含万古霉素的猪皮脱细胞外基质水凝胶促进皮肤感染创面愈合

doi:10.12307/2026.691

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脱细胞外基质：通过去除组织细胞成分保留的天然细胞外基质(含胶原、糖胺聚糖等)，具有低免疫原性和生物活性，可作为三维支架促进细胞生长与组织修复，广泛用于再生医学研究。
水凝胶：为亲水性高分子通过物理或化学交联形成的三维网络结构材料，可吸收大量水分(含水量达90%以上)并保持固态特性，具有可调节的力学性能和生物相容性，广泛应用于组织工程研究。

背景：针对感染性皮肤创面，临床上常使用药物比如聚维酮碘乳膏和夫西地酸乳膏以控制感染为主，但忽略了创面微环境如炎症的调节，因此，需要开发一种有效抗菌并能调节炎症以促进皮肤愈合的生物材料。
目的：探讨万古霉素-猪皮脱细胞外基质水凝胶的抗菌、抗炎性能以及治疗皮肤感染性创面的效果。
方法：①制备含0，1，2，4 mg/mL万古霉素的猪皮脱细胞外基质水凝胶，分别记为PAEH、VA-PAEH1、VA-PAEH2、VA-PAEH4，检测各组水凝胶的药物包封率与药物释放性能。将小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3分别与4组水凝胶非接触共培养，通过活死染色检测水凝胶的细胞毒性；将小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3分别与4组水凝胶浸提液共培养，通过 CCK-8法检测细胞活力。将4组水凝胶分别与大鼠红细胞悬液共培养，检测溶血率。将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分别与4组水凝胶共培养，检测水凝胶的抗菌性能。综合上述实验结果，筛选出性能优异的VA-PAEH1水凝胶进行后续实验。表征VA-PAEH1水凝胶的微观形貌、溶胀性能、降解性能与流变学特性。②将PAEH水凝胶、VA-PAEH1水凝胶、壳聚糖水凝胶分别与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(或大肠杆菌)共培养，通过琼脂平板涂布实验、抑菌圈实验、扫描电镜观察评估水凝胶的抗菌性能。将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分5组培养：空白组不进行任何处理，对照组加入脂多糖诱导炎症反应，其余3组加入脂多糖24 h后分别加入PAEH水凝胶、壳聚糖水凝胶和VA-PAEH1水凝胶，继续培养24 h后进行CD86(M1型巨噬细胞标记物)、CD206(M2型巨噬细胞标记物)免疫荧光染色。将PAEH水凝胶、壳聚糖水凝胶和VA-PAEH1水凝胶分别与小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3非接触共培养，通过EdU染色检测细胞增殖，划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移。③在28只SD大鼠背部制作1个直径12 mm全层皮肤缺损创面，随后滴加耐甲氧西林金黄色葡萄球菌液模拟感染，随机分4组干预：对照组(n=7)创面注射生理盐水，PAEH组(n=7)、壳聚糖水凝胶组(n=7)和VA-PAEH1组(n=7)创面注射对应的水凝胶，观察创面愈合情况。术后3 d取材，进行髓过氧化物酶和CD206免疫组化染色；术后14 d取材，进行苏木精-伊红与Masson染色。
结果与结论：①VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶的药物包封率分别为98.34%，98.15%和97.68%，3种水凝胶均具有良好的药物缓释效果，但VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶药物累计释放量可能存在安全隐患。CCK-8检测与活死染色显示PAEH、VA-PAEH1水凝胶无明显的细胞毒性，具有良好的细胞相容性。溶血实验显示PAEH、VA-PAEH1水凝胶的溶血率在安全范围内，具有良好的血液相容性。VA-PAEH1、VA-PAEH2、VA-PAEH4均具有良好的抗菌性能。VA-PAEH1水凝胶由互相交织的纤维组成，具有良好的溶胀性能、降解性能与流变学特征。②琼脂平板涂布实验、抑菌圈实验、扫描电镜观察结果显示，相较于PAEH水凝胶、壳聚糖水凝胶，VA-PAEH1水凝胶可有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的生长繁殖。与壳聚糖水凝胶相比，PAEH、VA-PAEH1水凝胶可促进巨噬细胞从M1型向M2型转化，具有良好的抗炎能力。与壳聚糖水凝胶相比，PAEH、VA-PAEH1水凝胶可促进NIH-3T3细胞增殖与迁移。③与其他3组比较，VA-PAEH1组创面愈合最快。苏木精-伊红与Masson染色显示VA-PAEH1组创面炎症细胞浸润较轻、胶原组织致密，创面愈合质量最高。髓过氧化物酶免疫组化染色显示，相较于PAEH水凝胶、壳聚糖水凝胶，VA-PAEH1水凝胶可明显减轻细菌引起的炎症细胞浸润；CD206免疫组化染色显示，相较于PAEH水凝胶、壳聚糖水凝胶，VA-PAEH1水凝胶可提升M2巨噬细胞比例，促进创面愈合。
https://orcid.org/0009-0001-6428-954X(许艺璇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 感染皮肤创面, 脱细胞外基质, 水凝胶, 抗感染, 抗炎, 组织修复, 生物工程材料

Abstract: BACKGROUND: Clinically, drugs such as povidone-iodine cream and fusidic acid cream are commonly used to control infection in infected skin wounds, but regulation of the wound microenvironment, such as inflammation, is neglected. Therefore, it is necessary to develop biomaterials that are effective in antibacterial and can modulate inflammation to promote skin healing.
OBJECTIVE: To investigate the antibacterial and anti-inflammatory properties of the vancomycin-porcine acellular extracellular matrix hydrogel, as well as its therapeutic effects on the healing of infected skin wounds.
METHODS: (1) Porcine skin acellular extracellular matrix hydrogels containing 0, 1, 2, and 4 mg/mL vancomycin were prepared and designated PAEH, VA-PAEH1, VA-PAEH2, and VA-PAEH4, respectively. The drug encapsulation efficiency and drug release properties of each hydrogel were tested in each group. Mouse embryonic fibroblasts (NIH-3T3) were co-cultured with the four groups of hydrogel extracts. The cytotoxicity of the hydrogels was assessed by live-dead staining. Mouse embryonic fibroblasts (NIH-3T3) were co-cultured with the four groups of hydrogel extracts. Cell viability was assessed by CCK-8 assay. The four groups of hydrogels were co-cultured with rat red blood cell suspensions to detect the hemolysis rate. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus was co-cultured with the four groups of hydrogels to detect the antibacterial properties of the hydrogels. Based on the above experimental results, the VA-PAEH1 hydrogel with excellent performance was screened for subsequent experiments. The micromorphology, swelling properties, degradation properties and rheological properties of the VA-PAEH1 hydrogel were characterized. (2) PAEH hydrogel, VA-PAEH1 hydrogel, and chitosan hydrogel were co-cultured with methicillin-resistant Staphylococcus aureus (or Escherichia coli) respectively. The antibacterial properties of the hydrogels were evaluated by agar plate coating test, inhibition zone test, and scanning electron microscopy. Mouse mononuclear macrophage RAW264.7 cells were cultured in five groups. A blank group received no treatment. A control group received lipopolysaccharide to induce an inflammatory response. The remaining three groups received lipopolysaccharide for 24 hours followed by the addition of PAEH hydrogel, chitosan hydrogel, and VA-PAEH1 hydrogel, respectively. After an additional 24 hours of culture, immunofluorescence staining for CD86 (a marker of M1 macrophages) and CD206 (a marker of M2 macrophages) was performed. PAEH hydrogels, chitosan hydrogels, and VA-PAEH1 hydrogels were co-cultured with mouse embryonic fibroblasts NIH-3T3 cells in a non-contact manner. Cell proliferation was assessed by EdU staining. Cell migration was assessed by wound healing assay and Transwell assay. (3) A 12 mm diameter full-thickness skin defect was created on the back of 28 SD rats. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus solution was then dripped onto the rats to simulate infection. The rats were randomly divided into four intervention groups. A control group (n=7) received normal saline injection, while the PAEH group (n=7), chitosan hydrogel group (n=7), and VA-PAEH1 group (n=7) received injections of the corresponding hydrogels. Wound healing was observed. Skulls were harvested 14 days postoperatively for hematoxylin-eosin and Masson staining, and 3 days postoperatively for myeloperoxidase and CD206 immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The drug encapsulation efficiencies of VA-PAEH1, VA-PAEH2, and VA-PAEH4 hydrogels were 98.34%, 98.15%, and 97.68%, respectively. All three kinds of hydrogels exhibited good sustained drug release, but the cumulative drug release from the VA-PAEH2 and VA-PAEH4 hydrogel might pose a safety risk. CCK-8 assay and live/dead staining revealed that PAEH and VA-PAEH1 hydrogels exhibited no significant cytotoxicity and demonstrated good cytocompatibility. Hemolysis assay revealed that the hemolysis rates of PAEH and VA-PAEH1 hydrogels were within a safe range, demonstrating good hemocompatibility. VA-PAEH1, VA-PAEH2, and VA-PAEH4 all exhibited excellent antibacterial properties. VA-PAEH1 hydrogels were composed of interwoven fibers and exhibited excellent swelling, degradation, and rheological properties. (2) Agar plate coating experiments, inhibition zone assays, and scanning electron microscopy revealed that VA-PAEH1 hydrogels effectively inhibited the growth and reproduction of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Escherichia coli compared with PAEH and chitosan hydrogels. Compared with chitosan hydrogels, PAEH and VA-PAEH1 hydrogels promoted the transformation of macrophages from the M1 to M2 phenotype, demonstrating excellent anti-inflammatory properties. Compared with chitosan hydrogels, PAEH and VA-PAEH1 hydrogels promoted NIH-3T3 cell proliferation and migration. (3) Compared with the other three groups, the VA-PAEH1 group showed the fastest wound healing. Hematoxylin-eosin and Masson staining revealed that the VA-PAEH1 group had less inflammatory cell infiltration, denser collagen tissue, and the highest wound healing quality. Myeloperoxidase immunohistochemical staining showed that VA-PAEH1 hydrogel significantly reduced bacterial-induced inflammatory cell infiltration compared with PAEH and chitosan hydrogels. CD206 immunohistochemical staining showed that VA-PAEH1 hydrogel increased the proportion of M2 macrophages compared with PAEH and chitosan hydrogels, promoting wound healing.

Key words: infected skin wound, acellular extracellular matrix, hydrogel, anti-infection, anti-inflammatory, tissue repair, bioengineered material

中图分类号:

许艺璇, 姚俊, 刘旭璐, 李新莲, 刘志雄, 张志红. 含万古霉素的猪皮脱细胞外基质水凝胶促进皮肤感染创面愈合[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(20): 5214-5228.

Xu Yixuan, Yao Jun, Liu Xulu, Li Xinlian, Liu Zhixiong, Zhang Zhihong. Vancomycin-containing porcine skin acellular extracellular matrix hydrogel promotes wound healing in skin infections[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(20): 5214-5228.

图/表（结果） 11

2.1 性能优异水凝胶筛选结果
2.1.1 体外药物释放速率 VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶的药物包封率分别为98.34%，98.15%和97.68%。如图1所示，万古霉素的质量浓度与281 nm波长下吸光度值之间呈线性关系，这一结果与CAI等[30]的研究一致。如图1B所示，VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶在pH=5和pH=7.4环境下前12 h内均快速释放万古霉素，其中VA-PAEH1水凝胶的万古霉素累计释放量分别为72.22%和20.33%，在模拟感染创面的酸性环境下水凝胶的快速释放有利于杀菌[31]，但是VA-PAEH4水凝胶在pH=5环境下12 h的万古霉素累积释放量为86.67%，明显高于VA-PAEH1、VA-PAEH2水凝胶，这可能导致VA-PAEH4水凝胶存在安全风险；在pH=7.4环境下72 h后，VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶的万古霉素累计释放量分别为42.67%，44.33%和47.67%。当皮肤感染控制后创面pH值变成中性[26]。结果表明各组水凝胶均具有良好的缓释效果。

2.1.2 水凝胶的安全性采用CCK-8法检测PAEH、VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶对NIH-3T3细胞活力的影响，结果见图2A。培养24 h，各组细胞活力没有明显差异；培养48，72 h，VA-PAEH2和VA-PAEH4组细胞活力明显低于VA-PAEH组、VA-PAEH1组(P < 0.001)，说明VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶抑制细胞活力，这可能与高浓度万古霉素的毒性作用有关。
红细胞溶血实验结果显示，阳性对照组发生溶血，而其他组别无此现象，取各组上清液测量吸光度值后，结果显示VA-PAEH2组和VA-PAEH4组溶血率高于VA-PAEH组、VA-PAEH1组(P < 0.05，P < 0.005)，并且VA-PAEH2组和VA-PAEH4组溶血率都超过了生物材料溶血安全临界标准 (< 5%)，见图2B。
活死染色结果显示，VA-PAEH2组和VA-PAEH4组可见较多的死细胞，对照组、PAEH组和VA-PAEH1组死细胞较少，见图2C，D。
同时测试了VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶的抗菌性能，结果显示VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶均有明显抗菌效果，并且该3组水凝胶间的抗菌效果无明显差异，见图3。
综合以上实验结果，为了兼顾抗菌效果和安全性能，选择VA-PAEH1水凝胶进行后续实验。

2.2 VA-PAEH1水凝胶的表征结果新鲜猪皮经过脱细胞冷冻干燥后变成白色多孔结构(图4A)，研磨得到外基质粉末(图4B)。在调节pH值、调整渗透压之后，猪皮凝胶溶液外观颜色从浅白色乳液变为半透明白色固体(图4C，D)。苏木精-伊红染色和DAPI染色显示，猪皮外基质中细胞被完全脱去，外基质结构保持完整，见图4E，F。扫描电镜下PAEH水凝胶由互相交织的纤维组成(图4G)。傅里叶变换红外光谱结果显示(图4H)，PAEH水凝胶和VA-PAEH1水凝胶在3 300 cm-1和1 650 cm-1特征峰值没有明显差异，其中万古霉素以非共价键形式装载，装载万古霉素后PAEH水凝胶的主要成分并未发生较大的改变，不影响PAEH水凝胶的胶原结构和物理性能。
在前6 h，VA-PAEH1水凝胶快速吸水，达到溶胀平衡时的溶胀率约为958%，见图5A。VA-PAEH1水凝胶在模拟感染的酸性环境下降解较快，第3天的降解率约为73%，见图5B。
VA-PAEH1水凝胶的流变学特征检测结果，如图5C-E所示。由时间扫描曲线可知，VA-PAEH1水凝胶的储存模量(G’)大于损耗模量(G’’)，表现出黏性固体行为，在测量时间内，VA-PAEH1水凝胶的储存模量和损耗模量基本保持稳定。在振幅扫描模式下，VA-PAEH1水凝胶的储存模量随着应变的增加逐渐减小，损耗模量逐渐增大，储存模量与损耗模量在应变约为10%时相交，超过这个临界点后损耗模量大于储存模量，说明VA-PAEH1水凝胶结构受到了破坏。由动态应变扫描曲线可知，在应变由25%转变成0.1%过程中，VA-PAEH1水凝胶的储存模量逐渐增大，说明VA-PAEH1水凝胶在结构遭到外力破坏后，外力消失后水凝胶结构可以自行恢复。

2.3 VA-PAEH1水凝胶的抗菌性能和抗炎活性检测结果琼脂平板涂布实验结果见图6A，B。结果显示，经PAEH组、壳聚糖水凝胶组和VA-PAEH1组耐甲氧西林金黄色葡萄球菌存活率分别为99.3%，76.67%和2.28%，大肠杆菌存活率分别为96.3%，50.23%和1.17%，表明壳聚糖水凝胶对大肠杆菌具有较强的杀菌作用，而VA-PAEH1水凝胶对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有很强的杀菌作用。
抑菌圈实验结果见图6C，D。结果显示，相较于PAEH水凝胶、壳聚糖水凝胶，VA-PAEH1水凝胶可明显抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长繁殖。扫描电镜观察结果显示，VA-PAEH1组耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌形态发生了变化，细菌表现出形态塌陷和中心凹陷，见图6E。结果表明VA-PAEH1水凝胶具有良好的抗菌特性，是由于万古霉素可以破坏细菌细胞壁[32]。
良好的抗炎能力也是促进皮肤创面愈合的关键[33]。
首先，M1和M2型巨噬细胞分别促进炎症和产生抗炎因子[34]，此次研究用脂多糖处理RAW264.7细胞模拟炎症反应，通过免疫荧光鉴定了CD86(一种M1型巨噬细胞标记物)和CD206(M2型巨噬细胞标记物)表达。免疫荧光染色结果显示，PAEH组、VA-PAEH1组CD86表达量低于对照组、壳聚糖水凝胶组，CD206表达高于壳聚糖水凝胶组和对照组，差异均有显著性意义，见图6F，G。以上结果表明，PAEH、VA-PAEH1水凝胶促进了巨噬细胞从M1型向M2型转化。

2.4 VA-PAEH1水凝胶促进NIH-3T3细胞增殖和迁移细胞增殖是创面愈合的关键阶段。EdU染色结果显示，PAEH、VA-PAEH1水凝胶能有效促进NIH-3T3细胞的增殖，见图7A，B。划痕实验结果显示，PAEH、VA-PAEH1水凝胶有促进了NIH-3T3细胞迁移，见图7C，D。Transwell小室实验结果显示，PAEH、VA-PAEH1水凝胶具有对NIH-3T3细胞的趋化能力，见图7E，F。

2.5 VA-PAEH1水凝胶修复大鼠感染皮肤创面实验结果
2.5.1 实验动物数量分析 28只SD大鼠全部进入结果分析。
2.5.2 创面愈合率随着术后时间的延长，各组创面逐渐闭合，见图8A。术后第3天，对照组、PAEH组、壳聚糖水凝胶组和VA-PAEH1组创面愈合率分别为6.26%，8.21%，12.73%和28.13%；术后第7天，VA-PAEH组创面面积明显缩小，创面愈合率约为60.86%，至术后第14天创面几乎完全愈合，对照组、PAEH组和壳聚糖水凝胶组术后第7天的创面愈合率分别为15.21%，26.48%，24.47%，术后第14天的创面愈合率分别为21.41%，30.07%和44.76%，见图8B。

2.5.3 创面组织形态学观察苏木精-伊红染色结果显示，对照组和PAEH组创面中心炎症细胞分布较多，可见部分炎性渗出，壳聚糖水凝胶组和VA-PAEH1组创面中心炎症细胞浸润较轻，并且VA-PAEH1组创面愈合间隙更小，提示成纤维细胞增生明显，见图9A。
胶原蛋白的沉积可以反映创面愈合情况[35]。Masson染色结果显示，对照组和壳聚糖水凝胶组整体蓝染较弱，仅在表层分布，表现出疏松胶原组织，提示胶原发育不足，VA-PAEH1组创面部位出现更高致密的胶原组织，见图9B。

2.5.4 创面组织巨噬细胞表型极化分析各组大鼠皮肤创面髓过氧化物酶与CD206免疫组化染色结果，见图10。
与对照组相比，PAEH组、壳聚糖水凝胶组和VA-PAEH1组髓过氧化物酶阳性细胞比例都降低，其中VA-PAEH1组降低更明显，这一结果提示VA-PAEH释放的万古霉素通过强效清除病原体消除感染对中性粒细胞的趋化刺激，从而抑制中性粒细胞向感染部位的募集[36]。在皮肤创面愈合早期阶段，M1型巨噬细胞转变为M2型巨噬细胞对组织肉芽过渡到增殖期至关重要[37]。与对照组相比，PAEH组、壳聚糖水凝胶组和VA-PAEH1组CD206阳性细胞比例均升高，其中VA-PAEH1组升高更明显。结果表明，VA-PAEH水凝胶可以实现感染控制与组织再生双重效果。

2.5.5 主要脏器组织学观察过量万古霉素可能导致肝肾损伤，各组大鼠主要脏器进行苏木精-伊红染色结果如图11所示，各组大鼠心、肝、脾和肾病理组织学观察未见明显改变。

参考文献

[1] LI Q, SONG H, LI S, et al. Macrophage metabolism reprogramming EGCG-Cu coordination capsules delivered in polyzwitterionic hydrogel for burn wound healing and regeneration. Bioact Mater. 2023;29:251-264.
[2] WANG Y, BEEKMAN J, HEW J, et al. Burn injury: Challenges and advances in burn wound healing, infection, pain and scarring. Adv Drug Deliv Rev. 2018;123:3-17.
[3] SINGER AJ, CLARK RA. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 1999; 341(10):738-746.
[4] QIAN Y, ZHENG Y, JIN J, et al. Immunoregulation in Diabetic Wound Repair with a Photoenhanced Glycyrrhizic Acid Hydrogel Scaffold. Adv Mater. 2022;34(29):e2200521.
[5] 李小鸾.10%聚维酮碘乳膏治疗皮肤感染性创面的疗效观察[J]. 中国实用医药,2020,15(13):143-145.
[6] 王廷宇,叶子青,郭晓雨,等.夫西地酸治疗浅II度烧伤的疗效及对烧伤常见菌的体外抗菌活性探讨[J].中国美容医学,2023, 32(4):34-37.
[7] BLACKLOW SO, LI J, FREEDMAN BR, et al. Bioinspired mechanically active adhesive dressings to accelerate wound closure. Sci Adv. 2019; 5(7):eaaw3963.
[8] ZHAO X, WU H, GUO B, et al. Antibacterial anti-oxidant electroactive injectable hydrogel as self-healing wound dressing with hemostasis and adhesiveness for cutaneous wound healing. Biomaterials. 2017;122:34-47.
[9] YANG Z, HUANG R, ZHENG B, et al. Highly Stretchable, Adhesive, Biocompatible, and Antibacterial Hydrogel Dressings for Wound Healing. Adv Sci (Weinh). 2021;8(8):2003627.
[10] UBEROI A, MCCREADY-VANGI A, GRICE EA. The wound microbiota: microbial mechanisms of impaired wound healing and infection. Nat Rev Microbiol. 2024;22(8):507-521.
[11] NOVIELLO S, COREY GR, HOLLAND TL, et al. A pooled analysis of patients with wound infections in the Phase 3 REVIVE trials: randomized, double-blind studies to evaluate the safety and efficacy of iclaprim versus vancomycin for treatment of acute bacterial skin and skin structure infections. J Med Microbiol. 2020;69(4):625-630.
[12] 常欣悦,徐丽,吴晓旭.急性细菌性皮肤感染病原菌耐药性及万古霉素治疗效果[J].中华医院感染学杂志,2022,32(5):745-749.
[13] CHEN Y, WANG X, TAO S, et al. Research advances in smart responsive-hydrogel dressings with potential clinical diabetic wound healing properties. Mil Med Res. 2023;10(1):37.
[14] ZHANG W, WU W, WANG T, et al. Novel Supramolecular Hydrogel for Infected Diabetic Foot Ulcer Treatment. Adv Healthc Mater. 2024; 13(31):e2402092.
[15] KOWALEWSKI M, PASIERSKI M, MAKHOUL M, et al. Topical vancomycin for sternal wound infection prophylaxis. A systematic review and updated meta-analysis of over 40,000 cardiac surgery patients. Surgery. 2023;174(5):1102-1112.
[16] 刘旭良,李伯庭,郑介柏,等.负压封闭引流技术联合外用万古霉素治疗骶尾部难愈性压疮的效果[J].医学信息,2022,35(17): 37-40.
[17] 何家伟,王菁,汪洋,等.局部应用万古霉素粉末预防膝和髋关节置换术后手术部位感染有效性和安全性的meta分析[J].中国现代应用药学,2024,41(6):812-822.
[18] SALEH A, THABET A, BELKHAIR S. Topical Vancomycin for Prevention of Surgical Site Infection after Craniotomy: Meta-analysis and Systematic Literature Review. World Neurosurg. 2022;158:e605-e611.
[19] MA H, SIU WS, LEUNG PC. The Potential of MSC-Based Cell-Free Therapy in Wound Healing-A Thorough Literature Review. Int J Mol Sci. 2023;24(11):9356.
[20] 石晶,楚瑨,孙涛,等.脱细胞基质-甲基丙烯酰化明胶复合水凝胶的制备及其对肝细胞增殖的作用[J].国际生物医学工程杂志, 2025,48(1):47-55.
[21] SRICHAIYAPOL O, MADDOCKS SE, THAMMAWITHAN S, et al. TA-AgNPs/Alginate Hydrogel and Its Potential Application as a Promising Antibiofilm Material against Polymicrobial Wound Biofilms Using a Unique Biofilm Flow Model. Microorganisms. 2022;10(11):2279.
[22] JIN F, LI X, CHEN J, et al. Clinical study on the role of platelet-rich plasma in human acellular dermal matrix with razor autologous skin graft repair of giant congenital pigmented nevus in children. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2024;90:305-314.
[23] TAMAYO L, SANTANA P, FORERO JC, et al. Coaxial fibers of poly(styrene-co-maleic anhydride)@poly(vinyl alcohol) for wound dressing applications: Dual and sustained delivery of bioactive agents promoting fibroblast proliferation with reduced cell adherence. Int J Pharm. 2022;611:121292.
[24] DONG Q, ZU D, KONG L, et al. Construction of antibacterial nano-silver embedded bioactive hydrogel to repair infectious skin defects. Biomater Res. 2022;26(1):36.
[25] KONG P, DONG J, LI W, et al. Extracellular Matrix/Glycopeptide Hybrid Hydrogel as an Immunomodulatory Niche for Endogenous Cardiac Repair after Myocardial Infarction. Adv Sci (Weinh). 2023; 10(23):e2301244.
[26] IYER V, RAUT J, DASGUPTA A. Impact of pH on growth of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus in vitro. J Med Microbiol. 2021;70(9).doi:10.1099/jmm.0.001421.
[27] MO GY, ZHANG SC, LI YX, et al. [Establish mouse osteoblast -osteoclast cell co-culture system in a Transwell chamber]. Zhongguo Gu Shang. 2018;31(3):241-247.
[28] LI Y, WANG Y, DING Y, et al. A Double Network Composite Hydrogel with Self-Regulating Cu2+/Luteolin Release and Mechanical Modulation for Enhanced Wound Healing [published correction appears in ACS Nano. 2024 Dec 17;18(50):34415-34418.
[29] SIM HW, LEE WY, LEE R, et al. The Anti-Inflammatory Effects of Broccoli (Brassica oleracea L. var. italica) Sprout Extract in RAW 264.7 Macrophages and a Lipopolysaccharide-Induced Liver Injury Model. Curr Issues Mol Biol. 2023;45(11):9117-9131.
[30] CAI D, CHEN S, WU B, et al. Construction of multifunctional porcine acellular dermal matrix hydrogel blended with vancomycin for hemorrhage control, antibacterial action, and tissue repair in infected trauma wounds. Mater Today Bio. 2021;12:100127.
[31] FANG B, QIU P, XIA C, et al. Extracellular matrix scaffold crosslinked with vancomycin for multifunctional antibacterial bone infection therapy. Biomaterials. 2021;268:120603.
[32] THITIANANPAKORN K, AIBA Y, TAN XE, et al. Association of mprF mutations with cross-resistance to daptomycin and vancomycin in methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Sci Rep. 2020; 10(1):16107.
[33] LI F, LIU T, LIU X, et al. Ganoderma lucidum polysaccharide hydrogel accelerates diabetic wound healing by regulating macrophage polarization. Int J Biol Macromol. 2024;260(Pt 2):129682.
[34] LEE J, BYUN H, MADHURAKKAT PERIKAMANA SK, et al. Current Advances in Immunomodulatory Biomaterials for Bone Regeneration. Adv Healthc Mater. 2019;8(4):e1801106.
[35] WANG Y, GAO H, WANG X, et al. Dual cross-linked self-healing hydrogel enhanced by dopamine nanoparticles and raffinose for wound healing. Int J Biol Macromol. 2024;271(Pt 1):132615.
[36] YAO J, XIAO L, LIN MJ, et al. Bifunctional copper ion/melittin incorporated hydrogel with antimicrobial and antioxidant capabilities for infected skin wound healing. Mater Design. 2025;250:113631.
[37] XU Y, HU Q, WEI Z, et al. Advanced polymer hydrogels that promote diabetic ulcer healing: mechanisms, classifications, and medical applications. Biomater Res. 2023;27(1):36.
[38] GE Y, RONG F, LU Y, et al. Glucose Oxidase Driven Hydrogen Sulfide-Releasing Nanocascade for Diabetic Infection Treatment. Nano Lett. 2023;23(14):6610-6618.
[39] LIU S, HUANG Y, JENSEN S, et al. Molecular physiological characterization of the dynamics of persister formation in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2024;68(1):e0085023.
[40] SUN S, WANG Q, ZHANG B, et al. Vancomycin-Loaded in situ Gelled Hydrogel as an Antibacterial System for Enhancing Repair of Infected Bone Defects. Int J Nanomedicine. 2024;19:10227-10245.
[41] ANDRIANOPOULOU A, SOKOLOWSKI K, WENZLER E, et al. Assessment of antibiotic release and antibacterial efficacy from pendant glutathione hydrogels using ex vivo porcine skin. J Control Release. 2024;365:936-949.
[42] LIU W, GAO R, YANG C, et al. ECM-mimetic immunomodulatory hydrogel for methicillin-resistant Staphylococcus aureus-infected chronic skin wound healing. Sci Adv. 2022;8(27):eabn7006.
[43] DEURENBERG RH, STOBBERINGH EE. The evolution of Staphylococcus aureus. Infect Genet Evol. 2008;8(6):747-763.
[44] WALTERS MS, EGGERS P, ALBRECHT V, et al. Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus - Delaware, 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2015;64(37):1056.
[45] LI D, LI J, XU Y, et al. Topical vancomycin powder for the prevention of surgical site infections in spinal deformity surgery: a systematic review and meta-analysis. Eur Spine J. 2024;33(12):4653-4663.
[46] GHOSH S, MUKHERJEE S, PATRA D, et al. Polymeric Biomaterials for Prevention and Therapeutic Intervention of Microbial Infections. Biomacromolecules. 2022;23(3):592-608.
[47] Gao X, Chai X, Lou Y, et al. Fabrication of porcine acellular dermal matrix and oxidized hyaluronic acid conductive composite hydrogels for accelerating skin wound healing under electrical stimulation. Int J Biol Macromol. 2024;282(Pt 4):137179.
[48] CANNON JGD, HO AL, MOHOLE J, et al. Topical vancomycin for surgical prophylaxis in non-instrumented pediatric spinal surgeries. Childs Nerv Syst. 2019;35(1):107-111.
[49] FURNARY AP, WU Y. Clinical effects of hyperglycemia in the cardiac surgery population: the Portland Diabetic Project. Endocr Pract. 2006;12 Suppl 3:22-26.
[50] LAZAR HL, KETCHEDJIAN A, HAIME M, et al. Topical vancomycin in combination with perioperative antibiotics and tight glycemic control helps to eliminate sternal wound infections. J Thorac Cardiovasc Surg. 2014;148:1035-1038;1038-1040.

引言

皮肤是人体抵御外界刺激的主要物理屏障[1]，当皮肤受到创伤时，炎症、渗出物和细菌感染就会随之而来[2]。感染性皮肤创面的愈合具有挑战性，创面愈合主要分为炎症、增殖和重建3个阶段[3]，而细菌感染通常会加重炎症反应[4]，这反过来又会造成皮肤愈合困难。针对感染性皮肤创面，临床上常使用药物比如聚维酮碘乳膏和夫西地酸乳膏以控制感染为主[5-6]，但忽略了创面微环境如炎症的调节，因此，需要开发一种有效抗菌并能调节炎症来促进创面愈合的生物材料。
传统创面覆盖物(包括纱布、棉絮和绷带)的主要目的是保持病变部位的水分和管理创面渗出物[7-8]，但是传统辅料依赖于创面被动的恢复过程。近年来的研究显示，水凝胶可以为细胞提供潮湿的环境以加速皮肤损伤的修复[9]。临床中急性污染创面往往包括多种菌群[10]，尽早消灭细菌可以使感染创面向清洁创面转变[11-12]。目前临床常用的创面水凝胶具有一定抗菌能力且可为创面提供湿润环境[13-14]，但抗菌能力不足，可能导致残留细菌通过血液通道到达体内其他器官，引起继发感染[13]。作为治疗感染创面首选的抗生素——万古霉素[15]，局部使用可以减轻器官毒性和耐药性，因此，包含万古霉素的生物材料被广泛用于创面消毒和预防细菌感染[16-18]。常用的创面水凝胶主要材料包括壳聚糖、透明质酸和聚乙二醇[11-13]，注重为细胞提供潮湿环境。但是创面愈合是一个模块化的复杂过程，涉及炎症、增殖和重塑，而不仅是控制感染和关闭创面[19]。研究发现，富含糖胺聚糖和生长因子的猪皮脱细胞外基质水凝胶可有效促进组织缺损修复，是一种很有前途的再生材料[20]。脱细胞外基质不仅可以模拟原始细胞外基质的天然三维结构与各类生物活性成分[21-22]，还能提供化学和机械信号对细胞的黏附、增殖以及分化起到指导作用，促进同源组织的修复与再生[22-24]。KONG等[25]研究表明，脱细胞外基质水凝胶可以促进巨噬细胞从M1型向M2型极化，减少肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β等炎症因子释放，有效促进细胞迁移及组织修复。
此次研究设计了万古霉素-猪皮脱细胞外基质水凝胶，评估该水凝胶的抗菌性能、抗炎性能、细胞相容性、血液相容性、对成纤维细胞增殖与迁移的影响以及治疗感染性创面的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计水凝胶的制备与表征、细胞实验、动物实验。
1.2 时间及地点实验于2024年12月至2025年2月在杭州医学院医学研究所动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料与试剂壳聚糖水凝胶(武汉穆兰同大科技有限公司)；Triton X-100、十二烷基硫酸钠、大豆蛋白胨(国药集团化学试剂有限公司)；琼脂、胃蛋白酶(北京索莱宝科学有限公司)；胰蛋白胨(英国OXOID公司)；脂多糖、CCK-8试剂盒、Live-Dead染色试剂盒(上海翌圣生物科技股份有限公司)；苏木精-伊红染液、DAPI染液、抗荧光淬灭封固液(上海碧云天生物技术有限公司)；髓过氧化物酶、CD206、CD86抗体及荧光二抗(武汉三鹰公司)；头孢呋辛酯、万古霉素粉末(上海毕得医药科技有限公司)；胎牛血清、1%青霉素和链霉素和DMEM培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司)。
1.3.2 主要仪器真空冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)；涡旋仪、酶标仪、傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo公司)；荧光倒置显微镜(日本尼康公司)；扫描电子显微镜(日本日立公司)；流变仪(加拿大安帕东公司)。
1.3.3 实验细胞与菌种小鼠胚胎成纤维细胞
NIH-3T3和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7由中国科学院杭州肿瘤医院提供。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细菌均购自宁波泰斯拓生物技术有限责任公司。
1.3.4 实验动物雄性SD大鼠32只，3月龄，体质量200-250 g，购自杭州医学院实验动物中心，生产许可证号：SCXK(浙)2024-0002。大鼠饲养于杭州医学院实验动物中心[SYXK(浙)2024-0008]，室温
(25±3) ℃，自由饮食，12 h光照循环。实验过程符合国家及单位实验动物管理和使用规定，实验方案经浙江省实验动物中心实验动物福利伦理委员会批准，批准号为ZJCLA-IACUC-20011073。
1.4 实验方法
1.4.1 猪皮脱细胞外基质水凝胶的制备从当地屠宰场收集猪皮，用无菌水冲洗3 h，连续3次冻融(−80−37 ℃)循环。将猪皮组织切成1 cm×1 cm小块，用剪刀去除皮下组织，在恒温振荡箱(25 ℃，120 r/min)中用1% Triton X-100溶液处理12 h、0.1%十二烷基硫酸钠处理6 h，PBS充分冲洗后在-50 ℃冷冻干燥12 h，研磨后得到猪皮脱细胞外基质粉末。将100 mg胃蛋白酶和300 mg猪皮脱细胞外基质粉末加入装有10 mL稀盐酸溶液(pH=2.0-3.0)的试管中，在摇床(100 r/min)上消化30 min，在消化过程中加入不同质量的万古霉素，保证万古霉素在溶液中质量浓度分别为1，2，4 mg/mL，继续消化2 h至凝胶呈半透明黏稠状，得到猪皮脱细胞外基质前体，保存在4 ℃冰箱中备用；将预冷的10 mmol/L NaOH 滴加至猪皮脱细胞外基质前体中，调整水凝胶前体pH值=7.0-8.0，使用1×PBS调节溶液渗透压，得到1，2，4 mg/mL万古霉素-猪皮脱细胞外基质水凝胶，分别记为VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4。同理，在不加入万古霉素的情况制备单纯的猪皮脱细胞外基质水凝胶，记为PAEH。所有上述步骤均在无菌条件下进行。水凝胶使用前经紫外线照射6 h灭菌。
1.4.2 筛选性能优异的水凝胶
水凝胶的药物包封率检测：使用酶标仪测量不同浓度万古霉素在281 nm波长下的吸光度值，绘制标准浓度曲线。将VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶分别加入1 mL PBS中，100 r/min离心5 min后取上清液，使用酶标仪测量上清液在281 nm波长下的吸光度值，根据万古霉素标准浓度曲线计算万古霉素质量(记为m1)，计算药物包封率。
药物包封率(%)=(初始加入万古霉素质量-m1)/初始加入万古霉素质量×100%
水凝胶的药物释放性能：为了模拟感染早期皮肤的酸性环境[26]，将0.5 mL的VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶分别放入2 mL pH=5(或pH=7.4) PBS中，在第0，0.5，1，2，3，6，12，24，48和72 小时，使用酶标仪测量PBS溶液的吸光度值，并根据万古霉素标准浓度曲线计算VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶的万古霉素释放量。
水凝胶的血液相容性：抽取4只SD大鼠尾静脉血，离心后获取红细胞，配置成体积分数为2%红细胞悬液。将1.5 mL红细胞悬液分别与0.1 mL的PAEH、VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶共孵育2 h，3 000 r/min离心15 min后取上清液，使用酶标仪在540 nm波长下测定吸光度值，计算溶血率。设置0.1 mL 1% Triton X-100与红细胞悬液共培养为阳性对照组，0.1 mL PBS与红细胞悬液共培养为阴性对照组。溶血率< 5%为生物材料溶血安全临界标准。
溶血率=(实验组吸光度值-阴性对照组吸光度值)/(阳性对照组吸光度值-阴性对照组吸光度值)×100%
水凝胶的细胞相容性：①将PAEH、VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶浸泡于含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基(DMEM完全培养基)中1 h。将对数生长期的NIH-3T3细胞悬液接种于24孔板中，细胞密度为2×104/孔，待细胞贴壁后使用Transwell小室与水凝胶非接触共培养[27]，将30 μL 的DMEM完全培养基(对照组)、PAEH、VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶分别置于Transwell小室上层中，随后将小室上层转移至接种NIH-3T3细胞悬液的24孔中。培养48 h后，通过Live-Dead染色试剂盒对24孔板中NIH-3T3细胞进行染色，活细胞被钙叶黄素染成绿色，死细胞被碘化丙啶染成红色，置于荧光显微镜下观察，利用Image J软件统计活细胞和死细胞数目，计算细胞死亡率。②根据DONG等[24]研究报道的方法制备PAEH、VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶浸提液，在37 ℃条件下将4组水凝胶按照1∶4的体积比分别浸泡在DMEM完全培养基中，24 h后收集到的上清液即为水凝胶浸提液。将对数生长期的NIH-3T3细胞悬液接种于96孔板中，细胞密度为5×103/孔，待细胞贴壁后吸弃培养基，分别加入DMEM完全培养基(对照组)与PAEH、VA-PAEH1、VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶浸提液各100 μL，空白组仅加入100 μL DMEM完全培养基(无细胞)。培养24，48，72 h后，每孔加入10% CCK-8溶液，使用酶标仪检测450 nm波长下的吸光度值，计算细胞活力。
细胞死亡率(%)=死细胞数目/(死细胞数目+活细胞数目)×100%
细胞活力(%)=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%
水凝胶的抗菌性能：将0.3 mL的PAEH、VA-PAEH1、VA-PAEH2、VA-PAEH4水凝胶分别与0.5 mL耐甲氧西林金黄色葡萄球菌悬液共培养12 h，细菌浓度为1×106 CFU/mL，1 000 r/min离心10 min后去除上清液，使用1 mL生理盐水重悬菌悬液，取100 μL
菌悬液加入96孔板中，使用酶标仪检测600 nm波长下的吸光度值。综合以上实验结果，筛选出最优的水凝胶进行后续实验。
1.4.3 VA-PAEH1水凝胶的表征
组织学分析：通过苏木精-伊红染色和DAPI染色验证猪皮脱细胞外基质的去细胞效果。
扫描电镜观察：将PAEH水凝胶真空冷冻干燥处理(-50 ℃)12 h，进行液态二氧化碳脱水、喷金处理，在扫描电镜下观察水凝胶的结构和表面形貌。
傅里叶变换红外光谱检测：将冷冻干燥后的PAEH、VA-PAEH1水凝胶使用研磨机打磨成粉末，使用溴化钾法在傅里叶红外光谱仪在500-4 000 cm-1范围内进行红外扫描。
溶胀性能检测：将0.5 mL VA-PAEH1水凝胶真空冷冻干燥(-50 ℃)12 h，得到干燥水凝胶，称量质量(m1)；放入5 mL EP管中，加入5 mL PBS(pH=7.4，37 ℃)孵育，分别在0.5，1，2，3，6，12和24 h取出水凝胶，测量水凝胶质量(m2)，计算水凝胶的溶胀率(%)。
溶胀率(%)=(m2-m1)/m1×100%
降解性能检测：取0.5 mL VA-PAEH1水凝胶放入15 mL离心管中，提前称量离心管质量(m1)，再称量离心管和水凝胶总质量(m2)，加入10 mL pH=5(或pH=7.4 )PBS来模拟感染状态下(或正常生理状态下)的pH值[28]，分别在6，12，24，48和72 h后吸出离心管中的液体，称量离心管和水凝胶总质量(m3)，称量完毕后加入相同体积PBS，计算降解率。
降解率(%)=(m2-m1)/(m3-m1)×100%
流变学分析：将0.5 mL VA-PAEH1水凝胶置于37 ℃平行板上，在振幅扫描模式下，应变从0.1%-50%不等，频率设定为10 rad/s，持续10 min；在时间扫描模式下，温度(37 ℃)和频率(10 rad/s)保持不变，应变设定为0.1%，持续6 min；在动态应变扫描模式下，频率设定为10 rad/s，应变设定为0.1%和25%，各持续1 min为一个周期，共3个周期。记录VA-PAEH1水凝胶的储存模量(G’)和损耗模量(G’’)。
1.4.4 VA-PAEH1水凝胶的抗菌活性和抗炎能力
菌液琼脂平板涂布实验：将0.3 mL的PAEH水凝胶、VA-PAEH1水凝胶、壳聚糖水凝胶分别与0.5 mL耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(或大肠杆菌)悬液共培养，以单独培养的菌悬液为对照，细菌浓度为1×106 CFU/mL。培养12 h后，1 000 r/min离心10 min后去除上清液，使用1 mL生理盐水重悬菌悬液，连续稀释1 000倍后在琼脂平板上进行涂布，孵育12 h后利用Image J软件统计细菌数目，计算细菌存活率。
细菌存活率=实验组细菌数目/对照组细菌数目×100%
扫描电镜观察细菌形态：将0.3 mL的PAEH水凝胶、VA-PAEH1水凝胶、壳聚糖水凝胶分别与0.5 mL耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(或大肠杆菌)悬液共培养，以单独培养的菌悬液为对照，细菌浓度为1×106 CFU/mL。培养12 h后，1 000 r/min离心10 min后去除上清液，40 g/L多聚甲醛固定30 min，梯度乙醇溶液脱水处理，置于冷冻干燥机中过夜，在扫描电镜下观察细菌形态。
抑菌圈实验：将5 mL约60 ℃液态琼脂培养基倒入10 cm细菌培养皿，待琼脂培养基凝固后形成下层培养基。在下层培养基上放置6 mm的牛津杯，再分别倒入5 mL与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(或大肠杆菌)混合的液态琼脂培养基，细菌浓度为1×106 CFU/mL，待凝固后形成上层培养基。取出牛津杯后形成凹槽，分别在凹槽中加入30 μL的生理盐水(对照组)、PAEH水凝胶、壳聚糖水凝胶和VA-PAEH1水凝胶。孵育12 h后，使用相机对培养皿进行拍照，测量抑菌圈直径。
抗炎能力检测：将RAW264.7细胞接种于6孔板中，细胞密度为1×105/孔，待细胞贴壁后分5组培养：空白组不进行任何处理，对照组加入10 ng/mL脂多糖诱导形成炎性巨噬细胞[29]，其余3组加入10 ng/mL脂多糖处理24 h后分别加入50 μL的PAEH水凝胶、壳聚糖水凝胶或VA-PAEH1水凝胶。培养24 h后吸去培养基，40 g/L多聚甲醛固定30 min，0.03% Triton X-100通透15 min，用PBS清洗3次，分别加入CD86抗体(1∶100)和CD206(1∶100)孵育过夜，用PBS清洗3次后加入二抗溶液室温孵育2 h，DAPI染细胞核，用PBS清洗3次，置于荧光显微镜下观察并拍照，使用Image J软件定量分析荧光强度。
1.4.5 VA-PAEH1水凝胶对NIH-3T3细胞增殖、迁移的影响
EdU染色：将对数生长期的NIH-3T3细胞接种于24孔板中，细胞密度为2×104/孔，待细胞贴壁后使用Transwell小室与水凝胶非接触共培养[27]，将30 μL 的DMEM完全培养基(对照组)、PAEH水凝胶、VA-PAEH1水凝胶、壳聚糖水凝胶分别置于Transwell小室上层中，随后将小室上层转移至接种NIH-3T3细胞悬液的24孔中。培养24 h后去除培养基，40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，每孔加入EdU染色液室温孵育2 h，加入Hoechst 33342染色液，用PBS洗涤后置于荧光倒置显微镜下观察并拍照，利用Image J软件计数细胞，计算细胞增殖率。
细胞增殖率=绿染细胞数/蓝染细胞数×100%
划痕实验：将对数生长期的NIH-3T3细胞接种于24孔板中，细胞密度为5×104/孔，待细胞贴壁后，使用200 μL灭菌枪头进行划线处理；将30 μL的DMEM完全培养基(对照组)、PAEH水凝胶、VA-PAEH1水凝胶、壳聚糖水凝胶分别置于Transwell小室上层中，随后将小室上层转移至接种NIH-3T3细胞悬液的24孔中。分别在0，24，48 h拍照，利用Image J软件分析划线区域面积变化作为迁移率。
Transwell小室实验：在Transwell小室上层中接种对数生长期的NIH-3T3细胞，加入60 μL不含胎牛血清的DMEM培养基，细胞密度为2×103/孔；在Transwell小室下层分别加入300 μL DMEM完全培养基(对照组)、30 μL PAEH水凝胶+300 μL DMEM完全培养基、30 μL 壳聚糖水凝胶+300 μL DMEM完全培养基和VA-PAEH1水凝胶+300 μL DMEM完全培养基。培养24 h后取出小室，40 g/L多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色30 min，用PBS清洗2遍，用棉签擦去上室细胞，在显微镜下观察并拍照，使用Image J 软件计数细胞。
1.4.6 VA-PAEH1水凝胶修复大鼠感染皮肤创面
实验分组与干预：取SD大鼠28只，吸入3%异氟烷诱导麻醉后固定于操作台上，剃除背部毛发，涂抹碘伏，采用直径12 mm的圆形模具印在大鼠背部皮肤，用手术剪沿模具印迹剪去背部皮肤，深至筋膜，随后进行止血处理，在缺损部位滴50 μL 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(细菌浓度为1×108 CFU)，采用随机数字表法随机分为4组干预：对照组(n=7)创面注射100 μL生理盐水，PAEH组(n=7)、壳聚糖水凝胶组(n=7)和VA-PAEH1组(n=7)创面注射100 μL对应的水凝胶，使用医用防水聚氨酯薄膜固定，每3 d更换一次水凝胶，连续处理14 d。术后单笼饲养，避免大鼠互相抓挠创面组织。为预防创面感染，术后灌胃给予20 mg/(kg·d)头孢呋辛酯混悬剂14 d。
创面愈合率测算：以大鼠急性创面模型建立当天记为0 d (初始创面面积S0)，分别在造模后第0，3，7及14 d拍照记录并观察大鼠创面愈合情况，使用Image J 软件统计创面面积(第n天创面面积S1)，计算创面愈合率。
创面愈合率(%)=(S0-S1)/S0×100%
创面组织形态学观察：术后14 d，每组取3只大鼠，吸入3%异氟烷麻醉后处死，收集创面部位组织，置于40 g/L多聚甲醛中，依次进行组织脱水、石蜡包埋、切片(5 μm)，分别进行苏木精-伊红染色与Masson染色，置于显微镜下观察并拍照。术后28 d，每组取1只大鼠，吸入3%异氟烷麻醉后处死，取主要脏器(心、肝、脾、肾)进行苏木精-伊红染色。
免疫组化染色：术后3 d，每组取3只大鼠，吸入3%异氟烷麻醉后处死，收集创面部位组织，置于40 g/L多聚甲醛中，依次进行组织脱水、石蜡包埋、切片(5 μm)，组织切片脱蜡至水，进行抗原修复，分别加入一抗溶液髓过氧化物酶 (1∶200)和CD206 (1∶500)于4 ℃孵育过夜；次日用PBS洗涤，分别加入HRP标记的二抗溶液于室温孵育1 h，DAB显色，苏木精复染，组织切片脱水后用中性树胶封固，置于显微镜下观察并拍照，阳性表达呈棕黄色，使用Image J 软件分析髓过氧化物酶和CD206阳性细胞比例。
1.5 主要观察指标 VA-PAEH1水凝胶的理化性能、体外抗菌、生物学性能及促进大鼠感染创面愈合的能力。
1.6 统计学分析采用Graph Pad Prism 9.4.1软件进行统计学处理，实验数据以x±s表示。多组间比较使用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两组间比较使用t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过西南医科大学临床医学院统计学专家审核。

讨论

在皮肤感染早期细菌处于快速增殖阶段[38-39]，比如皮肤常见细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表面的蛋白A等黏附因子与皮肤创面的纤维连接蛋白结合，促进细菌定植生长；同时创面组织血管收缩、血液供应不足，共同作用下导致创面营养物质及氧气不足，糖酵解增加，降低了创面pH值[31]。此次研究显示，VA-PAEH1水凝胶在接触到皮肤创面后能够快速释放万古霉素，6 h内累计释放率高达(71.2±3.2)%，这可能是早期感染创面的酸性环境加速了VA-PAEH1水凝胶负载药物的自由扩散[40]，在创面部位快速达到有效药物浓度，随着感染创面逐渐转为中性环境，药物自由扩散减弱，依赖PAEH水凝胶缓释特性持续释放，维持创面药物浓度。此次研究观察到VA-PAEH1水凝胶与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及大肠杆菌共培养12 h后的细菌存活率低，分别为3.2%和2.3%，扫描电镜下显示VA-PAEH1组细菌形态塌陷和中心凹陷，表明早期VA-PAEH水凝胶具有极强的抗菌效果。同时发现释放的万古霉素接触病原菌后，通过有效阻止病原菌细胞壁的主要结构聚合物肽聚糖交联从而破坏细菌细胞壁，最终导致细菌内容物溢出死亡[41]，创造相对无菌环境。
已有研究表明，感染早期巨噬细胞呈现出阻止组织修复的M1型，从而加速释放促炎细胞因子，过度的炎症反应会促使创面处的细胞外基质降解，血管内皮细胞受损以及表皮细胞增殖受到抑制[42]。由于感染创面缺乏完整的上皮化修复，使得深部组织更易遭受耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的再次黏附、形成生物膜，甚至发生深部组织定植，从而造成皮肤感染性创面迁延不愈[39，43]。此次实验结果表明，VA-PAEH1水凝胶早期能有效降低RAW264.7细胞M1标志物CD86表达，提升有利于组织修复的M2标志物CD206表达，从而迅速杀灭病原菌群，减少病原菌毒素等产生，减轻炎症反应，有助于创面周围组织的修复[42]。相对比之下，传统壳聚糖水凝胶虽然有一定抗菌效果，但抗菌效果远不如VA-PAEH1水凝胶，同时实验结果提示壳聚糖水凝胶无法促进RAW264.7细胞从M1型转为M2型，因此抗炎效果与VA-PAEH水凝胶存在显著差异。
体外实验结果显示，VA-PAEH1水凝胶可以促进NIH-3T3细增殖与迁移；通过大鼠皮肤感染模型发现，VA-PAEH水凝胶可以有效促进皮肤创面愈合，术后14 d时皮肤愈合率达到了约90%，值得一提的是PAEH组也表现出一定促进创面愈合能力，这可能是由于PAEH水凝胶中富含胶原蛋白、糖胺聚糖、骨形态发生蛋白、生长因子等物质，可促进皮肤组织缺损修复[41]。相反，壳聚糖水凝胶促细胞迁移能力与PAEH组及VA-PAEH组存在明显差异，术后14 d皮肤愈合率约50%，与VA-PAEH1水凝胶存在明显差异，因此，VA-PAEH1水凝胶不仅能够快速有效地杀死细菌，还具有较好的生物相容性。在水凝胶的安全性以及细胞毒性实验中，VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶具有一定的细胞毒性；但是与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌共培养的抗菌效果实验显示，VA-PAEH2、VA-PAEH4与VA-PAEH1水凝胶的抗菌能力没有显著差异，分析这种情况是因为：当万古霉素质量浓度为1 mg/mL时，VA-PAEH1水凝胶快速释放的万古霉素浓度已经达到最小抑制浓度[44]，即便增加万古霉素质量浓度抗菌效果也不会有明显差异。结果表明，VA-PAEH1水凝胶为感染创面提供了最佳药物治疗浓度，在安全性及细胞毒性方面均显著优于VA-PAEH2和VA-PAEH4水凝胶，在同效果的前提下能够有效提升万古霉素的药物利用率。
VA-PAEH1水凝胶通过直接作用于皮肤创面使创面处迅速达到万古霉素杀菌浓度，避免全身药物浓度过高引起的肾毒性、耳毒性等不良反应[45]。此次研究对大鼠主要器官进行苏木精-伊红染色，结果发现PAEH水凝胶和VA-PAEH水凝胶不会对大鼠脏器造成损伤，具有良好的生物相容性。目前脱细胞外基质水凝胶常用来填充以及包裹传递活性生物分子或药物，已广泛用于研究治疗各类外伤及手术细菌感染[46]，例如：纳米银颗粒PAEH水凝胶能够持续发挥抗菌作用，透明质酸PAEH动态交联导电水凝胶在电刺激作用下可促进皮肤创面愈合[24，47]。此外，CANNON等[48]的研究表明，局部外用万古霉素后患者血清肌酐仅有轻微波动，同时体内万古霉素药物浓度检测呈阴性，药物相关不良反应并未发生。在一项关于外用万古霉素的Meta分析中也明确表明，未发现局部外用万古霉素产生的全身毒性或局部并发症报道[15]。关于局部创面使用万古霉素最常见的担忧就是可能增加耐药菌株的产生，已有研究表明持续全身性使用亚抑制水平的万古霉素(浓度超过10 mg/mL)才会诱导耐药菌株的产生。相反，对于存在基础疾病的患者，局部创面使用万古霉素的创面感染发生率大幅度下降[49-50]。综上所述，VA-PAEH1水凝胶不仅有抗炎、抗菌功能，还能起到促进皮肤组织愈合的作用，说明VA-PAEH1水凝胶是一种具有发展潜力的新型伤口敷料，有望在未来的临床实践中得到进一步研究和开发。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程