14 d后可见有纺锤状细胞从组织块边缘爬出，见图1A；约15 d后细胞呈集落状聚集生长，覆盖大部分培养面积。当细胞融合度达80%后进行传代。传代后的牙周膜干细胞相互融合，细胞大小一致，状态良好，细胞贴壁呈漩涡状生长，核仁明显，胞浆丰富，见图1B。

2.2 牙周膜干细胞流式细胞术鉴定结果 流式细胞术鉴定结果显示，所培养细胞高表达间充质干细胞特异性标志物CD90(93.6%)，而造血细胞相关标志物CD34(0.11%)及泛白细胞标志物CD45(5.55%)表达接近阴性。上述结果表明，所分离并培养的细胞来源于间充质组织，具备典型的间充质干细胞特征，见图2。

2.3 牙周膜干细胞多向分化潜能鉴定 经过连续21 d成骨诱导培养后，茜素红染色结果显示大量红色矿化钙结节散在分布，表明牙周膜干细胞具有成骨分化潜能，见图3A。成脂诱导培养21 d后，油红O染色显示细胞间出现脂滴，且大部分脂滴呈圆形，表明牙周膜干细胞具有成脂分化潜能，见图3B。

2.4 CTHRC1过表达效果验证 细胞转染后镜下观察病毒自带荧光，慢病毒转染呈红色，细胞核呈蓝色，通过图片合成对比显示空白载体组和CTHRC1过表达组的感染效率达95%以上，见图4A。与正常组、空白载体组相比，CTHRC1过表达组的CTHRC1 mRNA和蛋白表达水平升高，见图4B-D。
2.5 过表达CTHRC1增强了牙周膜干细胞的增殖活性 CCK-8检测结果显示，在不同的时间点，CTHRC1过表达组的吸光度值均明显高于正常组、空白载体组，见图5A。流式细胞周期分析显示CTHRC1过表达组S期和G2期细胞总占比显著增多，细胞增殖指数显著升高，见图5B。

2.6 过表达CTHRC1增强了牙周膜干细胞的成骨分化能力 成骨诱导3 d和7 d后，CTHRC1过表达组细胞碱性磷酸酶活性均显著高于正常组、空白载体组，见图6A，B。成骨诱导21 d后，茜素红染色显示CTHRC1过表达组生成矿化结节更多。使用10%十六烷基吡啶溶液溶解矿化结节，与正常组、空白载体组相比，CTHRC1过表达组的吸光度值更高，见图6C，D。

2.7 过表达CTHRC1激活了牙周膜干细胞的细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路 采用Western blot分析过表达CTHRC1后相关信号通路蛋白的变化，以研究CTHRC1在牙周膜干细胞成骨分化过程中的作用机制。结果显示，与正常组、空白载体组相比，CTHRC1过表达组细胞外调节蛋白激酶1/2蛋白表达无明显变化，磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2蛋白表达显著升高，磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2与细胞外调节蛋白激酶1/2蛋白表达的比值显著升高，而PD98059可以抑制细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路的激活，见图7。

2.8 CTHRC1通过激活细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路调控牙周膜干细胞的成骨分化 Western blot和qRT-PCR检测结果显示，过表达CTHRC1提高了骨生成相关基因Runt相关转录因子2、骨钙素和Osterix在mRNA和蛋白水平的表达。当使用PD98059抑制细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路激活时，Runt相关转录因子2、骨钙素和Osterix的表达水平升高趋势出现了一定程度的逆转，见图8。这些结果表明，过表达CTHRC1可能通过激活细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路促进人牙周膜干细胞的成骨分化。

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引言

牙周炎是一种由牙菌斑致病菌诱发、在宿主免疫调节失衡下导致的慢性炎性疾病[1]。牙周炎可导致牙周支持组织破坏、牙周袋形成、牙槽骨吸收及附着丧失，随着病程进展逐渐造成牙齿松动，是成年人牙齿缺失的主要原因之一[2-3]。人牙周膜干细胞具备高度的增殖能力和自我更新能力以及多向分化潜能，并且细胞来源相对广泛，在牙周组织再生、牙再生等领域备受关注[4-7]。
胶原三螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1)是血管重构、成骨细胞形成和创伤修复的调节因子[8-10]。CTHRC1在多种生理过程中表达上调，作为成骨分化的正向调节因子，在骨改建、骨质量维护中起重要作用[11-13]。近期研究发现CTHRC1在牙周炎患者的牙周组织中高表达，与牙周炎关系密切[14-15]。牙周膜干细胞能够通过自我复制和多向分化维持牙周组织的稳态，但CTHRC1在牙周膜干细胞中的作用和机制尚未完全清楚。
丝裂原活化蛋白激酶是真核生物细胞内广泛存在的一类介导细胞反应的重要信号传导系统[16-18]。丝裂原活化蛋白激酶在受到多种信号分子刺激后发生磷酸化而活化，活化的丝裂原活化蛋白激酶参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡等多种生理过程[19]。CTHRC1的作用机制与丝裂原活化蛋白激酶信号通路关系密切。有研究表明CTHRC1过表达可通过激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进食管鳞状细胞癌的进展，还可以通过与表皮生长因子受体相结合，激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路，促进肌腱干细胞的增殖和迁移，从而加速肌腱的愈合过程[20-21]。而沉默CTHRC1可通过激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路加重牙周膜细胞的炎症反应[22]。丝裂原活化蛋白激酶信号通路主要包括细胞外调节蛋白激酶1/2通路、C-JUN氨基末端激酶通路、P38通路和细胞外调节蛋白激酶5通路，其中细胞外调节蛋白激酶1/2是调节细胞迁移、增殖和分化最显著的激酶[23-25]。激活细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路可增加成骨相关基因的表达，从而促进成骨分化[26]。此外，细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路还参与牙根形成和再生过程中细胞的增殖和分化[27]。
该实验采用过表达CTHRC1慢病毒载体转染牙周膜干细胞，研究CTHRC1对牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响，并进一步探索作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞及分子生物学实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年10月至2024年9月在佳木斯大学基础学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验仪器 超级洁净工作台(东联哈尔，中国)；二氧化碳培养箱(Heal Force，美国)；倒置荧光显微镜(Leica，德国)；系列单道可调移液器(BRAND，德国)；实时荧光定量PCR仪(MEDSONK，意大利)；凝胶成像分析系统(BIO-RAD，美国)。
1.3.2 实验试剂 α-MEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清、AMV第一链cDNA合成试剂盒、SYBR Green染料法Mix(生工，中国)；青霉素-链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶、CCK-8、碱性磷酸酶检测试剂盒(碧云天，中国)；过表达CTHRC1慢病毒载体及其对照慢病毒载体(吉凯基因，中国)；成骨诱导培养基、成脂诱导培养基、茜素红染液、油红O染液(赛业，广州)；细胞外调节蛋白激酶1/2、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2、GAPDH、Runt相关转录因子2、骨钙素、Osterix抗体(Affinity，美国)；CD34、CD45、CD90流式抗体(Biolegend，美国)；细胞外调节蛋白激酶1/2特异性抑制剂PD98059(陶术，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 牙周膜干细胞的获取及培养实验已获得佳木斯大学伦理委员会批准，批准号：No. 2024-KQYY-XS-17。获得患者及监护人知情同意后，收集因正畸目的而拔除的12-24岁患者的前磨牙，患者均无龋齿或牙周病。同一供者来源的离体牙置于预冷的含α-MEM培养基和5%双抗的收集液中，并在冰盒内低温保存。将收集的离体牙用含5%双抗的无菌PBS沿冠-根方向反复冲洗。无菌刀片刮取根中1/3的牙周膜组织，并将其剪碎成1 mm左右的小块，用3 mg/mLⅠ型胶原酶消化，最后将细胞接种于培养瓶中，添加含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM培养基，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，观察细胞融合度达80%左右时以1∶3的比例进行传代。
1.4.2 牙周膜干细胞鉴定
(1)流式细胞术鉴定细胞表面标志物：取生长状态良好的第3代细胞，待细胞生长融合度达80%时，使用0.25%胰蛋白酶进行消化，收集细胞沉淀，将细胞浓度调整为1×109 L-1，取4支离心管，每管分别加入100 μL细胞悬液，再分别加入5 μL CD34、CD45、CD90流式抗体，对照组加入同体积的PBS，4 ℃条件下避光孵育30 min，吹打均匀后上机检测。
(2)细胞成骨分化能力鉴定：取生长状态良好的第3代细胞，消化后离心重悬，以2×105/孔的细胞密度接种于6孔板中，当细胞贴壁后，更换成骨诱导培养基进行成骨诱导。成骨诱导至21 d，弃掉孔板中的培养液，用40 g/L多聚甲醛固定10 min，每孔加入1 mL茜素红染液染色10 min，最后用三蒸水冲洗掉未结合的染液，直至废液中无明显颜色残留，于倒置显微镜下观察细胞成骨分化情况。
(3)细胞成脂分化能力鉴定：取生长状态良好的第3代细胞，消化后离心重悬，以2×105/孔的细胞密度接种于6孔板中，当细胞贴壁后，更换成脂诱导培养液进行成脂诱导。成脂诱导至21 d，显微镜下观察脂滴变圆变大后弃掉培养液，PBS洗涤，每孔加入40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，用油红O染液染色10 min，三蒸水冲洗未结合的染液，于倒置显微镜下观察细胞成脂分化情况。
1.4.3 构建CTHRC1慢病毒表达载体并转染至牙周膜干细胞 委托生物公司构建慢病毒表达载体。取生长状态良好的第3代细胞，以2×105/孔细胞密度接种于6孔板中，将细胞分为正常组(NG组)、空白载体组(LV-NC组)和CTHRC1过表达组(LV-CTHRC1组)，待细胞融合度达80%以上时，通过查阅文献获得牙周膜干细胞最佳感染复数为20[28]，通过感染复数和病毒滴度计算病毒使用体积，公式如下：病毒体积=(感染复数×细胞数目)/病毒滴度。经计算CTHRC1过表达组加入病毒量2.4 μL，空白载体组加入病毒量4 μL。病毒感染72 h后，荧光显微镜下观察细胞状态，并通过Western blot和qRT-PCR验证转染效果。
1.4.4 CCK-8法检测细胞增殖情况 上述各组牙周膜干细胞以7×103/孔密度接种于96孔板中，每组设3个复孔，分别于37 ℃、饱和湿度、体积分数5% CO2培养箱中培养24，48，72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂和90 μL无血清的α-MEM培养液避光孵育2 h，以空白对照孔为对照，使用酶标仪于450 nm波长下测定吸光度值。
1.4.5 流式细胞术分析细胞周期 上述各组牙周膜干细胞经消化离心后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×109 L-1，用预冷的无水乙醇固定细胞，置于4 ℃过夜，PBS清洗，各管加入碘化丙啶染液染色30 min，应用流式细胞仪在氢激光光源(激发波长为488 nm，接收波长为610-630 nm)、变异系数小于2%的条件下测试荧光。通过分析细胞周期的分布，计算出各样本中G0/G1期、S期、G2期细胞百分比，进而得出细胞增殖指数(PI)，计算公式为：PI=S+G2/(S+G2+G0/G1)×100%。
1.4.6 碱性磷酸酶活性检测 上述各组牙周膜干细胞以7×103/孔密度接种于96孔板中，当细胞贴壁后，更换成骨诱导培养基进行成骨诱导。成骨诱导3 d和7 d后，每孔加入细胞裂解液100 μL并置于4 ℃条件下过夜，隔夜后每孔加入100 μL对硝基苯酚，37 ℃条件下避光孵育30 min，加入1 mol/L NaOH终止反应，使用酶标仪于520 nm波长下测定各孔的吸光度值。
1.4.7 茜素红染色及半定量分析 上述各组牙周膜干细胞以2×105/孔密度接种于6孔板中，当细胞贴壁后，更换成骨诱导培养基进行成骨诱导。成骨诱导21 d后，加入1 mL预冷的40 g/L多聚甲醛固定30 min，细胞固定后用茜素红染液室温染色10 min，用三蒸水洗净未结合的染液，显微镜下观察各孔细胞矿化效果，然后每孔加入1 mL 10%十六烷基吡啶溶液，在摇床上振荡30 min以充分溶解矿化结节，使用酶标仪于562 nm波长下测定各孔的吸光度值。
1.4.8 Western blot检测 将细胞分为4组：正常组(NG组)、空白载体组(LV-NC组)、CTHRC1过表达组(LV-CTHRC1组)、CTHRC1过表达+细胞外调节蛋白激酶1/2特异性抑制剂组(LV-CTHRC1+PD98059组)，各组牙周膜干细胞以1×104/cm2密度接种于培养皿中，当细胞贴壁后，更换成骨诱导培养基进行成骨诱导，其中CTHRC1过表达+PD98059组细胞使用含20 μmol/L PD98059的成骨诱导培养基进行成骨诱导。成骨诱导7 d后，用含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解细胞，离心后收集上清液即为蛋白样品，应用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白样品进行定量分析，通过绘制标准曲线以准确测定各样品的蛋白浓度。取等量蛋白经12% SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜，使用5%脱脂奶粉室温封闭60 min，然后于4 ℃条件下孵育一抗过夜，一抗如下：CTHRC1(1∶1 300)、细胞外调节蛋白激酶1/2(1∶1 000)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(1∶2 000)、Runt相关转录因子2(1∶2 000)、骨钙素(1∶3 000)、Osterix(1∶3 000)、GAPDH(1∶30 000)，洗膜后加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶7 000)，室温孵育60 min，最后使用凝胶成像系统显影检测蛋白条带，应用Image J软件对条带进行灰度值分析。

1.4.9 qRT-PCR检测 实验分组同1.4.8，各组牙周膜干细胞以1×104/cm2密度接种于培养皿中，当细胞贴壁后，更换成骨诱导培养基进行成骨诱导。成骨诱导7 d后，TRIzol试剂提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒将总RNA合成为cDNA。利用SYBR Green法进行qRT-PCR，以GAPDH为内参基因。每组实验重复3次。相对基因表达量采用2-ΔΔCt法计算。PCR引物由上海生工合成，引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①细胞增殖活性、细胞周期和增殖指数；②碱性磷酸酶活性和矿化结节形成情况；③Western blot检测细胞外调节蛋白激酶1/2、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2蛋白表达水平；④Western blot和qRT-PCR检测Runt相关转录因子2、骨钙素、Osterix的蛋白和mRNA表达水平。
1.6 统计学分析 所有实验重复3次，应用SPSS 29.0软件对研究所得数据进行分析，结果以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。该文章统计学方法已经佳木斯大学统计学专家审核。

讨论

通过基因工程手段调控干细胞的生物学行为已经成为一种有效的干细胞治疗策略[29]。牙周膜干细胞具有自我更新、多向分化和免疫调节等干性特征，并且具备构建三维牙周组织的独特潜力，因而在牙周组织工程中展现出良好的应用前景[30-31]。
早期研究发现CTHRC1与牙周炎密切相关，可能参与了牙周炎的发生发展和炎症组织修复的复杂过程[32-33]。牙周膜干细胞是维持牙周组织稳态的重要细胞，CTHRC1在牙周膜干细胞增殖和成骨分化方面的作用报道甚少，该研究探讨过表达CTHRC1对牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响。
骨组织缺损修复一直是组织工程与再生医学领域的难点之一，而骨的再生效率与细胞的增殖分化能力密切相关。实验结果显示，CTHRC1过表达组牙周膜干细胞的增殖活性显著增强，S期和G2期细胞总比例提高，相应的细胞增殖指数也显著提高。这些数据提示CTHRC1可能通过调控细胞周期进程发挥作用，具体表现为促进更多的细胞进入S期和G2期，从而加速细胞增殖进程。碱性磷酸酶是成骨细胞在分化早期所分泌的酶蛋白，是骨形成早期的标志性蛋白，其活性与成骨细胞的分化程度呈正相关[34-35]。成骨诱导3 ，7 d后，CTHRC1过表达组的碱性磷酸酶活性明显升高，证明过表达CTHRC1能够显著增强牙周膜干细胞的早期成骨能力。成骨诱导21 d后，茜素红染色显示CTHRC1过表达组的细胞矿化结节生成增多，证明过表达CTHRC1能够增强牙周膜干细胞的晚期矿化能力。Runt相关转录因子2是成骨细胞分化所必需的最上游转录因子，在成骨早期分化中起着决定性作用[36-38]。骨钙素和Osterix是成骨细胞分化的下游因子，与骨转换密切相关，通过参与骨基质的矿化过程及成骨细胞分化，维持骨的正常矿化速率[39-40]。实验结果显示，过表达CTHRC1后，Runt相关转录因子2、骨钙素和Osterix的表达水平均有一定程度增加。这些结果表明CTHRC1可能是牙周膜干细胞增殖和成骨分化的正向调节因子。
CTHRC1已被证实参与调控转化生长因子β、丝裂原活化蛋白激酶和Wnt/β-catenin等信号通路[41-44]。其中，细胞外调节蛋白激酶1/2在骨骼发育及成骨分化过程中发挥关键调控作用，不仅能够促进骨骼生长、维持骨稳态，还能增强细胞的成骨分化能力[42-47]。鉴于细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路与成骨分化之间的高度相关性，该实验进一步探究细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路在CTHRC1诱导牙周膜干细胞成骨分化中的作用机制[48-51]。实验结果显示，CTHRC1过表达组牙周膜干细胞中细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路被激活，表现为磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2的蛋白表达水平显著提高，并且促进了Runt相关转录因子2、骨钙素和Osterix的表达。当采用特异性抑制剂抑制细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路后，上述趋势部分被逆转。这些结果提示CTHRC1可能通过细胞外调节蛋白激酶1/2信号轴调控牙周膜干细胞成骨分化的分子机制，即CTHRC1激活细胞外调节蛋白激酶1/2的磷酸化修饰，进而通过级联反应驱动成骨相关基因的转录激活。
综上所述，过表达CTHRC1能够促进牙周膜干细胞的增殖和成骨分化，CTHRC1作为调节人牙周膜干细胞增殖与成骨分化的正向因子，其促进成骨分化的作用可能部分依赖于细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路的激活。未来可进一步探索CTHRC1修饰的牙周膜干细胞在牙周再生治疗中的应用价值，以期为牙周炎提供更为有效的治疗策略。虽然基因修饰在提升干细胞功能方面显示出一定优势，但安全性及长期稳定性仍需进一步研究。病毒载体引发的基因插入突变和异位表达等风险，仍是当前细胞治疗中亟待突破的技术瓶颈。因此，未来研究可考虑采用更为安全的基因调控技术，以增强治疗的靶向性和生物安全性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

过表达胶原三螺旋重复蛋白1促进人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化

Overexpression of collagen triple helix repeat-containing protein 1 promotes proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells

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