DNA损伤激活的非编码RNA促进诱导多能干细胞衍生心肌细胞增殖并抑制凋亡

doi:10.12307/2026.192

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (19): 4926-4933.doi: 10.12307/2026.192

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DNA损伤激活的非编码RNA促进诱导多能干细胞衍生心肌细胞增殖并抑制凋亡

郇康辉，姜昱建，卞伟华

滨州医学院药学院，山东省烟台市 264003

收稿日期:2025-06-20 接受日期:2025-09-13 出版日期:2026-07-08 发布日期:2026-02-14
通讯作者: 卞伟华，博士，教授，硕士生导师，滨州医学院药学院，山东省烟台市 264003
作者简介:郇康辉，男，1999年生，山东省潍坊市人，汉族，滨州医学院在读硕士，主要从事心肌梗死与干细胞治疗的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82270305)，项目负责人：卞伟华

Non-coding RNA-activated by DNA damage promotes proliferation and inhibits apoptosis of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

Huan Kanghui, Jiang Yujian, Bian Weihua

Department of Pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, Shandong Province, China

Received:2025-06-20 Accepted:2025-09-13 Online:2026-07-08 Published:2026-02-14
Contact: Bian Weihua, PhD, Professor, Master’s supervisor, Department of Pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, Shandong Province, China
About author:Huan Kanghui, Master candidate, Department of Pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, Shandong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82270305 (to BWH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

干细胞治疗：指利用干细胞特性，通过多种方式将干细胞或其衍生物应用于疾病治疗和组织修复的医学手段，干细胞为心肌梗死治疗带来了新的希望。
DNA损伤激活的非编码RNA：作为长链非编码RNA家族中的重要成员，参与维持基因组稳定和正常有丝分裂过程。

摘要
背景：细胞移植为心肌梗死治疗提供了一种有希望的方法，但较低的移植率限制了其应用。因此，促进移植细胞增殖，减少细胞凋亡，是提高治疗效果亟待解决的关键问题。
目的：探究DNA损伤激活的非编码RNA(non-coding RNA-activated by DNA damage，NORAD)对人诱导多能干细胞衍生心肌细胞增殖和氧糖剥夺/复氧诱导细胞凋亡的影响，以及移植过表达DNA损伤激活的非编码RNA的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞对心肌梗死小鼠心功能的影响。
方法：RT-qPCR检测DNA损伤激活的非编码RNA在不同年龄(3 d龄和8周龄)小鼠心脏中的表达。通过包装过表达DNA损伤激活的非编码RNA的慢病毒和阴性对照病毒感染人诱导多能干细胞，进一步诱导分化获得过表达DNA损伤激活的非编码RNA和阴性对照的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞，分别为实验组和对照组，通过RT-qPCR检测DNA损伤激活的非编码RNA的过表达效率；细胞免疫荧光检测增殖标志蛋白Ki67表达水平。利用氧糖剥夺/复氧法诱导细胞凋亡，流式细胞仪检测细胞内活性氧水平，Western blot检测细胞内Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平。将过表达DNA损伤激活的非编码RNA的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞移植到小鼠心肌梗死部位，4周后通过超声心动图评估心功能。
结果与结论：①DNA损伤激活的非编码RNA在3 d龄幼鼠心脏中的表达显著高于8周龄成年小鼠；②成功诱导人诱导多能干细胞分化为能够自发搏动的心肌细胞；③成功构建过表达DNA损伤激活的非编码RNA的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞模型；④与对照组相比，过表达DNA损伤激活的非编码RNA的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中Ki67表达升高；⑤与对照组相比，过表达DNA损伤激活的非编码RNA抑制了氧糖剥夺/复氧诱导的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞内活性氧产生，Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高；⑥过表达DNA损伤激活的非编码RNA的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞治疗显著改善了心肌梗死小鼠心脏功能。以上结果表明：过表达DNA损伤激活的非编码RNA促进人诱导多能干细胞衍生心肌细胞增殖，并减少氧糖剥夺/复氧诱导后人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中活性氧产生，抑制细胞凋亡发生，从而增强人诱导多能干细胞衍生心肌细胞在心肌梗死小鼠中的修复能力。

https://orcid.org/0000-0003-2369-2073 (卞伟华)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 长链非编码RNA, 诱导多能干细胞, 心肌细胞, 氧糖剥夺/复氧, 细胞增殖, 心肌梗死, 凋亡, 细胞移植

Abstract: BACKGROUND: Although cell transplantation offers a promising approach for the treatment of myocardial infarction, the low transplantation rate limits its application. Therefore, promoting the proliferation of transplanted cells and reducing apoptosis are the key issues to be solved urgently to improve the therapeutic effect.
OBJECTIVE: To investigate the effects of non-coding RNA-activated by DNA damage (NORAD) on the proliferation of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and their apoptosis induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, as well as the effects of transplanting NORAD-overexpressing human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-NORADOECMs) on cardiac function in a murine model of myocardial infarction.
METHODS: The expression of NORAD in the hearts of mice at different ages (3 days old and 8 weeks old) was measured by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). A cellular model of hiPSC-NORADOECMs was established by infecting human induced pluripotent stem cells with a lentiviral vector designed to specifically upregulate NORAD, followed by directed differentiation. These cells were divided into a control group (infected with a control lentivirus) and an experimental group (infected with a NORAD-overexpressing lentivirus). The efficiency of NORAD overexpression was detected by RT-qPCR. The expression level of proliferation marker protein Ki67 was detected by cellular immunofluorescence. Intracellular reactive oxygen species levels were measured by flow cytometry after cell apoptosis was induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation induction. The expression levels of Bcl-2-associated X protein (Bax), B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), and cleaved caspase-3 were analyzed by western blot assay. hiPSC-NORADOECMs were transplanted into the infarcted area of the myocardial infarction mouse model. The cardiac function was evaluated by echocardiography four weeks later.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) NORAD expression was significantly higher in the hearts of 3-day-old neonatal mice compared with 8-week-old adult mice. (2) The differentiation of human induced pluripotent stem cells into spontaneously contracting human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes was successfully achieved. (3) A stable human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes model overexpressing NORAD (hiPSC-NORADOECMs) was successfully established. (4) The expression of the proliferation marker Ki67 was significantly increased in the NORAD-overexpressing group compared with controls. (5) Compared with controls, NORAD overexpression reduced reactive oxygen species accumulation induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes; Bax and cleaved caspase-3 levels were decreased, while Bcl-2 expression was upregulated. (6) Transplantation of hiPSC-NORADOECMs significantly enhanced cardiac function in a murine model of myocardial infarction. Collectively, these findings suggest that overexpression of the NORAD promotes the proliferation of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, reduces reactive oxygen species accumulation, and inhibits apoptosis following oxygen-glucose deprivation/reoxygenation induction, thereby enhancing the cardiac repair capacity of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in infarcted hearts.

Key words: long non-coding RNA, induced pluripotent stem cell, cardiomyocyte, oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, cell proliferation, myocardial infarction, apoptosis, cell transplantation

中图分类号:

郇康辉, 姜昱建, 卞伟华. DNA损伤激活的非编码RNA促进诱导多能干细胞衍生心肌细胞增殖并抑制凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(19): 4926-4933.

Huan Kanghui, Jiang Yujian, Bian Weihua. Non-coding RNA-activated by DNA damage promotes proliferation and inhibits apoptosis of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(19): 4926-4933.

图/表（结果） 7

2.1 NORAD在幼年小鼠中高表达 为了评估长链非编码RNA NORAD在心肌细胞周期中的作用，分别收集3 d龄幼年和8周龄成年C57BL/6小鼠心脏组织，通过RT-qPCR测量NORAD在不同年龄小鼠心脏中的表达。如图1所示，NORAD在3 d龄幼鼠心脏中的表达显著高于成年小鼠心脏。

2.2 人诱导多能干细胞诱导分化为心肌细胞 人诱导多能干细胞传代3次后，按步骤加入小分子试剂进行诱导分化，分化8-10 d得到自主搏动的心肌细胞，即hiPSC-CMs。如图2所示，人诱导多能干细胞分化前后形态明显不同。细胞形态从紧密排列的集落状逐渐转变为细长、具有分支结构的形态，形成具有自发搏动能力的心肌细胞。成功分化的心肌细胞体积增大，形态更加立体。

2.3 过表达NORAD的hiPSC-CMs构建及验证 为了构建长链非编码RNA NORAD过表达的hiPSC-CMs。将NORAD亚克隆到含有心肌特异性αMHC启动子的质粒载体中，以此构建在心肌细胞中特异性过表达NORAD的质粒：Lenti-αMHC-NORAD。通过利用Lenti-αMHC-NORAD质粒进行慢病毒包装，感染人诱导多能干细胞，经抗生素筛选，获得导入NORAD基因的稳定细胞株，诱导分化获得过表达NORAD的hiPSC-CMs(hiPSC-NORADOECMs)，同时以只导入载体质粒 hiPSCs分化的hiPSC-CMs(hiPSC-NORADWTCMs)作为对照。RT-qPCR结果显示：hiPSC-NORADOECMs中NORAD表达水平为hiPSC-NORADWTCMs的2.2倍，见图3。

2.4 过表达NORAD促进hiPSC-CMs增殖 使用Anti-心肌肌钙蛋白T标记心肌细胞骨架，DAPI标记细胞核。免疫荧光检测结果显示，与对照组相比，过表达NORAD心肌细胞中表达Ki67的阳性细胞比例显著升高，见图4。这一结果提示，NORAD促进了hiPSC-CMs增殖。

2.5 过表达NORAD抑制氧糖剥夺/复氧诱导的hiPSC-CMs中活性氧产生 流式细胞术结果显示：经氧糖剥夺/复氧诱导后，与对照组相比，过表达NORAD的hiPSC-CMs中活性氧产生减少，见图5。这提示NORAD可能在心肌细胞凋亡过程中发挥重要作用。

2.6 过表达NORAD抑制氧糖剥夺/复氧诱导的hiPSC-CMs凋亡 Western blot结果显示，经过氧糖剥夺/复氧诱导后，在过表达NORAD的心肌细胞中，Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达显著上调，Bcl-2蛋白表达明显下调，见图6。

2.7 hiPSC-NORADOECMs移植改善心肌梗死小鼠心功能 超声心动图显示：治疗后4周，与心肌梗死组相比，hiPSC-NORADWT
CMs治疗组小鼠心功能改善，hiPSC-NORADOECMs治疗组心功能进一步改善，表现为左心室射血分数和缩短分数显著升高(图7)。

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引言

心肌梗死的主要发病原因是冠状动脉堵塞，进而导致心肌细胞长时间缺氧，细胞大量死亡，最终诱发心肌功能障碍[1-3]。在哺乳动物中，心肌细胞在出生不久后便退出细胞周期，因此无法有效自我修复以恢复心脏功能[4-6]。目前，用外源性细胞填充心肌梗死瘢痕区域的细胞疗法是最有前途的心脏修复策略之一[7-9]。2007年，人类体细胞被成功重编程为诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)，其在形态、增殖、表面抗原、基因表达谱等方面与人胚胎干细胞相似[10]。人诱导多能干细胞具有分化成多种细胞的能力，如心肌细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、神经元等，使它成为细胞治疗、药物筛选和疾病研究的有利工具[11-14]。目前已有科学家利用疾病特异性人诱导多能干细胞诱导分化的心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CMs)成功建立了心律失常、扩张型心肌病、肥厚型心肌病等疾病模型，为个体化治疗奠定了基础[15-16]。hiPSC-CMs因具有与原代心肌细胞类似的电生理特性[17]，表现出与心肌细胞类似的动作电位[18]，并且可以由患者自身的人诱导多能干细胞分化而来，避免了移植过程中产生免疫排斥反应，成为心肌梗死细胞治疗的重要细胞来源[19]。然而，在进行细胞移植时，细胞的存活率通常较低[20-21]。因此，研究hiPSC-CMs的增殖机制，促进hiPSC-CMs增殖并抑制凋亡，进而提高移植率，成为hiPSC-CMs用于心肌修复的关键待解决问题。
在哺乳动物细胞中，大约98%的基因转录产物为非编码RNA，其中长链非编码RNA是一组长度大于200个核苷酸的非编码RNA[22-23]。长链非编码RNA在细胞周期、凋亡和分化等多种细胞过程中发挥至关重要的作用[24-25]。与蛋白质编码基因不同，长链非编码RNA通常不具有重要的开放阅读框或蛋白质结构域，其编码能力不足[26-27]。DNA损伤激活的非编码RNA(non-coding RNA-activated by DNA damage，NORAD)作为一种在哺乳动物中高度保守且由DNA损伤激活的长链非编码RNA，在维持基因组稳定和正常有丝分裂过程中发挥着关键作用[28-29]。目前关于NORAD与增殖的研究主要集中于肿瘤细胞，已证明在肝癌、肾癌、卵巢癌和前列腺癌等多种肿瘤细胞中可以促进细胞增殖[30-32]。NORAD与心血管疾病的关系也比较密切[33-34]。在高糖诱导的人心肌细胞AC16中，过表达NORAD通过NORAD/miRNA-150-5p/锌指E-Box结合同源盒蛋白1轴增强细胞增殖能力，减少细胞凋亡[35]。但目前尚未发现关于NORAD调控hiPSC-CMs功能的研究报道。
此研究通过构建过表达NORAD的hiPSC-CMs模型，利用氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/ reoxygenation，OGD/R)诱导细胞凋亡，进而探索长链非编码RNA NORAD对hiPSC-CMs增殖和凋亡的影响。在此基础上，将过表达NORAD的hiPSC-CMs移植到小鼠心肌梗死模型中，探索其对心功能的影响，为心肌梗死的细胞治疗提供新策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞实验和体内动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2024年2月至2025年2月在滨州医学院药学院生物技术靶向药物实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 人诱导多能干细胞、HEK 293T细胞系均来自滨州医学院药学院生物技术靶向药物实验室，选择第2-8代人诱导多能干细胞进行实验。将hiPSC-CMs分为对照组(感染阴性对照病毒，hiPSC-NORADWTCMs)和实验组(感染NORAD过表达病毒，hiPSC-NORADOECMs)。
1.3.2 实验动物 成年雄性NSG小鼠24只，SPF级，8-10周龄，体质量25-30 g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK (沪)2024-0007。雄性C57BL/6小鼠，3 d龄6只，8周龄6只，购自山东朋悦实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK(鲁)2023-0002。实验动物在明暗各12 h交替环境下自由饮水和进食，环境温度为(25±2) ℃，湿度为45%-60%。所有动物实验均按照《实验动物护理与使用指南》进行，并经滨州医学院动物护理与使用委员会批准，审批号为：2022-383。
1.3.3 实验试剂与仪器 RPMI1640低糖培养基、RPMI1640培养基(Gibco，美国)；DMEM高糖培养基(美仑，中国)；糖原合成酶激酶3抑制剂CHIR99021(STEMCELL，加拿大)；Wnt抑制剂IWR-1(STEMCELL，加拿大)；Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶抑制剂Y-27632(STEMCELL，加拿大)；胰岛素(普诺赛，中国)；Matrigel(STEMCELL，加拿大)；mTeSRTM1 Plus培养基(STEMCELL，加拿大)；Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，美国)；B27(不含胰岛素)(Gibco，美国)；B27(Gibco，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；二甲基亚砜(索莱宝，中国)；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)(索莱宝，中国)；2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)(Sigma，美国)；乳酸钠(Sigma，美国)；免疫荧光二抗(Invitrogen，美国)；Trizol提取试剂盒(Kakara，日本)；反转录试剂盒(Kakara，日本)；RT-qPCR试剂盒(Kakara，日本)；Anti-Bax(武汉三鹰，中国)；Anti-Bcl-2 (武汉三鹰，中国)；Anti-GAPDH(中杉金桥，中国)；Anti-Ki67(Abcam，英国)；Anti-心肌肌钙蛋白T (Bio-Techne，美国)；Anti-Cleaved Caspase-3(CST，美国)；LEICA Stellaris 5激光共聚焦显微镜(Leica，德国)；流式细胞仪(BD，美国)；ABI Quantsad 3荧光定量PCR仪(Thermo Fisher Scientific，美国)；缺氧培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；高通量组织研磨仪(SCIENTZ，中国)；小动物超声心动图系统(VisualSonics，加拿大)。
1.4 实验方法
1.4.1 Lenti-αMHC-NORAD质粒构建 PCR扩增获得全长人NORAD序列，利用同源重组技术，将NORAD亚克隆到含有心肌特异性αMHC启动子的质粒载体中，以此构建在心肌细胞中特异性过表达NORAD的质粒：Lenti-αMHC-NORAD。
1.4.2 慢病毒包装 当培养良好的HEK 293T细胞生长到70%-80%融合度时，进行慢病毒包装。包装前将细胞培养基更换为无血清无抗生素的DMEM高糖培养基。包装体系总计10 μg，目的质粒∶psPA2X质粒∶PMD2.G质粒=4∶3∶1。准备2个1.5 mL EP管，分别标记为Mix 1和Mix 2，向Mix 1中添加10 μg质粒体系和500 μL无血清无抗生素的DMEM高糖培养基，室温静止5 min；向Mix 2中添加40 μL聚乙烯亚胺和500 μL无血清DMEM高糖培养基，室温静止5 min。将Mix 1和Mix 2充分混匀后室温孵育30 min。将混合液加到HEK 293T细胞中，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养12 h，PBS清洗，更换含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基，继续培养，分别在48 h和72 h收集含病毒颗粒的上清液，于4 ℃冰箱保存。
1.4.3 慢病毒浓缩 两次收集的上清液混匀后，4 ℃、500×g离心10 min，将上清液转移至新的15 mL离心管中，以去除细胞碎片。按病毒液∶浓缩液=3∶1的比例加入慢病毒浓缩液Lenti-X，充分混匀后4 ℃孵育过夜，然后4 ℃、1 500×g离心45 min，弃上清，200 μL PBS充分重悬病毒颗粒，分装后于-80 ℃冰箱保存。
1.4.4 慢病毒感染诱导多能干细胞 当6孔板中第2代人诱导多能干细胞融合度达90%以上时进行传代，使细胞均匀分布至6孔板的6个孔中，传代12 h后将培养基更换为mTeSRTM1 Plus培养基，每孔1 mL，加入病毒并置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。待细胞感染12 h后更换新的mTeSRTM1 Plus培养基，每孔2 mL。感染72 h后用PBS清洗细胞，加入500 μL AccutaseTM消化5 min，收集细胞并以1 100 r/min离心3 min进行传代。待细胞传代12 h后进行杀稻瘟菌素筛选，以获得感染病毒的人诱导多能干细胞。
1.4.5 慢病毒感染的人诱导多能干细胞培养及分化 将1 mL Matrigel包被液加入6孔板中，37 ℃培养箱中静置1 h以形成基质膜。将感染对照病毒和过表达NORAD病毒的人诱导多能干细胞重悬在含有5 μmol/L Y-27632的mTeSRTM1 Plus培养基中并转移至形成基质膜的6孔板，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，每天更换新鲜mTeSRTM1 Plus培养基。将细胞传至第3代，当细胞密度达到90%时进行诱导分化。将培养基更换为含有10 μmol/L CHIR99021和1 μg/mL胰岛素的RPMI1640/B27-(将不含胰岛素的B27按照1∶50比例加入RPMI1640培养基)，培养24 h后，将培养基更换为含有2.5 μmol/L CHIR99021的RPMI1640/B27-，培养48 h后，将培养基更换为含有10 μmol/L IWR1的RPMI1640/B27-，培养48 h后，将培养基更换为RPMI1640/B27-，再培养48 h后，将细胞培养在含B27的RPMI1640培养基(RPMI1640/B27)中，并每3 d换1次培养基。分化8-10 d时，得到自发搏动的心肌细胞，用含4 mmol/L乳酸钠的无葡萄糖RPMI1640培养基纯化5 d，得到高纯度hiPSC-CMs。

1.4.6 RT-qPCR检测NORAD相对表达水平 收集完成分化方案的hiPSC-CMs，Trizol法提取细胞总RNA，用超微量核酸分析仪检测RNA浓度和纯度，使用反转录试剂盒将1 000 ng RNA反转录为cDNA，使用qRCR试剂盒检测NORAD表达水平。将GAPDH作为内参，通过2-ΔΔCT法确定基因的相对倍数变化，引物序列见表1。

另取3 d龄(6只)和8周龄(6只)雄性C57BL/6小鼠心脏组织，将每个组织样本加入磁珠和1 mL Trizol试剂，利用高通量组织研磨仪以70 Hz的频率进行研磨处理，每次持续3 min，重复处理2次，提取总RNA，用超微量核酸分析仪检测RNA浓度和纯度，使用反转录试剂盒将1 000 ng RNA反转录为cDNA，使用qRCR试剂盒检测NORAD表达水平。将GAPDH作为内参，通过2-ΔΔCT法确定基因的相对倍数变化。
1.4.7 免疫荧光检测细胞增殖情况 将完成分化方案的hiPSC-NORADWTCMs和hiPSC-NORADOECMs分别以5×104个/孔的密度接种至24孔板细胞爬片上，细胞培养24 h后，PBS洗涤，用40 g/L多聚甲醛4 ℃固定10 min，PBS洗涤3次，每次3 min；用0.1% Triton X-100于-20 ℃通透1 min，PBS洗涤3次，每次3 min；羊血清封闭液室温孵育30 min；然后与一抗Anti-Ki67和Anti-心肌肌钙蛋白T(标记心肌细胞骨架)4 ℃孵育过夜(Anti-Ki67稀释比例1∶100；Anti-心肌肌钙蛋白T稀释比例1∶50)，PBS洗涤3次，每次3 min；用相应的荧光二抗室温孵育40 min(稀释比例1∶1 000)，PBS洗涤3次，每次3 min；最后用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)室温孵育10 min对细胞核染色，PBS洗涤3次，每次3 min；封固后用激光共聚焦显微镜拍照分析，利用Image J软件统计阳性细胞数。
1.4.8 氧糖剥夺/复氧模型构建 将完成分化方案后的hiPSC-CMs以8×105个/孔密度接种至6孔板中，24 h后更换为不含葡萄糖的RPMI1640培养基，并转移至37 ℃、体积分数5% CO2和1% O2缺氧培养箱中培养12 h，然后将细胞转移至37 ℃、体积分数5% CO2正常培养箱中继续培养30 min，收集细胞用于进一步实验。
1.4.9 流式细胞术检测细胞内活性氧水平 收集经氧糖剥夺/复氧干预的hiPSC-NORADWTCMs和hiPSC-NORADOECMs，将细胞悬浮于10 μmol/L 2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)中，细胞浓度为109 L-1-1010 L-1，37 ℃培养箱内孵育20 min，每隔5 min进行颠倒混匀，使探针与细胞充分接触，用PBS洗涤细胞3次，500×g离心5 min收集细胞，200 μL PBS重悬后，使用BD CantoⅡ流式细胞仪测量荧光强度，荧光强度与细胞内活性氧水平呈正相关。
1.4.10 Western blot检测凋亡相关蛋白表达水平 收集经氧糖剥夺/复氧干预的hiPSC-NORADWTCMs和hiPSC-NORADOECMs，PBS清洗，加入含有1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液充分裂解细胞，离心收集上清，利用BCA法测定蛋白质浓度，加入蛋白缓冲液，95 ℃煮样5 min进行变性；通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯膜上；用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；在4 ℃下分别与一抗Anti-Bax、Anti-Bcl-2、Anti-Cleaved Caspase-3和Anti-GAPDH孵育过夜(Anti-Bax稀释比例1∶5 000；Anti-Bcl-2稀释比例1∶1 000；Anti-Cleaved Caspase-3稀释比例1∶1 000；Anti-GAPDH稀释比例1∶1 000)，TBST洗膜3次，每次10 min；在室温下继续与相应二抗孵育1 h(稀释比例1∶2 500)，TBST洗膜3次，每次10 min；利用ECL发光试剂盒检测膜上的蛋白质，并用Image J软件进行定量分析。
1.4.11 小鼠心肌梗死模型构建及hiPSC-CMs移植 将8-10周龄NSG小鼠随机分为4组：假手术组、心肌梗死组、hiPSC-NORADWTCMs治疗组和hiPSC-NORADOECMs治疗组，每组6只。通过吸入异氟烷(3%-3.5%)麻醉小鼠，插管并通气维持麻醉(1.5%-2%)，打开左胸腔，用8-0不可吸收缝线结扎左冠状动脉前降支，通过心肌漂白区域及漂白边缘区来识别梗死区和梗死边缘区，假手术组只进行开胸，不结扎。细胞移植前在含有10 μmol/L Y-27632的RPMI1640/B27培养基中培养12 h。将已经分化4周的hiPSC-NORADOECMs及其对照hiPSC-NORADWTCMs消化后悬浮于PBS中，然后注射到小鼠心脏的3个部位(每只小鼠3×105个细胞)，1个部位位于梗死区，2个部位位于梗死边缘区(每个部位8 μL，包含1×105个细胞)，心肌梗死组注射等量PBS，注射后缝合胸部肌肉和皮肤，术后每12 h小鼠腹腔注射丁丙诺啡(0.1 mg/kg)，持续注射3 d，每12 h腹腔注射卡洛芬(5 mg/kg)，持续注射1 d。
1.4.12 小动物超声检测心功能 在小鼠治疗4周后使用超声心动图系统Vevo 3100(VisualSonics)进行经胸超声心动图检查。用1.5%-2%异氟烷轻度麻醉小鼠，直到小鼠心率稳定在350-450次/min，然后使用小动物超声系统得到胸骨旁长轴(B模式)和短轴(M模式)超声心动图数据。使用Vevo软件分析图像，以确定左心室射血分数(EF)和缩短分数(FS)。
1.5 主要观察指标 ①长链非编码RNA NORAD在3 d龄幼鼠和8周龄成年小鼠心脏中的表达差异；②过表达NORAD对hiPSC-CMs增殖标志蛋白Ki67表达的影响；③经氧糖剥夺/复氧诱导后，过表达NORAD对hiPSC-CMs中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3表达以及活性氧水平的影响；④在小鼠心肌梗死模型中，移植过表达NORAD的hiPSC-CMs对小鼠心功能的影响。

1.6 统计学分析 使用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。两组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过滨州医学院生物统计学专家审核。

讨论

心肌梗死是全球范围内心血管疾病发病和死亡的主要诱因之一，严重的心肌梗死可进一步引发心力衰竭，极大地威胁人类健康[36-37]。目前，传统药物与介入治疗等方法虽然可以在一定程度上缓解相关症状，但无法逆转受损的心肌细胞[38]。在此背景下，干细胞移植的细胞疗法因其潜在的再生能力而备受关注，展现出了广阔的应用前景[39-40]。然而，较低的移植率限制了其治疗效果。近年来，多项研究聚焦于通过调控hiPSC-CMs的增殖，以增强移植率[41-42]。长链非编码RNA作为一类关键的调控分子，在心血管疾病中的作用受到高度重视，且在心肌细胞增殖调控中发挥着重要作用[43-44]。此研究特别关注了长链非编码RNA NORAD，观察到其在3 d龄幼鼠心脏组织中的表达水平显著高于8周龄成年小鼠心脏。鉴于心肌细胞在出生后约7 d内仍保留有限的增殖能力，随后迅速进入终末分化状态并基本失去增殖潜能。因此，推测NORAD可能在心肌细胞增殖调控网络中发挥重要作用。为探索NORAD与hiPSC-CMs增殖的关系，此研究通过构建在心肌细胞中特异性过表达NORAD的慢病毒，获得hiPSC-NORADOECMs。RT-qPCR验证过表达NORAD细胞模型构建成功，并检测到过表达NORAD显著提高了hiPSC-CMs中Ki67阳性细胞的比例，表明NORAD促进了hiPSC-CMs增殖。此外，在心肌梗死小鼠模型中，移植hiPSC-NORADOECMs可以更好地改善心肌梗死小鼠心功能，为提高hiPSC-CMs移植率和心肌再生提供了新的见解。
随着对心肌梗死病理生理机制的深入研究，活性氧在心肌梗死发生发展中的重要作用被揭示[45-46]。当发生心肌梗死时，尽管及时恢复血流对于挽救缺血组织至关重要，但这一过程会引发再灌注损伤，导致大量活性氧产生[47-48]。高水平的活性氧通过激活凋亡相关信号通路，诱导心肌细胞发生凋亡，从而进一步加重心肌损伤[49-50]。在细胞治疗背景下，hiPSC-CMs移植至梗死区域后，亦面临类似的氧化应激挑战。随着新生血管的形成并为移植细胞提供氧气和营养供应，局部灌注的恢复可能模拟“再灌注”过程，从而诱发移植的hiPSC-CMs产生大量活性氧，这一再灌注样刺激可能通过诱导凋亡，影响其在宿主心肌组织中的存活与整合效率，因此减少移植hiPSC-CMs中活性氧的产生，也是提高移植率要解决的一个关键问题。此研究通过构建氧糖剥夺/复氧模型模拟移植后hiPSC-CMs所经历的应激环境，采用流式细胞术分析活性氧水平，结果显示过表达NORAD可显著抑制氧糖剥夺/复氧诱导的活性氧生成；此外，凋亡相关蛋白Bax与Cleaved Caspase-3表达下调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调。上述结果表明，NORAD不仅在调节hiPSC-CMs增殖中发挥作用，也在应对缺血再灌注样损伤中通过抗氧化应激和抑制细胞凋亡发挥关键保护效应，为提高心肌细胞移植疗法的有效性与安全性提供了潜在的分子靶点。
目前，关于长链非编码RNA NORAD在心肌梗死中的作用研究仍十分有限。已有研究表明，敲低 NORAD可在H9C2等永生化心肌细胞系中减轻低氧损伤，并在动物模型中缓解心肌梗死所致的心脏功能障碍。然而，这些研究多采用全身性干预策略，如系统性注射病毒载体或siRNA实现NORAD的敲低，缺乏对心肌细胞的特异性调控，且可能存在脱靶效应及安全性问题。此外，所使用的细胞模型多为非人源、非终末分化的细胞系，难以真实模拟人类心肌细胞的生理特性，限制了研究结果的转化价值[51-52]。值得注意的是，此研究结果与上述研究存在明显差异：观察到过表达NORAD反而有助于心肌梗死后的心功能修复。这一差异可能源于所使用的模型系统不同，提示NORAD在不同细胞类型或分化状态下可能具有截然不同的功能。
此研究具有显著的创新性，构建了心肌细胞特异性过表达NORAD的hiPSC-CMs模型，并开展了基于hiPSC-CMs的细胞治疗研究。该策略区别于传统的全身性病毒或siRNA给药方式，能够实现对目标基因的精准调控，同时降低系统性干预所带来的脱靶和毒副作用风险。构建的hiPSC-CMs在电生理特性及功能表现方面高度接近体内人心肌细胞，较传统模型具有更高的生理相关性和研究价值，为深入解析NORAD在心肌梗死中的作用机制及潜在的治疗靶点提供了可靠工具和理论基础。
尽管此研究初步揭示了NORAD在心肌梗死中的重要作用，但仍存在一定局限性。首先，虽然观察到长链非编码RNA NORAD可促进hiPSC-CMs增殖，但它调控这一过程的具体下游靶点及相关信号通路尚不明确，机制研究仍需深入；其次，在体内实验中，虽然评估了 hiPSC-NORADOECMs移植对小鼠心功能的影响，但细胞的植入率及其在体内的存活与增殖情况尚未明确，后续需进一步探索。
综上，此研究发现过表达NORAD可以促进hiPSC-CMs增殖，并降低氧糖剥夺/复氧诱导hiPSC-CMs中活性氧水平和凋亡的发生。将hiPSC-NORADOECMs移植到小鼠心肌梗死模型中，显著改善小鼠心脏功能。上述发现为基于干细胞的心肌梗死治疗策略提供了新的理论依据和潜在的干预靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

DNA损伤激活的非编码RNA促进诱导多能干细胞衍生心肌细胞增殖并抑制凋亡

Non-coding RNA-activated by DNA damage promotes proliferation and inhibits apoptosis of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

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