针刺结合艾灸调节骨关节炎模型大鼠滑膜昼夜节律蛋白的表达

doi:10.12307/2022.356

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (11): 1714-1719.doi: 10.12307/2022.356

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

针刺结合艾灸调节骨关节炎模型大鼠滑膜昼夜节律蛋白的表达

谈倩1，李柏村1 ，李静1，李佳2，向宏春1，蔡国伟1

1华中科技大学同济医学院附属协和医院针灸科，湖北省武汉市 430022；2湖北中医药大学针灸骨伤学院/针灸治未病湖北省协同创新中心，湖北省武汉市 430061

收稿日期:2021-04-12 修回日期:2021-04-15 接受日期:2021-06-01 出版日期:2022-04-18 发布日期:2021-12-11
通讯作者: 蔡国伟，主任医师，硕士生导师，华中科技大学同济医学院附属协和医院针灸科，湖北省武汉市 430022
作者简介:谈倩，女，1995年生，汉族，湖北省武汉市华中科技大学同济医学院在读硕士，主要从事针灸治疗骨关节病研究。
基金资助:
国家自然科学基金课题(81774410)，项目负责人：蔡国伟，项目名称：基于软骨细胞骨架蛋白探讨温针灸对骨关节炎的调节作用；湖北省卫健委项目(ZY2021M018)，项目负责人：蔡国伟，项目名称：温针灸对骨关节炎大鼠微循环的调控作用

Acupuncture combined with moxibustion regulates the expression of circadian clock protein in the synovium of rats with osteoarthritis

Tan Qian1, Li Bocun1, Li Jing1, Li Jia2, Xiang Hongchun1, Cai Guowei1

1Department of Acupuncture and Moxibustion, Union Hospital affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China; 2College of Acupuncture and Orthopedics, Hubei University of Chinese Medicine, Hubei Provincial Collaborative Innovation Center of Preventive Treatment by Acupuncture and Moxibustion, Wuhan 430061, Hubei Province, China

Received:2021-04-12 Revised:2021-04-15 Accepted:2021-06-01 Online:2022-04-18 Published:2021-12-11
Contact: Cai Guowei, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Acupuncture and Moxibustion, Union Hospital affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
About author:Tan Qian, Master candidate, Department of Acupuncture and Moxibustion, Union Hospital affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81774410 (to CGW); Hubei Provincial Health Commission Project, No. ZY2021M018 (to CGW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Clock蛋白：Clock是昼夜节律的核心调控蛋白，其由Clock基因编码，在各个器官和组织中表达。Clock的C端与组蛋白乙酰化酶具有同源性，它能催化组蛋白H3及脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1(Bmal1)的乙酰化，且Bmal1的乙酰化必须有Clock的参与。
Bmal1蛋白：Bmal1蛋白是调节生物节律的一种非常重要的转录因子，在时钟体系中发挥着重要的作用，可以和Clock蛋白相结合形成异二聚体，共同发挥调控昼夜节律的作用，并间接参与炎症反应。
TRPV4蛋白：TRPV4是TRP家族的成员之一，维持细胞内Ca2+平衡等生理过程，可以被温热性刺激、低渗性、化学物刺激及机械刺激等活化，由于其与其他TRP家族的成员相比具有对机械刺激敏感的特点，TRPV4常被认为是机械痛觉过敏发生机制中的重要分子。

背景：滑膜炎症是膝骨性关节炎的主要病理特征之一，既往研究表明针灸治疗膝骨性关节炎效果显著，而针灸是否通过调控滑膜中的相关蛋白改善相关症状值得进一步研究。
目的：探讨针刺结合艾灸对膝骨性关节炎大鼠滑膜组织中的生物钟蛋白(Clock、Bmal1)、TRPV4和炎症因子白细胞介素1β的影响。
方法：80只3月龄SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、针刺组、针+灸组，每组20只，后3组以手术方法制备膝骨关节炎大鼠模型，于术后第7天取右膝足三里(ST36)、犊鼻(ST35)和内膝眼(EX-LE5)进行治疗，针刺组针刺5 mm，15 min/次，1次/d，共21 d；针+灸组治疗同针刺组，并结合悬起灸。所有大鼠相应处理结束后，采用旷场实验测大鼠自发活动能力；苏木精-伊红染色观察滑膜组织病理结构；Western blot检测滑膜组织Clock，Bmal1，TRPV4的表达；免疫荧光法检测滑膜组织白细胞介素1β的表达。
结果与结论：①与对照组比较，模型组大鼠自发活动明显降低，其滑膜组织Clock及Bmal1表达量明显降低，TRPV4和炎性因子白细胞介素1β的表达明显升高(P < 0.01)，并且滑膜上皮损失严重。②与模型组比较，针刺和针+灸均能显著改善大鼠自发活动，提高骨关节炎大鼠滑膜组织中Clock及Bmal1蛋白表达水平(P < 0.05)，降低TRPV4和白细胞介素1β的表达(P < 0.05)，改善滑膜上皮损失程度；与针刺组相比，针+灸组改善更为明显(P < 0.05)。③相对于针刺，针刺结合艾灸更能有效调节膝骨关节炎大鼠关节炎性损伤状况，降低滑膜细胞TRPV4的表达，促进骨关节炎大鼠滑膜组织中Clock，Bmal1的表达，从而调节滑膜细胞生物钟，降低炎性因子的表达，减缓膝骨关节炎的退变。
缩略语：瞬时受体电位香草素受4型通道蛋白：transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4

https://orcid.org/0000-0002-1472-3926 (谈倩)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 针灸, 足三里, 膝骨关节炎, 生物钟, Clock, Bmal1, TRPV4, 白细胞介素1β

Abstract: BACKGROUND: Synovitis is one of the main pathological features of knee osteoarthritis. Previous studies have shown that acupuncture has a significant effect on knee osteoarthritis. Whether acupuncture can relieve the symptoms by regulating the related proteins in synovium is worthy of further study.
OBJECTIVE: To investigate the effects of acupuncture combined with moxibustion on circadian clock proteins (Clock, Bmal1), TRPV4, and interleukin-1β in the synovium of rats with osteoarthritis.
METHODS: Eighty 3-month-old male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: control group, model group, acupuncture group and acupuncture combined with moxibustion group (n=20 per group). Rat models of osteoarthritis were prepared by surgery in the latter three groups. Rats in the acupuncture group were treated with manual acupuncture at Zusanli (ST36), Dubi (ST35), and Neixiyan (EX-LE5) acupoints on the 7th day of modeling, at a depth of 5 mm, 15 minutes once a day, totally for 21 days. Rats in the acupuncture combined with moxibustion group were treated with acupuncture (same as that in the acupuncture group) combined with moxibustion. After corresponding treatments, the spontaneous activity ability of the rats was measured by an open field test. The pathological structure of the synovium was observed by hematoxylin-eosin staining. The expression of Clock, Bmal1 and transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) in the synovium was detected by western blot. The expression of interleukin-1β in the synovium was detected by immunofluorescence labeling.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the expression of Clock and Bmal1 in the synovium was significantly decreased (P < 0.01), the levels of interleukin-1β and TRPV4 in the synovium were significantly increased (P < 0.05), and moreover severer loss of synovial epithelium was observed in the model group. Compared with the model group, acupuncture and acupuncture combined with moxibustion could significantly improve the spontaneous activity ability of the rats, increase the expression of Clock and Bmal1 (P < 0.05), decrease the levels of interleukin-1β and TRPV4 in the rat synovium (P < 0.05), and relieve the loss of synovial epithelium. Compared with the acupuncture group, these changes were more obvious in the acupuncture combined with moxibustion group (P < 0.05). To conclude, relative to acupuncture alone, acupuncture combined with moxibustion can effectively regulate arthritic injury in knee osteoarthritis rats, reduce the expression of TRPV4 in synovial cells, promote the expression of Clock and Bmal1 in the synovium, thereby regulating the circadian clock in synovial cells, reducing the expression of inflammatory factors and slowing the degeneration of knee osteoarthritis.

Key words: acupuncture, Zusanli, knee osteoarthritis, circadian clock, Clock, Bmal1, TRPV4, interleukin-1β

中图分类号:

谈倩, 李柏村 , 李静, 李佳, 向宏春, 蔡国伟. 针刺结合艾灸调节骨关节炎模型大鼠滑膜昼夜节律蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1714-1719.

Tan Qian, Li Bocun, Li Jing, Li Jia, Xiang Hongchun, Cai Guowei. Acupuncture combined with moxibustion regulates the expression of circadian clock protein in the synovium of rats with osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(11): 1714-1719.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 SD大鼠80只随机分为4组，每组20只，其中模型组和针+灸组由于感染导致各有1只大鼠死，脱落大鼠未进行补充，所以78只大鼠进入结果分析。
2.2 使用旷场实验测试大鼠自发活动能力旷场实验结果：与对照组相比，模型组大鼠平均速度、总运动距离明显降低，休息时间明显增高(P < 0.01)；与模型组相比，针刺组和针+灸组均能提高大鼠运动速度，提高总运动距离并减少休息时间(P < 0.05)，但针+灸组的疗效明显优于针刺组(P < 0.05)，见图1。

2.3 滑膜组织苏木精-伊红染色对照组关节滑膜组织完整，未见炎性细胞浸润和血管增生；模型组滑膜浅层充血，部分滑膜上皮脱失，伴少量炎细胞浸润，呈慢性炎症改变，周围软组织充血水肿，毛细血管扩张；针+灸组和针刺组滑膜上皮脱失程度有所改善，且滑膜上皮细胞排列整齐，呈近似水平排列，其中针+灸组改善最为显著，见图2。

2.4 各组大鼠膝关节滑膜组织Clock、Bmal1和TRPV4蛋白相对表达量比较由图3可见，与对照组比较，模型组大鼠膝关节滑膜组织中Clock和Bmal1蛋白表达明显减少(P < 0.01)，而TRPV4蛋白表达明显升高(P < 0.01)；针+灸和针刺均能升高大鼠膝关节滑膜组织中Clock、Bmal1蛋白表达并降低TRPV4蛋白表达，与模型组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，两组中针+灸组Clock和Bmal1蛋白表达升高、TRPV4蛋白表达降低最为明显，与针刺组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 各组大鼠滑膜组织白细胞介素1β免疫荧光染色从图4可见，免疫荧光染色结果显示，模型组大鼠膝关节滑膜组织中白细胞介素1β水平较对照大鼠明显升高(P < 0.01)；针+灸和针刺能降低大鼠膝关节滑膜组织中白细胞介素1β水平，与模型组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，两组中针+灸组白细胞介素1β水平降低最为明显，与针刺组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

参考文献

[1] HUNTER DJ, BIERMA-ZEINSTRA S. Osteoarthritis. Lancet. 2019;393 (10182):1745-1759.
[2] THOMAS E, PEAT G, CROFT P. Defining and mapping the person with osteoarthritis for population studies and public health. Rheumatology (Oxford). 2014;53(2):338-345.
[3] ALSHAMI AM. Knee osteoarthritis related pain: a narrative review of diagnosis and treatment. Int J Health Sci (Qassim). 2014;8(1):85-104.
[4] FERKET BS, FELDMAN Z, ZHOU J, et al. Impact of total knee replacement practice: cost effectiveness analysis of data from the Osteoarthritis Initiative. BMJ. 2017;356:j1131
[5] CHEN N, WANG J, MUCELLI A, et al. Electro-Acupuncture is beneficial for knee osteoarthritis: the evidence from meta-analysis of randomized controlled trials. Am J Chin Med. 2017;45(5):965-985.
[6] 杨冬梅,林诗彬,梁振波,等.温针灸治疗膝关节骨性关节炎疗效的超声监测[J].重庆医学,2016,45(27):3860-3862.
[7] 何兆雍. 温针灸治疗膝骨性关节病的Meta分析及系统回顾[D]. 广州:广州中医药大学,2018.
[8] LEVICK JR. Microvascular architecture and exchange in synovial joints. Microcirculation. 1995;2(3):217-233.
[9] HAND LE, DICKSON SH, FREEMONT AJ, et al. The circadian regulator Bmal1 in joint mesenchymal cells regulates both joint development and inflammatory arthritis. Arthritis Res Ther. 2019 6;21(1):5.
[10] ZHOU Y, TAO H, LI Y, et al. Berberine promotes proliferation of sodium nitroprusside-stimulated rat chondrocytes and osteoarthritic rat cartilage via Wnt/β-catenin pathway. Eur J Pharmacol. 2016;789: 109-118.
[11] 郭义.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社,2008.
[12] WEBER AE, BOLIA IK, TRASOLINI NA. Biological strategies for osteoarthritis: from early diagnosis to treatment. Int Orthop. 2021; 45(2):335-344.
[13] 丁呈彪,周云.膝骨性关节炎患者滑膜炎的发病机制及研究进展[J].中国组织工程研究,2015,19(51):8327-8332.
[14] 赵烨,刘永辉,毛书歌,等.骨性关节炎的滑膜病变机制及中药治疗进展[J].中国高新科技,2020(18):159-160.
[15] ZHANG L, XING R, HUANG Z, et al. Inhibition of Synovial Macrophage Pyroptosis Alleviates Synovitis and Fibrosis in Knee Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2019;2019:2165918.
[16] GOSSAN N, BOOT-HANDFORD R, MENG QJ. Ageing and osteoarthritis: a circadian rhythm connection. Biogerontology. 2015;16(2):209-219.
[17] LEE C, ETCHEGARAY JP, CAGAMPANG FR, et al. Posttranslational mechanisms regulate the mammalian circadian clock. Cell. 2001;107(7): 855-867.
[18] ZHANG Z, ZENG P, GAO W, et al. Circadian clock: a regulator of the immunity in cancer. Cell Commun Signal. 2021;19(1):37.
[19] BEKKI H, DUFFY T, OKUBO N, et al. Suppression of circadian clock protein cryptochrome 2 promotes osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2020;28(7):966-976.
[20] DUDEK M, ANGELUCCI C, PATHIRANAGE D, et al. Circadian time series proteomics reveals daily dynamics in cartilage physiology. Osteoarthritis Cartilage. 2021;29(5):739-749.
[21] CHO H, ZHAO X, HATORI M, et al. Regulation of circadian behaviour and metabolism by REV-ERB-α and REV-ERB-β. Nature. 2012;485(7396): 123-127.
[22] MORRIS JL, LETSON HL, GILLMAN R, et al. The CNS theory of osteoarthritis: Opportunities beyond the joint. Semin Arthritis Rheum. 2019;49(3):331-336.
[23] GOSSAN N, ZEEF L, HENSMAN J, et al. The circadian clock in murine chondrocytes regulates genes controlling key aspects of cartilage homeostasis. Arthritis Rheum. 2013;65(9):2334-2345.
[24] AKAGI R, AKATSU Y, FISCH KM, et al. Dysregulated circadian rhythm pathway in human osteoarthritis: NR1D1 and BMAL1 suppression alters TGF-β signaling in chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 2017; 25(6):943-951.
[25] MA Z, JIN X, QIAN Z, LI F, et al. Deletion of clock gene Bmal1 impaired the chondrocyte function due to disruption of the HIF1α-VEGF signaling pathway. Cell Cycle. 2019;18(13):1473-1489.
[26] 蔡国伟,李柏村,李佳,等.温针灸对骨关节炎大鼠软骨组织Clock、Bmal1蛋白的影响[J].中国中西医结合杂志,2019,39(10): 1225-1229.
[27] 贾振华,黄渊,唐景峰,等. TRP通道超家族的基本特征及其与疾病的关系[J].生命科学,2020,32 (9):29-40.
[28] 刘天珍,王鸣刚,崔冰冰,等.TRPV4在氧化应激相关疾病中的作用及其机制研究进展[J].解放军医药杂志,2020,32(11):113-116.
[29] SEGOND VON BANCHET G, BOETTGER MK, KÖNIG C, et al. Neuronal IL-17 receptor upregulates TRPV4 but not TRPV1 receptors in DRG neurons and mediates mechanical but not thermal hyperalgesia. Mol Cell Neurosci. 2013;52:152-160.
[30] KOCHUKOV MY, MCNEARNEY TA, YIN H, et al. Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α) Enhances Functional Thermal and Chemical Responses of TRP Cation Channels in Human Synoviocytes. Mol Pain. 2009;20(5):49.
[31] 魏歆然,魏高文,郑雪娜,等.不同经穴组合针刺对失眠大鼠下丘脑生物钟基因Clock和Bmal 1表达的影响[J].针刺研究,2017, 42(5):429-433.
[32] 郭保君,余思奕,申治富,等.针刺跷脉对失眠大鼠视交叉上核内生物钟基因Period 1及Period 2的影响[J].针刺研究,2017,42(6): 507-509.
[33] CHENG AH, CHENG HM. Genesis of the Master Circadian Pacemaker in Mice. Front Neurosci. 2021;15:659974.
[34] IHARA T, MITSUI T, NAKAMURA Y, et al. The Circadian expression of Piezo1, TRPV4, Connexin26, and VNUT, associated with the expression levels of the clock genes in mouse primary cultured urothelial cells. Neurourol Urodyn. 2018;37(3):942-951.
[35] CUESTA M, AUNGIER J, MORTON AJ. Behavioral therapy reverses circadian deficits in a transgenic mouse model of Huntington’s disease. Neurobiol Dis. 2014;63:85-91.
[36] RIVAS GBS, TELES-DE-FREITAS R, PAVAN MG,et al. Effects of Light and Temperature on Daily Activity and Clock Gene Expression in Two Mosquito Disease Vectors. J Biol Rhythms. 2018;33(3):272-288.
[37] SIMONI A, WOLFGANG W, TOPPING MP, et al. A mechanosensory pathway to the Drosophila circadian clock. Science. 2014;343(6170): 525-528.

引言

在滑膜、关节同时发生软骨病变和骨质增生则称之为骨性关节炎，是中老年最常见的进展性、退行性关节疾病[1]，并且近年来其发病率持续上升，有学者预计在2030年骨关节炎将是导致残疾的主要原因之一[2]，其中膝关节炎在骨关节炎中发病率最高[3]。目前，膝骨关节炎的治疗主要依赖于抗炎药物和手术，药物长期服用不良反应大，只能治标不能治本，而手术风险高且增加了患者的经济负担[4]。最新的指南仍推荐使用保守非药物治疗膝骨关节炎[5]，针灸作为传统治疗手段之一，具有创伤小和毒副作用小的特点。现代临床研究表明，温针灸可改善膝关节血液循环、缓解关节腔积液及滑膜增厚情况[6]。并且循证医学证据也进一步证实，相对于西药，温针灸治疗膝骨关节炎疗效较好[7]。然而，温针灸治疗膝骨关节炎的科学内涵尚不明确，需进一步探讨。
如今学者们已经越来越多地关注到滑膜病变在膝骨关节炎病情发展中的重要作用，滑膜炎症会导致新血管形成、软骨血管化、滑膜增厚滑液营养输送功能减弱、血管翳生成，从而严重损伤软骨[8]。研究表明，当滑膜组织中昼夜节律蛋白表达出现异常时，会破坏软骨组织结构的完整性和稳定性，从而进一步导致膝骨关节炎的发生和发展，其中Clock和Bmal1是主要的昼夜节律核心蛋白[9]。
因此，该实验主要研究目的是针刺结合艾灸是否能调控膝骨关节炎模型大鼠膝关节滑膜组织中Clock及Bmal1的表达，并通过检测瞬时受体电位香草素受4型通道蛋白(transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4)的表达和相关炎性因子含量进一步探讨其作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年9月至2020年3月在湖北中医药大学针灸骨伤学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物由湖北省医学科学研究院实验动物中心提供的80只3月龄雄性SPF级SD大鼠，体质量为(180±10) g，动物合格证号：SCXK(鄂)2015-0018号。放置于环境温度21-25 ℃，湿度40%-60%环境中适应7 d，按照随机数字法分组，分别为对照组(n=20)、模型组(n=20)、针刺组(n=20)和针+灸组(n=20)，其中每组选10只用于苏木精-伊红染色和免疫荧光染色(石蜡切片)，另外10只用于免疫印迹实验。实验严格遵守科技部[2006]398号文件《关于善待实验动物的指导性意见》要求。
1.3.2 主要试剂及仪器香烟型艾条(南阳市卧龙汉医艾绒厂)，0.30 mm×13 mm华佗牌毫针(苏州医疗用品厂有限公司)；化学发光成像系统(美国伯乐公司)，电泳仪(美国伯乐公司)，病理切片机(德国Leica)，组织摊片机(武汉俊杰)；苏木素染液和伊红染色剂(贝索生物技术研究有限公司)，40 g/L多聚甲醛固定液、RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂(武汉阿斯本生物技术有限公司)，Bmal1抗体、Clock抗体(美国 santa cruz公司)，TRPV4抗体、白细胞介素1β抗体、β-actin抗体(英国 Abcam公司)，HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG(武汉阿斯本生物技术有限公司)，Alexa Fluor® 488山羊抗兔IgG H&L(英国 Abcam公司)。
1.4 方法

1.4.1 模型制备以手术结合术后跑台运动诱导骨关节炎动物模型[10]，具体步骤：按照2 mL/kg的剂量，使用2%戊巴比妥钠溶液腹腔注射对大鼠进行麻醉。待大鼠完全麻醉后，使用碘伏消毒关节局部的皮肤，切断右侧膝关节的前交叉韧带并剔除内侧半月板，出现抽屉试验阳性则说明手术成功，手术结束后，对局部皮肤进行缝合，并在术后3 d内肌肉注射青霉素0.5 mL(20万U/只)，防止感染。术后第7天开始将大鼠放置于大鼠跑步装置运动30 min，持续3周以诱导膝骨关节炎模型，大鼠出现跛行、跳跃动作，说明造模成功。对照组在麻醉并局部消毒后，只剪开右侧膝关节局部皮肤，不做手术，并进行缝合，其余操作同上。

1.4.2 干预方法自制鼠衣固定大鼠，依据中国针灸学会实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴位图谱》[11]，取右侧足三里(ST 36)、犊鼻(ST 35)和内膝眼(EX-LE 5)，治疗从大鼠跑步运动开始(即术后第7天)。
针刺组：采用0.30 mm×13 mm毫针进行针刺，针刺右侧足三里、犊鼻和内膝眼，针刺深度为5 mm，强度以大鼠耐受为度，静留针，15 min/次，1次/d，连续治疗21 d。
针+灸组：针刺操作同上，同时并将直径为1 cm的香烟型纯艾条放置于穴位上方2 cm左右，15 min/次，1次/d，连续治疗21 d。
对照组和模型组均不做治疗干预。
1.5 检测指标
1.5.1 旷场实验使用旷场实验测试大鼠自发活动能力。所有大鼠均行旷场实验，实验在取材前1 d进行。在实验前 30 min，大鼠放置于实验室内适应实验装置。每只大鼠依次被置于一个1 m×1 m×0.5 m反应箱中央，使其自由探索，数码摄像头置于反应箱正上方2 m处，保持视野能覆盖整个反应箱内部，拍摄大鼠5 min活动过程，大鼠的活动数据保存于计算机中，并且平均速度、总行程、休息时间由计算机进行分析。
1.5.2 滑膜标本苏木精-伊红染色实验结束后将大鼠颈椎脱臼处死，将右侧膝关节标本用40 g/L多聚甲醛固定液固定48 h，再进行脱钙处理，脱钙处理1个月后，石蜡包埋，并制作4 μm厚的切片，按照苏木精-伊红染色步骤进行操作，完成后在光学显微镜下观察滑膜情况。
1.5.3 免疫印迹法检测滑膜组织中Clock、Bmal1、TRPV4蛋白含量冰上提取滑膜组织蛋白并测定浓度后，将所有样品的浓度稀释至2 g/L，每次上样体积为10 μL，配制10% SDS-PAGE进行电泳，转膜，封闭，在4 ℃环境下，孵育一抗(抗体的稀释比例为1︰2 000)，孵育时间为16 h，之后孵育二抗(HRP标记山羊抗兔IgG稀释比例为1︰2 000，HRP标记山羊抗鼠IgG稀释比例为1︰5 000)后加入ECL发光液显影，使用化学发光成像系统进行扫描，运用Image J软件分析目的蛋白条带Clock、Bmal1、TRPV4相对灰度值，其中β-actin作为内参，进行半定量分析。
1.5.4 免疫荧光染色检测滑膜组织白细胞介素1β的表达取得滑膜组织经上述步骤制成石蜡切片后，按照免疫荧光方法进行操作，其中一抗稀释比例为1︰500，二抗稀释比例为 1︰500，最后将处理好的切片置于倒置荧光显微镜下观察并统一参数进行拍照。运用Image J软件对所得图像的荧光强度进行统计分析。
1.6 统计学分析实验中所有数据均采用GraphPad Prism 8.3.0软件进行统计分析和绘制图表，计量资料以 x±s表示。所有资料先进行正态性、方差齐性检验，符合正态分布且方差齐组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布时采用秩和检验，P < 0.05则说明差异有显著性意义。计数数据采用率表示，采用χ²检验比较率的显著性。

讨论

膝骨关节炎是最常见的骨骼肌肉疾病之一，最主要的临床表现为疼痛和关节活动障碍[12]，严重的甚至会导致残疾，其中关节活动障碍严重影响了患者的生活质量。在此次研究中发现，模型组较对照组而言，大鼠的自主活动能力明显减弱，而在针刺以及针刺结合艾灸治疗后，大鼠的自主活动能力较模型组得到了明显的提升，并且针刺结合艾灸的效果更为显著，这与作者之前的研究结果保持一致，说明针灸能够改善膝骨关节炎大鼠的活动能力。软骨损伤是膝骨关节炎的最主要病理特点，但越来越多的证据表明，保护软骨不应成为膝骨关节炎治疗的唯一重点，滑膜在骨关节炎的发生和发展中也起着至关重要的作用，在膝骨关节炎的早期到晚期都伴随着滑膜炎的表现[13]。有学者在研究滑膜与骨关节炎机制的关联性中发现，炎症因子会导致滑膜细胞过度增殖，从而导致滑膜纤维化、血管化[14]，而白细胞介素1β是骨关节炎中公认的具有破坏作用的炎症因子[15]。此次研究通过免疫荧光结果发现，针刺结合艾灸极大水平地降低了滑膜组织中白细胞介素1β的表达，反映了针刺以及针刺和艾灸可以调节滑膜组织的炎症因子，从而改善局部炎症反应，减轻滑膜炎症。
现代研究发现，存在于几乎所有组织中的生物钟分子对细胞的正常功能具有重要调节作用，其相关基因在健康情况下与外界昼夜节律的保持同步[16]。哺乳动物具有两套时钟系统：主时钟和外周时钟，主生物钟由下丘脑视交叉上核中的中央时钟控制[17]，外周时钟存在于几乎所有组织器官中并在健康状态下与主时钟保持同步。视交叉上核接受从视神经传来的光信号刺激，经整合后通过神经、内分泌系统同步全身的外周生物钟节律[18]。在分子水平上，昼夜节律是基于转录/翻译负反馈环完成，该环由互锁的转录激活因子(Bmal1和Clock)和阻遏物(CRY和PER)组成[19]。有学者对正常和骨关节炎人膝软骨的RNA-seq进行研究，发现了骨关节炎中失调最明显的通路是昼夜节律(CR)通路受到抑制[20]。而形成异二聚体的Clock和Bmal1驱动目标基因的转录，包括编码其自身阻遏物时期(PER1，PER2，PER3)以及CRY1和CRY2基因，而PER和CRY二聚化并抑制Clock和Bmal1[21]。这些时钟基因及其蛋白质产物在反馈回路中发挥作用，从而导致近24 h的循环[22]。研究发现，软骨的昼夜节律基因在调节软骨的稳态中起着重要作用，昼夜节律的紊乱可能会损害组织稳态，增加膝骨关节炎的易感性[23]。在膝骨关节炎的发病过程中，昼夜节律调节蛋白整体发生下调，可能通过改变转化生长因子β信号通路加重软骨损伤[24]；另一项研究发现将昼夜节律基因Bmal1敲除则可能通过中断HIF1α/VEGF信号通路加快膝骨关节炎的进展[25]。由此可见，软骨昼夜节律稳态改变可能是骨关节炎发病的重要机制。作者的前期研究已经证实：温针灸能够调节膝骨关节炎软骨生物钟蛋白的表达，改善膝骨关节炎的软骨损伤[26]，但其具体机制还不明确。
瞬时受体电位通道(transient receptor potential channel，TRP)是细胞膜上的一类阳离子通道，能够介导Ca2+内流[27]。TRPV4作为TRP家族的成员之一，除了维持细胞内Ca2+平衡等生理过程外[28]，还可以被温热性刺激、低渗性、化学物刺激及机械刺激等活化，由于其与其他TRP家族的成员相比具有对机械刺激敏感的特点，TRPV4常被认为是机械痛觉过敏发生机制中的重要分子[29]。研究证实滑膜组织中存在TRPV4表达，并且该通道的功能表达可以被肿瘤坏死因子α增强，而在大鼠背根神经节中TRPV4通道的开放又可以介导核因子κB(NF-κB)通路的激活，因此TRPV4的表达失调可能与膝骨关节炎的炎症损伤与痛觉过敏密切相关[30]。
以往研究发现，针灸可以通过调节下丘脑生物钟基因的表达，改善失眠[31-32]；也可以调节结肠平滑肌时钟基因的表达，调节结肠收缩功能，这些数据证明了针灸对中央和外周时钟都具有较好的调节作用，但针灸能否对膝骨关节炎滑膜组织的外周时钟进行调节，目前还不明确。此次实验重点检测了滑膜组织Clock、Bmal1蛋白的相对表达，发现与对照组比较，模型组Clock、Bmal1表达量减少，而经过针灸治疗后，Clock、Bmal1表达量有所升高，证实了针灸对滑膜生物钟蛋白的调控作用。有研究发现生物钟蛋白的表达受到机械刺激和核心温度的影响[33]，而TRPV4参与膝骨关节炎的发病并且对温度、机械刺激敏感，并且有学者研究发现，TRPV4的表达可能受到Clock基因的调控[34]，因此作者猜想TRPV4通道的表达可能与针刺结合艾灸对滑膜生物钟分子的调控作用有关，并进一步检测了滑膜组织中TRPV4的表达。而此次研究结果也证实，模型组中TRPV4表达量增多，而经过针灸治疗后TRPV4表达水平显著降低，与Clock的蛋白表达呈负相关。
作者之前的研究重点在于观察昼夜节律蛋白对软骨的作用，尚未探讨针灸是否能够调节滑膜组织中的昼夜节律蛋白的变化，而膝骨关节炎中滑膜组织的变化也越来越受到广泛关注。此次实验以针灸对膝骨关节炎滑膜组织外周时钟的作用为切入点展开研究，发现针灸干预能提高骨关节炎模型滑膜Clock及Bmal1蛋白表达，促进滑膜向生理状态恢复，因此，作者认为针刺结合艾灸可能通过局部的温热刺激以及机械刺激，下调滑膜TRPV4通道的表达，同步中央外周时钟节律，从而起到抗炎和减轻痛觉过敏的作用，这可能是其抗膝骨关节炎的新机制。
此次研究结果表明，温针灸可以降低机械刺激敏感性通道TRPV4的表达，影响昼夜节律基因的表达并发挥减轻炎症发展、缓解疼痛的作用。但是实验也存在一定的不足，由于未使用转基因鼠也未使用拮抗剂，TRPV4通道是否是针灸调控生物钟蛋白的核心靶点尚不明确，该实验只能说明两者有关联，但缺少细胞实验以进一步证实两者之间的关系，因此TRPV4与生物钟基因的具体关系在后续的实验中还需进一步研究。而且现在研究认为，除了机械刺激和核心温度以外，光刺激、运动、进食时间等都是影响外周时钟节律的因素[35-37]，而针灸是否能够通过其他方式调节时钟也有待研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

针刺结合艾灸调节骨关节炎模型大鼠滑膜昼夜节律蛋白的表达

Acupuncture combined with moxibustion regulates the expression of circadian clock protein in the synovium of rats with osteoarthritis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张皓博, 赵宇楠, 杨学军. 细胞焦亡在椎间盘退变中的作用及治疗意义[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1445-1451.
[2]	何俊君, 黄泽灵, 洪振强. 阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 694-699.
[3]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[4]	王世辉, 程杨, 朱赟洁, 程少丹, 毛剑莹. 弧刃针刀治疗冻结肩模型兔炎症因子及组织形态的反应[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 706-711.
[5]	关鸿, 张宏博, 邵焱, 郭栋, 张海严, 蔡道章. PDZ结构域蛋白1缺失促进骨关节炎软骨细胞衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 182-189.
[6]	李安安, 姜涛, 詹敏, 蔡宇宁, 宋敏, 李聪聪, 林文政, 张家媛, 刘文刚. 参苓白术散治疗膝骨关节炎作用机制的网络药理学和分子对接技术分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 197-204.
[7]	胡益华, 阳春华, 卢圆圆, 孙德毅. 电针联合雷公藤红素干预膝骨关节炎模型小鼠滑膜和滑膜液中转化生长因子β的表达变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(14): 2252-2258.
[8]	李婧瑜, 苏盈盈, 白丁. 骨关节炎早期模型小鼠软骨下骨的形态学特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1692-1698.
[9]	黎永华, 冯强, 谭仁霆, 黄世福, 邱金龙, 尹恒. 杜仲活性成分抗膝骨关节炎滑膜炎病变分子机制的网络药理学阐述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 765-771.
[10]	张逸芸, 王自强, 任颖, 杜福崇, 杜博, 李学敏. 改性柑橘果胶对软骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5465-5472.
[11]	邹昆, 郭万首, 邓雅文, 张启栋, 刘沛, 王卫国. 从生物信息与网络药理角度认识姜黄素治疗膝骨关节炎的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5132-5140.
[12]	罗臻, 李宏栩, 卢启贵, 余瑾, 余翔, 李飞龙, 柴生颋. 红姜提取物保护早期膝骨关节炎模型大鼠的关节软骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5155-5161.
[13]	白富裕, 王孟琦, 薛锋, 李振瑞, 闫清皓, 张智意, 王峰. 针灸治疗女性压力性尿失禁：随机对照研究特点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5197-5203.
[14]	李虹竹, 袁思, 赵家莹, 陆丽明, 许能贵. 针灸联合独活寄生汤治疗类风湿性关节炎的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(32): 5232-5239.
[15]	林晓东, 刘文刚, 许学猛, 刘欣, 卢超, 宋敏, 李聪聪. 单髁置换优于开式胫骨高位截骨：力学参数及膝关节功能的差异[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(30): 4793-4798.