甲基丙烯酸钠修饰光交联海藻酸盐水凝胶支架的制备和表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2276

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (22): 3445-3451.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2276

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甲基丙烯酸钠修饰光交联海藻酸盐水凝胶支架的制备和表征

赵德路^1，2，铁朝荣¹，杨偲偲¹，孙珍²，王新¹，朱怀安³，尹苗¹

¹武汉大学中南医院口腔医学中心，湖北省武汉市 430071；²安徽医科大学合肥口腔临床学院•合肥市口腔医院修复科，安徽省合肥市 230001；³华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院口腔科，湖北省武汉市 430014

收稿日期:2019-10-21 修回日期:2019-10-26 接受日期:2019-11-25 出版日期:2020-08-08 发布日期:2020-04-26
通讯作者: 尹苗，博士，主治医师，武汉大学中南医院，湖北省武汉市 430071
作者简介:赵德路，1992年生，安徽省六安市人，硕士，医师，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年科学基金项目(81500899)

Preparation and characterization of sodium methacrylate modified photocrosslinked alginate hydrogel scaffold

Zhao Delu^{1, 2}, Tie Chaorong¹, Yang Sisi¹, Sun Zhen², Wang Xin¹, Zhu Huaian³, Yin Miao¹

¹Center of Stomatology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China; ²Department of Prosthodontics, Hefei Stomatological Clinic Hospital, Anhui Medical University & Hefei Stomatological Hospital, Hefei 230001, Anhui Province, China; ³Department of Stomatology, Affiliated Wuhan Children’s Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430014, Hubei Province, China

Received:2019-10-21 Revised:2019-10-26 Accepted:2019-11-25 Online:2020-08-08 Published:2020-04-26
Contact: Yin Miao, MD, Attending physician, Center of Stomatology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China
About author:Zhao Delu, Master, Attending physician, Center of Stomatology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China; Department of Prosthodontics, Hefei Stomatological Clinic Hospital, Anhui Medical University & Hefei Stomatological Hospital, Hefei 230001, Anhui Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Youth Program), No. 81500899

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

甲基丙烯酸钠：是一种具有双功能的化学基团的有机小分子，一端含有2-甲基丙烯酰基，该基团具有良好的化学活性，可与化合物中的多种基团反应而修饰化合物；另一个功能集团就是拥有负电荷基团，能给修饰过的化合物材料表面带来稳定的负电荷。

光引发剂：又称光敏剂，是一类能在紫外光区(250-420 nm)或可见光区(400-800 nm)吸收一定波长的能量，产生自由基、阳离子等，从而引发单体聚合交联固化的化合物。引发剂分子在紫外光区(250-400 nm)或可见光区(400-800 nm)有一定吸光能力，在直接或间接吸收光能后，引发剂分子从基态跃迁到激发单线态，经系间窜跃至激发三线态；在激发单线态或三线态经历单分子或双分子化学作用后，产生能够引发单体聚合的活性碎片，这些活性碎片可以是自由基、阳离子、阴离子等。按照引发机制不同，光引发剂可分为自由基聚合光引发剂与阳离子光引发剂，其中以自由基聚合光引发剂应用最为广泛。

背景：光交联海藻酸盐水凝胶因具有良好的生物相容性、可微创注射等优势已为热门的组织工程研究材料，但是仍然存在强度不足、细胞黏附能力不足等问题。

目的：构建载负电荷的光交联海藻酸盐水凝胶材料，探索其物理性能和细胞黏附性能变化。

方法：利用海藻酸钠和2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐制备甲基丙烯酸酯化海藻酸盐后，再与光引发剂和不同浓度甲基丙烯酸钠(0，20，40，60 mmol/L)混合制备载负电荷光交联海藻酸盐水凝胶，利用傅里叶红外光谱仪分析水凝胶的功能基团变化情况，扫面电镜观察水凝胶的表面形态，并测量其溶胀率。将MC3T3-E1细胞与各组水凝胶共培养48 h，采用活死染色与CCK-8法分析水凝胶的细胞毒性；接种MC3T3-E1细胞于4组水凝胶表面，在第4小时活死染色观察细胞早期黏附情况，第3天活死染色观察细胞伸展情况。

结果与结论：①傅里叶红外光谱分析显示，甲基丙烯酸钠的引入可在水凝胶红外波普波数1 600 cm^-1左右处出现来自甲基丙烯酸钠的新波峰；②扫描电镜显示随着甲基丙烯酸钠浓度的增加，光交联海藻酸盐水凝胶的致密度增加，孔径减小；③溶胀率测试显示随着甲基丙烯酸钠浓度的升高，光交联海藻酸盐水凝胶的溶胀率逐渐降低；④活死染色显示4种水凝胶表面的细胞生长状态良好，细胞活性均在95%以上；CCK-8检测显示，载负电荷的光交联海藻酸盐水凝胶材料无细胞毒性；⑤随着甲基丙烯酸钠引入量的增加，载负电荷光交联海藻酸盐水凝胶表面的早期细胞黏附率逐渐增加，细胞伸展状态明显改善；⑥结果表明，甲基丙烯酸钠修饰的引入调节了光交联海藻酸盐水凝胶物理性能，并明显提高了其细胞黏附性能。

ORCID: 0000-0002-1054-6002(赵德路)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 海藻酸钠, 骨组织工程, 甲基丙烯酸钠, 负电荷, 细胞黏附, 光交联, 生物材料, 支架材料

Abstract:

BACKGROUND: Photocrosslinked alginate hydrogel has been a popular bone tissue engineering material because of its excellent biocompatibility and minimally invasive injection, but there are still problems such as insufficient strength and poor cell adhesion.

OBJECTIVE: To construct the negatively charged hydrogels by introducing sodium methacrylate into photocrosslinked alginate hydrogels, and to explore the changes in its physical performance and cell adhesion.

METHODS: After preparation of methacrylated alginate by reacting sodium alginate with 2-aminoethyl methacrylate, methacrylated alginate, photoinitiator and sodium methacrylate (0, 20, 40, 60 mmol/L) were homogeneously mixed. The negatively charged photocrosslinked alginate hydrogels were prepared under ultraviolet light. The functional groups of the hydrogels were analyzed by fourier transform infrared spectroscopy. The surface morphology of the hydrogels was observed by scanning electron microscopy and the swelling ratio was measured. MC3T3-E1 cells were cultured with each group of hydrogels for 48 hours, and the cytotoxicity of the hydrogels was investigated by cell counting kit-8 assay. MC3T3-E1 cells were seeded on the surface of each group of hydrogels. The early adhesion of the cells was observed by live/dead staining at the 4^th hour, and cell spreading was observed on the 3^rd day.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Fourier transform infrared spectroscopy demonstrated that the introduction of sodium methacrylate could lead to a new peak at wavenumber of about 1 600 cm^-1in the hydrogel infrared wave, which was from the sodium methacrylate. (2) Scanning electron microscope observed that the density of the negatively charged photocrosslinked alginate hydrogels increased and the pore size of the gels decreased with augment of concentrations of sodium methacrylate. (3) The swelling ratio of the hydrogel decreased with the increase of the concentration of sodium methacrylate. (4) The live/dead staining revealed that the cells grew well on the surface of each hydrogel, and the cell viability reached above 95%. The cell counting kit-8 assay results showed that the negatively charged photocrosslinked alginate hydrogels had no cytotoxicity. (5) The early cell adhesion rate increased gradually and the cell extension became better with the increase of concentration of sodium methacrylate. (6) In summary, the introduction of sodium methacryl into photocrosslinked alginate hydrogels can adjust its physical properties and significantly improve its cell adhesion.

Key words: sodium alginate, bone tissue engineering, sodium methacrylate, negative charge, cell adhesion, photocrosslinking, biomaterial, scaffold material

中图分类号:

赵德路, 铁朝荣, 杨偲偲, 孙珍, 王新, 朱怀安, 尹苗. 甲基丙烯酸钠修饰光交联海藻酸盐水凝胶支架的制备和表征[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(22): 3445-3451.

Zhao Delu, Tie Chaorong, Yang Sisi, Sun Zhen, Wang Xin, Zhu Huaian, Yin Miao. Preparation and characterization of sodium methacrylate modified photocrosslinked alginate hydrogel scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(22): 3445-3451.

图/表（结果） 7

2.1 甲基丙烯酸酯化海藻酸盐双键接枝率结果材料合成以后，经过¹H核磁共振图谱的采集，在经过软件MestRenova分析计算，如图2所示。可计算出双键接枝率为22.32%，基本符合预期要求。

2.2 各组水凝胶傅里叶红外光谱分析结果红外光谱分析结果如图3所示：对比未载电荷的光交联海藻酸盐水凝胶，载负电荷的光交联海藻酸盐水凝胶在波长为1 600 cm^-1左右处出现了一个新的特征峰，即图中的a峰。这个特征峰最可能的来源是SMA中的C=O键，提示SMA可以成功接枝到海藻酸盐水凝胶中。

2.3 各组水凝胶扫描电镜观察结果各组水凝胶在扫描电镜下均呈现为疏松多孔状，但孔径大小略有差别，如图4所示：随着SMA浓度的升高，水凝胶的孔径呈现减小趋势；其中，SMA-0组和SMA-20组结构较为疏松、孔径较大；随着载入负电荷量的提高，水凝胶的结构变得更为致密、孔径明显变小。

2.4 各组水凝胶的溶胀率变化各组水凝胶在溶胀过程中的形态及溶胀率变化见图5所示。

随着时间的推移，各组海藻酸盐水凝胶的形态变化不同，在相同时间点，SMA浓度与海藻酸盐水凝胶尺寸大小呈反比，即SMA浓度越高海藻酸盐水凝胶的尺寸变化越小，见图5A所示。光交联海藻酸盐水凝胶及载负电荷光交联海藻酸盐水凝胶的溶胀率变化见图5B，1周内随着时间的推移，各组海藻酸盐水凝胶的溶胀率逐渐变大；在同一时间点，SMA浓度越高水凝胶的溶胀率越低，第7天时，SMA-0的溶胀率为678.87±43.87，明显大于SMA-60的溶胀率171.53±6.49(P < 0.05)。

2.5 各组水凝胶细胞毒性检测结果各组Live/Dead荧光染色结果见图6A所示：各组中MC3T3-E1细胞生长状态均良好，保持较高的细胞活性，细胞存活率>95%。CCK-8实验结果见图6B所示：各组之间吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)。由此认为载负电荷光交联海藻酸盐水凝胶材料无明显的细胞毒性。

2.6 各组水凝胶表面细胞黏附能力情况细胞早期黏附情况见图7A：细胞接种4 h后，SMA-0组仅有少量MC3T3-E1细胞黏附；随着SMA浓度的升高，光交联海藻酸盐水凝胶表面的细胞黏附数量呈递增趋势。细胞的早期黏附率经统计见图7B所示：随着SMA浓度的升高，水凝胶表面的细胞早期黏附率升高(P < 0.05)；SMA-0组的细胞黏附率仅为(4.38±0.88)%，SMA-20组、SMA-40组、SMA-60组的细胞早期黏附率依次增加，分别为(16.04±1.75)%，(24.38±2.65)%和(28.85±2.66)%。

细胞接种水凝胶表面培养3 d后，荧光染色观察MC3T3-E1细胞在各组水凝胶上的伸展状态，见图7C：SMA-0组表面的MC3T3-E1细胞多呈圆球形，伸展的细胞罕见；但是随着SMA浓度的增加，载负电荷光交联海藻酸盐水凝胶表面可看到一些椭圆、梭形或多角形的细胞，尤其是SMA-60组细胞伸展明显改善。细胞形状因子统计结果见图7D，与SMA-0组(0.86±0.09)相比，SMA引入后水凝胶上细胞的细胞形状因子呈现减小趋势，SMA-20组、SMA-40组、SMA-60组分别为0.82±0.07，0.79±0.07，0.71±0.08，其中SMA-40和SMA-60与SMA-0组相比明显减小(P < 0.05)。

细胞早期黏附率的增加及形状因子的降低，均表明SMA的引入有利于提高光交联海藻酸盐水凝胶的细胞黏附性能。

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引言

目前口腔颌面部骨缺损治疗是一个口腔医生面临的疑难问题，颌面骨缺损的最常见原因有创伤、肿瘤、炎症及先天发育等，不管是自体骨移植还是异体骨移植均存在多种弊端，而近些年来兴起的骨组织工程为治疗口腔颌面骨缺损开辟了新的方向^[1-2]。

此次实验的对象主体是海藻酸盐，其在医药上已经应用多年了，是公认的无毒材料，海藻酸盐水凝胶也是热点的生物医学工程材料之一。海藻酸盐由于价廉源广、可降解等优点已被广泛用于组织工程研究，海藻酸盐水凝胶展示了优良的生物相溶性和低细胞毒性等，但仍然存在许多的不足，如细胞黏附性差、缺乏成骨诱导等。多肽等有机分子常常被用于提升水凝胶支架的细胞黏附性能^[3-7]，但有研究表明多肽有机分子并不能明显提升细胞在水凝胶表面的黏附，从而不能有效促进细胞分化成骨^[8]。课题组曾利用离子交联方式将具有生物活性的镁离子、锶离子等二价阳离子引入光交联海藻酸盐水凝胶，以改善其黏附性能，结果显示：一定量的二价离子能显著提高细胞在凝胶表面的黏附率，但细胞伸展状态仍不够理想^[9-10]；此外除了镁离子以外，其他二价阳离子与海藻酸盐结合时反应都极为迅速，易导致凝胶内离子分布不均匀。

近年来有学者发现将带电荷的小分子引入支架制备成载电荷材料，可提高支架对蛋白的整体吸附，增强其细胞黏附性能^[11-12]。TAN等^[13-14]将甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵和甲基丙烯酸钠(sodium methacrylate，SMA)分别引入聚乙二醇支架制备载正电荷及负电荷的新型材料，结果显示支架表面的细胞黏附、伸展、增殖及分化均明显改善。通过载电荷对支架进行改性，不仅方法简单且不存在离子交联难以控制及生物因子失活风险等缺陷，是一种有前景的材料生物性能改性方向。作者前期利用正电荷分子修饰光交联海藻酸盐水凝胶也取得了较理想的效果，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的引入明显促进了MC3T3-E1细胞在凝胶表面的黏附及伸展^[15]。而负电荷修饰对光交联海藻酸盐水凝胶支架生物性能的影响国内外尚未见文献报道。基于此，拟将SMA与海藻酸盐通过光交联方式引入到光交联海藻酸盐水凝胶中，研究负电荷修饰对光交联海藻酸水凝胶支架理化性能及其表面细胞黏附的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞材料体外实验。

1.2 时间及地点实验于2017年9月至2018年10月在武汉大学第二临床学院医学科学研究中心、武汉大学口腔生物医学教育部重点实验室完成。

1.3 材料实验主要合成材料见表1。

实验用主要试剂：氯化钠、氯化氢、丙酮和氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司)；2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐、海藻酸钠、SMA(美国Sigma公司)；PBS、α-MEM细胞培养基(HyClone公司)；2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959，美国Sigma公司)；二乙酸荧光素钠、碘化丙锭(美国Sigma公司)；N-羟基-硫代琥珀酰亚胺(上海源叶生物科技有限公司)；2-(N-吗啡啉)乙磺酸(Amresco公司)；1-乙烷基-(二甲基氨丙基)-含碳硝化甘油(上海源叶生物科技有限公司)。

实验用主要仪器：扫描电镜(VEGA3 LMU，TESCAN公司)；傅里叶红外光谱仪(NicoletiS10，Thermo Fisher Scienti公司)；核磁共振仪(Bruker AVANCE Ⅲ，Bruker公司)；精密电子天平(Mettler Toledo公司)；倒置荧光显微镜(IX73，Olympus公司)；多功能酶标分析仪(PE，PerkinElmer公司)；电铸机械测试仪(Bose，Bose公司)；数显加热型磁力搅拌器(MS-H280-Pro，Scilogex公司)；紫外线灯(EA-180/FC，美国Spectroline公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 光交联海藻酸盐水凝胶单体的制备参考课题组前期方法合成甲基丙烯酸酯化海藻酸盐^[9]。简要步骤：在室温、pH=6的条件下，在2-(N-吗啡啉)乙磺酸、N-羟基-硫代琥珀酰亚胺和1-乙烷基-(二甲基氨丙基)-含碳硝化甘油的催化下，海藻酸盐与2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐反应生成甲基丙烯酸酯化海藻酸盐，然后透析3 d；再经5，0.45，0.22 μm孔径滤膜过滤，于-40 ℃下冷冻干燥。最后送样做¹H核磁共振，判断2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐的接枝效率。

1.4.2 载负电荷光交联海藻酸盐水凝胶的制备将甲基丙烯酸酯化海藻酸盐、SMA和光引发剂I2959分别与去离子水混合配制成40 g/L、2 mol/L和5 g/L的溶液。在配制混合前体混合液时，按照一定比例加入各组分，最终使配制的前体液中甲基丙烯酸酯化海藻酸盐和光引发剂I2959的质量浓度分别为20 g/L和1 g/L，而根据分组情况使SMA的浓度分别为0，20，40，60 mmol/L。然后使用96孔板进行水凝胶的合成，每孔加入160 μL的前体液，用长波紫外线灯(波长365 nm，强度1.7 mW/cm²)照射20 min制备水凝胶。具体的前体液的配制方法见表2；反应原理见图1。

1.4.3 水凝胶的傅里叶红外光谱分析将各组水凝胶在冷冻干燥机中冷冻干燥后保存在干燥的器皿内，行红外光谱分析。各组水凝胶的正式红外光谱前需要采集参比背景光谱，即将空白溴化钾片放入红外光谱仪样品仓内，采集背景红外光谱。采集参比背景光谱完成后，用镊子夹取少量材料，放进玛瑙研钵中，加入溴化钾一起研磨细碎，然后使用压片磨具将混合物压成片状。每换一组样品时，用无水乙醇擦拭干净研钵和相关的工具。通过红外光谱仪采集各组水凝胶红外光谱，分析其主要特征官能团及化学键变化情况。

1.4.4 扫描电子显微镜观察水凝胶表面形态将各组水凝胶用去离子水溶胀24 h，清洗3次后，置于-80 ℃冰箱冷冻，然后在-40 ℃、低于20 Pa条件下冷冻干燥，然后将干燥的样品喷金处理，再用扫描电镜在20 kV电压下观察各组水凝胶的表面形态特征并拍照。

1.4.5 水凝胶溶胀测试首先将光交联海藻酸盐水凝胶和载负电荷光交联海藻酸盐水凝胶用去离子水清洗2遍，冷冻干燥后，称质量m₁。然后将干燥的各组水凝胶分别置于每孔含有4 mL去离子水的6孔板中，置于37 ℃恒温箱中溶胀并定期测定其溶胀率。在设定的时间点(1，3，5，7 d)将各组水凝胶分别取出来，称质量m₂。各组水凝胶的溶胀率计算公式如下：溶胀率=m₂/m₁(n=3)。并拍照记录1周内的水凝胶溶胀形态大小变化。

1.4.6 水凝胶的细胞毒性测试

Live/Dead染色：使用96孔板制备出各组水凝胶，然后用细胞培养液清洗2次，转移至12孔板中，再接种MC3T3-E1细胞(ATCC-CRL-2593，购自北纳生物)，细胞接种密度为1×10⁵/孔。培养48 h后，移除各组水凝胶和培养基，用PBS清洗2遍，然后Live/Dead双染试剂染色，置于荧光倒置显微镜下观察细胞的活性(n=3)。Live/Dead双染试剂由二乙酸荧光素和碘化丙锭组成，二乙酸荧光素可进入活细胞胞质，降解发出强绿色荧光；碘化丙锭可进入死细胞胞核，发出红色荧光。在荧光倒置显微镜下随机选择区域进行拍照，然后再将活细胞图(绿色荧光)和死细胞图(红色荧光)合并在一起，观察细胞活性状态。

CCK-8检测：使用CCK-8试剂对细胞的活性做定量检测。在MC3T3-E1细胞与各组水凝胶培养48 h后，移除胶体和培养液，加入新鲜培养基并加入CCK-8试剂，使培养基内的CCK-8含量为10%，置于37 ℃温箱中避光孵育90 min。然后将反应液转移到96孔板，每孔转移100 μL，用酶标仪检测波长为450 nm时各孔的吸光度值(n=3)。

1.4.7 细胞在水凝胶材料上的黏附与伸展检测为了探索SMA的引入对光交联海藻酸盐水凝胶细胞黏附性能的影响，实验拟将MC3T3-E1细胞接种在水凝胶表面，检测细胞在其表面的早期黏附率和伸展状况。具体方法参考前期研究^[9]：MC3T3-E1细胞在各组水凝胶表面培养4 h和3 d时，用Live/Dead染色观察细胞在水凝胶表面的状态并拍照；然后在每张图片中随机选取相对孤立的10个细胞，用Image Pro Plus 6.0分析，每组测算细胞数为60个。

1.5 主要观察指标 ①傅里叶红外光谱分析各组水凝胶的化学键和功能基团变化情况；②扫描电镜观察各组水凝胶的表面形态；③各组水凝胶的溶胀情况；④各组水凝胶材料的细胞毒性测试；⑤各组水凝胶表面的早期细胞黏附率和细胞伸展情况。

1.6 统计学分析定量数据均采用SPSS 26.0统计软件进行分析，首先对定量数据进行正态和方差齐性检验，如果条件符合则用单因素方差分析；否则使用非参数检验。所有结果均用x(_)±s形式表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

大量研究表明支架的黏附性能可直接影响种子细胞的生物学行为^[16-18]。实验尝试将一定量的负电荷接入到光交联海藻酸盐水凝胶的主链上以改善支架的黏附性能，红外光谱分析结果显示不同量的SMA能在光交联过程中接枝到支架上。

扫描电镜和溶胀测试发现随着电荷载入量的增加，水凝胶支架的孔径减小，结构更加致密，溶胀率显著降低。水凝胶的孔径大小和溶胀率受高分子材料分子质量和结构、交联剂浓度及交联度等多种因素的影响^[19]。实验中SMA含有的碳碳双键与甲基丙烯酸酯化海藻酸盐的碳碳双键均可发生加聚反应，在紫外灯照射下光引发剂会催化它们之间的加聚反应，从而得到分子质量更大的聚合产物，进而影响水凝胶的溶胀率。此外，SMA含有甲基疏水基团，引入到水凝胶中会调节水凝胶材料表面的亲疏水性而使亲水性降低，使得水分子更难进入到水凝胶中，降低光交联海藻酸盐水凝胶的溶胀率。而溶胀率的改变可直接导致支架孔径和结构的变化。

细胞毒性实验表明，将一定量的SMA引入光交联海藻酸盐水凝胶中没有明显的细胞毒性，细胞生长状态良好，证明了载负电荷光交联海藻酸盐水凝胶的生物相容性良好。在细胞的黏附伸展检测中，载负电荷光交联海藻酸盐水凝胶支架表面的细胞早期黏附和伸展均有明显改善；随着SMA的浓度提高，细胞早期黏附逐渐增加，细胞的伸展更好。目前，材料与细胞黏附的作用机制被广泛认可的是“支架-蛋白介质层-细胞”模式，没有蛋白介质层细胞很难黏附到支架材料上。由此可推测，细胞外基质蛋白能否吸附在材料表面是细胞黏附的关键因素之一^[20-21]。在生理状态下蛋白是一个复杂的多肽结构，存在多种化学键、多种类型氨基酸残基及不同程度氨基质子化或羧基去质子化。这一特点揭示了细胞外基质蛋白虽然整体带有负电荷，但由于细胞外基质蛋白的各个多肽片段所带电荷性质或电量不同，故在生理状态下细胞外基质蛋白所携带的电荷性质也不确定^[22-23]。材料表面的电荷状态可通过调控蛋白吸附而影响细胞的黏附。针对这一特性，许多专家学者进行了相关研究。大量研究证实，正电荷的引入可以显著提高材料的细胞黏附性能^[24-26]。有趣的是，一些研究表明负电荷也可以增加蛋白和细胞的黏附^[27-29]。PERNODE等^[30]和NELEA等^[31]分别用载负电荷的硅片和聚磺化苯乙烯材料表面做纤维结合蛋白的黏附实验，负电荷支架表现出优异的蛋白吸附能力，且明显提升了细胞黏附。监鉴于以上，此次实验中负电荷修饰光交联海藻酸盐水凝胶能改善支架表面的细胞早期黏附和伸展，可能的机制如下：①负电荷的引入直接促进了材料表面的细胞外基质蛋白吸附。负电荷的作用使得水凝胶表面可以吸附更多的细胞外基质蛋白，促使细胞黏附于水凝胶表面^[13-14]，从而使细胞黏附率随着SMA量的增加而增加，同样地细胞的伸展也越来越好。负电荷能够吸附细胞外基质蛋白的机制可能是蛋白是一个复杂的多肽结构，虽然整体带有负电荷，但是局部会有带有正电荷的官能基团，所以对于一些蛋白有吸附能力^[32]，黏附蛋白介质层的存在能促进细胞的黏附伸展。②由于SMA中含有疏水基团甲基，SMA可调节水凝胶的亲疏水性进而调控细胞黏附^[33]。目前研究的主流认为支架材料的亲疏水性可影响细胞的黏附伸展，因为细胞膜表面有亲水性的多糖链，亲水性利于细胞的黏附^[34]；但支架材料的细胞黏附由细胞外基质蛋白介导，疏水性的表面更利于细胞外基质蛋白的吸附，所以支架材料的亲疏水性在两者的平衡点上有个细胞黏附的最大值^[35]。故实验中的疏水甲基的增加可能调节了海藻酸盐水凝胶的亲疏水性，使得更利于细胞的黏附，但具体的机制还需进一步探索。③相对稳定的溶胀率可为细胞在材料的黏附和伸展提供了一个更加稳定的微环境。

综上，实验成功将SMA引入到光交联海藻酸盐水凝胶支架，制备了一种新型且有前景的载负电荷骨组织工程支架，SMA的引入可调整光交联海藻酸盐水凝胶的孔径大小、溶胀率等物理性能，并促进其表面细胞的黏附伸展，但具体的作用机制及负电荷修饰对凝胶表面细胞增殖分化的影响还需要进行深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

甲基丙烯酸钠修饰光交联海藻酸盐水凝胶支架的制备和表征

Preparation and characterization of sodium methacrylate modified photocrosslinked alginate hydrogel scaffold

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