白细胞介素1β联合肝细胞生长因子体外培养骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1831

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (33): 5328-5333.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1831

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白细胞介素1β联合肝细胞生长因子体外培养骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞的分化

潘丽娟，王荣丽

西南医科大学附属医院，四川省泸州市 646000

修回日期:2019-06-17 出版日期:2019-11-28 发布日期:2019-11-28
通讯作者: 王荣丽，教授，西南医科大学附属医院，四川省泸州市 646000
作者简介:潘丽娟，女，1989年生，四川省乐山市人，西南医科大学毕业，硕士，医师，主要从事感染及感染管理方向研究。
基金资助:
四川省卫生厅科研项目(110358)，项目参与人：潘丽娟

Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes under induction by interleukin-1 beta combined with hepatocyte growth factor in vitro

Pan Lijuan, Wang Rongli

Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Revised:2019-06-17 Online:2019-11-28 Published:2019-11-28
Contact: Wang Rongli, Professor, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Pan Lijuan, Master, Physician, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Sichuan Provincial Health Department, No. 110358 (to PLJ [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
白细胞介素1β：在细胞合成及增殖过程中有促进作用，其中白细胞介素1β是白细胞介素1的主要形式。关于白细胞介素1β与肝细胞关系的研究很少。白细胞介素1β主要存在于血液中，能够发挥出与肿瘤坏死因子α类似的生理及代谢作用，并能与肿瘤坏死因子α一起产生协同作用。
肝细胞生长因子：是作为一种能刺激肝细胞增殖的物质而发现的，后来发现肝细胞生长因子还能作用于上皮细胞、造血细胞、血管内皮细胞等多种细胞，是一种可调节多种细胞生长、运动和形态发生的多功能因子。通过旁分泌或自分泌机制，借助上皮间质的相互作用，在胚胎发生、创伤愈合、血管发生、组织器官再生、形态发生和致癌作用等方面发挥重要作用。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞具有多系分化潜能，能够分化为多种细胞谱系，目前认为骨髓间充质干细胞是治疗包括肝衰竭在内的各种终末期肝病最有前景的种子细胞。如何对其进行诱导分化是研究的焦点。
目的：探讨肝细胞生长因子联合白细胞介素1β诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的能力，寻找适宜的诱导分化方法。
方法：将第3代骨髓间充质干细胞分为5组，分别为空白对照组、肝细胞生长因子组、肝细胞生长因子+白细胞介素1β低、中、高质量浓度组，其中肝细胞生长因子质量浓度为20 μg/L，白细胞介素1β质量浓度为5，10，20 μg/L。在倒置显微镜下观察细胞形态学变化，采用免疫组化方法于诱导第7，14，21天检测细胞角蛋白18和白蛋白的表达。
结果与结论：①空白对照组细胞无形态学改变，其他4组细胞形态由梭形、棱形逐渐向多角形、类圆形发展，与肝细胞相似；②空白对照组始终未见白蛋白和细胞角蛋白18表达，其他4组均有白蛋白、细胞角蛋白18阳性表达，随着诱导时间延长逐渐增加(P均< 0.05)；同一时间点随着白细胞介素1β质量浓度的增加白蛋白及细胞角蛋白18表达增加(P均< 0.05)；③白细胞介素1β联合肝细胞生长因子的诱导效果强于单一肝细胞生长因子。在0-20 μg/L范围内，随着白细胞介素1β质量浓度增加，诱导能力加强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1026-562X(潘丽娟)

关键词: 肝衰竭, 骨髓间充质干细胞, 白细胞介素1β, 肝细胞生长因子, 诱导分化, 肝细胞

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have multi-lineage differentiation potential and can differentiate into a variety of cell lineages. It is currently considered that bone marrow mesenchymal stem cells are the most promising seed cells for the treatment of various end-stage liver diseases including liver failure. How to induce cell differentiation is the focus of research.
OBJECTIVE: To explore the ability of hepatocyte growth factor combined with interleukin-1β to induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into hepatocytes, and to find a suitable induction method.
METHODS: Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells were divided into control group, hepatocyte growth factor group, and low-, middle- and high-dose combined induction group (20 μg/L hepatocyte growth factor+5, 10, 20 μg/L interleukin-1β respectively). Morphological changes of the cells in each group were observed under inverted microscope. Immunohistochemical methods were used to detect expression of cytokeratin 18 and albumin at 7, 14, and 21 days of induction.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no morphological change in the control group, whereas in the other four groups, the cells gradually developed from fusiform and prismatic to polygonal and round, similar to the morphology of hepatocytes. No cytokeratin 18 and albumin expression was observed in the control group, while cytokeratin 18 and albumin positively expressed in the other four groups, and the expression levels were gradually increased with the extension of induction time (P < 0.05). At each time point, the expression of albumin and CK18 upregulated with the increase of interleukin-1β concentration (P < 0.05). Therefore, combined use of hepatocyte growth factor and interleukin-1β has better induction effect than hepatocyte growth factor used alone. Moreover, the induction ability of the combined use is strengthened with the increase of interleukin 1β concentration between 0-20 μg/L.

Key words: liver failure, bone marrow mesenchymal stem cells, interleukin 1β, hepatocyte growth factor, induced differentiation, hepatocytes

中图分类号:

潘丽娟，王荣丽. 白细胞介素1β联合肝细胞生长因子体外培养骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(33): 5328-5333.

Pan Lijuan, Wang Rongli. Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes under induction by interleukin-1 beta combined with hepatocyte growth factor in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(33): 5328-5333.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞的原代、传代培养及鉴定结果 刚接种时细胞呈圆形，4 h可贴壁，1 d后可见大量透明且不规则的贴壁细胞，杂质细胞多。24 h首次换液后杂质细胞较前减少，三四天可见较多集落形成。刚开始时细胞呈梭形，中央可见细胞核。1周后可见细胞密集呈漩涡状生长，10 d左右细胞呈成纤维细胞样生长。待细胞融合至80%-90%时将细胞按1∶2比例传代接种于新的培养瓶中。待传至第3代后将较为纯化的骨髓间充质干细胞用于诱导培养肝细胞样细胞。传代后杂质细胞减少，细胞生长速度增快，3-5 d即可传代1次，传代后细胞形态见图1。

2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定结果 第3代骨髓间充质干细胞用于流式细胞检测，CD29、CD90为阳性，造血系干细胞表面标记CD45为阴性，见图2。

2.3 诱导分化后细胞形态 空白对照组细胞形态未发生改变，呈长梭形。加入肝细胞生长因子和不同质量浓度白细胞介素1β后，倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化。随着时间的延长，骨髓间充质干细胞分裂增殖停止，而且细胞发生形态学改变，在第6天至第7天时，细胞逐渐由双极成纤维细胞形态转变为上皮样细胞形态，随后细胞质进一步收缩，最终变为圆形且有双细胞核的细胞。第21天时细胞形态以类圆形为主，细胞呈肝细胞样，见图3。

2.4 免疫组化染色检测细胞中白蛋白表达 空白对照组白蛋白始终表达阴性，未见阳性着色。加入细胞因子各组细胞白蛋白表达均为阳性，证明能够诱导分化为肝细胞样细胞，见图4，并且随着诱导时间延长白蛋白表达呈增加趋势(P均< 0.05)；随着白细胞介素1β质量浓度的增加白蛋白表达增加(P均< 0.05)，见表2。

2.5 免疫组化染色检测细胞中细胞角蛋白18表达 空白对照组细胞角蛋白18始终表达阴性，未见阳性着色。加入细胞因子各组细胞角蛋白18表达均为阳性，胞浆出现棕黄色颗粒，证明能够诱导分化为肝细胞样细胞，见图5，并且随着诱导时间延长细胞角蛋白18表达呈增加趋势(P均< 0.05)；随着白细胞介素1β质量浓度的增加细胞角蛋白18表达增加(P均<0.05)，见表3。

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引言

肝衰竭患者由于肝细胞受到广泛且严重损害而导致肝脏合成及代谢功能受损而出现一系列临床综合征^[1]。目前肝衰竭有内科治疗、人工肝治疗及肝移植3种方式。人工肝不具备肝脏合成及代谢功能，因此只能作为肝移植前期的过渡治疗，并且不能降低患者总病死率。肝移植是治疗肝衰竭最彻底有效的方法，但是仍存在供肝来源不足、手术费用昂贵、术后可能出现并发症、长期甚至终身服用免疫抑制剂及术后可能存在肝炎复发及加重等限制。研究表明，抑制肝细胞凋亡、刺激肝细胞再生是肝衰竭临床治疗重点^[2]。

干细胞移植是近几年研究的热点，其自我更新及复制能力得到临床界的认可^[3]，它能替代死亡组织器官细胞，对于损伤的肝细胞有修复作用，并且不会损伤周围正常组织器官，无不良反应。因此，选择足量且具有生物活性的种子细胞成为干细胞移植的热点^[4-6]。间充质干细胞是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于骨髓、脐带、脂肪、肝、外周血、胎盘组织等，以骨髓组织中含量最丰富。目前骨髓间充质干细胞成为治疗包括肝衰竭在内的各种终末期肝病的最有前景的种子细胞^[7-11]。骨髓间充质干细胞具有多系分化潜能，能够分化为多种细胞，包括中胚层细胞谱系，例如肝细胞、脂肪细胞、成骨细胞等；外胚层细胞谱系，例如神经细胞；内胚层细胞谱系，例如心肌细胞、胰腺细胞等^[12]，如何对其进行诱导分化是研究的焦点。谢树才等^[13]总结了近几年骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化常用的诱导方案，包括添加特定的细胞因子、提供特殊的细胞外微环境、细胞基因修饰、中药诱导及其他诱导方法。不同分化条件(细胞密度、培养条件、生长因子等)对骨髓间充质干细胞分化有不同影响，最适宜的诱导因子及剂量、诱导环境都有待进一步研究。

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞等刺激分泌的一类具有生物学活性的小分子蛋白质。目前文献报道多种细胞因子被用于诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞转化^[14]，包括肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、成纤维生长因子等。白细胞介素对骨髓间充质干细胞影响的研究很少。白细胞介素1在细胞合成及增殖过程中有促进作用，其中白细胞介素1β是白细胞介素1主要形式，对肝细胞有保护作用^[15]。该实验拟将不同质量浓度白细胞介素1β联合肝细胞生长因子与单纯肝细胞生长因子诱导效果进行比较，为进一步寻找骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞诱导分化的适宜方法打下基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2015年10月在西南医科大学附属医院中心实验室完成。

1.3 材料 健康雄性SD大鼠6只，4周龄，体质量80-100 g，由西南医科大学动物房提供，在SPF级环境下饲养，合格证号为：SCXK(川)2013-181。DMEM低糖培养基(美国Gibco公司)；优质胎牛血清(杭州四季青公司)；肝细胞生长因子(北京神州义翘公司)；兔抗大鼠CD45、CD90、CD90抗体(美国BioLegend公司)；白细胞介素1β(Peprotech公司)；小鼠抗大鼠细胞角蛋白18、白蛋白单克隆抗体(武汉博士德公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞分离培养及传代 颈椎脱臼法处死SD大鼠，无菌下获得股骨及胫骨，反复冲洗骨髓腔，吹打成单细胞悬液，吸入离心管内，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用PBS重悬细胞。将细胞悬液缓慢加入预先装有等体积淋巴细胞分离液的离心管中，使细胞悬液位于淋巴液上层，2 000 r/min离心15-25 min，离心后溶液分4层，吸取中间白雾状的单个核细胞层，PBS洗3次，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM低糖培养基重悬，1 000 r/min离心5 min，弃上清，移入25 cm²培养瓶，置37 ℃、体积分数为5%CO₂恒温培养箱中培养，24 h后弃去培养液，PBS冲洗两三次去除未贴壁细胞，以后每3 d半量换液1次，待细胞达80%-90%融合时进行传代，选取生长良好的第3代细胞进行后续实验。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的鉴定 将第3代骨髓间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA按1∶1混合消化，PBS洗涤3次，制成单细胞悬液(含细胞1.5×10⁶个)，转移至流式细胞管中，每管20 μL，依次加入单克隆抗体CD29、CD45、CD90，同时设立阴性对照组；室温下避光孵育30 min，PBS洗涤3次；各组试管中分别加入PE标记二抗IgG(1∶40)混匀；4 ℃下避光孵育30 min；PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1.5×10⁹ L^-1；上机，每次计数10 000个细胞；根据光强度确定CD29、CD45、CD90表达量。

1.4.3 骨髓间充质干细胞的诱导分化及形态观察 取第3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁵/孔接种于预先置有细胞爬片的6孔板中，待细胞贴壁后，次日分别加入不同细胞因子和体积分数为10%胎牛血清进行持续诱导分化，具体分组见表1。待细胞爬片长满约90%时，换液，继续加入含细胞因子的L-DMEM培养基2 mL，每三四天换液1次，显微镜下观察细胞形态变化，分别于第7，14，21天收集细胞爬片，用于免疫组化染色。

1.4.4 免疫组化染色检测细胞中白蛋白及CK18表达 采用免疫细胞化学SABC法。将细胞爬片用40 g/L多聚甲醛固定30 min；置于空气中干燥5 min；PBS清洗爬片3次，每次2 min；0.5%Triton X-100(DPBS配)孵育1次20 min；PBS清洗标本3次，每次2 min；体积分数为3%H₂O₂孵育15 min，消除内源性过氧化物活性；DPBS清洗标本3次，每次2 min；血清封闭液封闭20 min；加入一抗[小鼠抗白蛋白(1∶200稀释)、小鼠抗细胞角蛋白18(1∶200稀释)]37 ℃孵育1 h；PBS冲洗3次，每次5 min；加入二抗工作液37 ℃孵育30 min；PBS冲洗3次，每次5 min；加入SABC于37 ℃下孵育30 min；PBS冲洗标本3次，每次5 min；DAB显色(避光，镜下观察至棕色)3-10 min；自来水冲洗终止反应；蒸馏水洗2次，每次1 min；苏木精复染0.5-1.0 min，充分水洗3 min；盐酸乙醇分化片刻，自来水洗至细胞核变蓝；体积分数为75%，85%，95%，100%梯度乙醇脱水各3 min；二甲苯透明2次，每次3 min；中性树脂封固；镜下观察，胞浆出现棕黄色颗粒为染色阳性。每个结果随机选6个高倍镜视野(×200)，计数100个细胞，计数阳性染色细胞所占百分比，取其平均值。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞诱导分化后的形态变化；②免疫组化染色检测细胞中白蛋白及CK18表达。

1.6 统计学分析 采用统计软件SPSS 20.0进行统计描述与分析。计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 法。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

骨髓间充质干细胞的分离纯化及培养方法有很多，但最佳的方法尚未达成共识^[16]。目前常用分离纯化的方法有贴壁分选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。流式细胞仪和免疫磁珠分离法价格昂贵、操作复杂，且容易影响细胞活性，造成细胞损伤，使得实际操作中受到很大的限制。该实验将密度梯度离心法和贴壁方法相结合，不仅得到的骨髓间充质干细胞生物活性高，而且还保留了骨髓中的黏附分子、生长因子及其他细胞成分，又能通过换液去除非贴壁的血细胞和造血细胞，提高细胞纯度^[17]。间充质干细胞是骨髓非造血干细胞，不表达造血细胞标志，如CD34、CD45，仅表达基质细胞和间质细胞受体CD29、CD44、CD90、CD105等^[18-19]。该实验所获得的细胞呈成纤维样，CD90及CD29表达阳性，CD45表达为阴性，而且能诱导分化为肝细胞样细胞，确定为骨髓间充质干细胞。

白细胞介素是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，目前命名的白细胞介素有白细胞介素1-38^[20]。研究证实，促炎因子白细胞介素1、白细胞介素6、γ-干扰素、肿瘤坏死因子α能上调肝细胞生长因子的表达。白细胞介素1具有免疫调节作用，并且对活化APC和T细胞也能产生协同作用，能够促进B细胞增殖及产生大量分泌性抗体，还具有内分泌效应及诱导肝脏急性期蛋白合成。罗显克等^[21]研究证实肿瘤坏死因子α能够诱导骨髓间充质干细胞表达肝细胞生长因子。霍大浪等^[22]研究在骨髓间充质干细胞-肝细胞共培养体系中，骨髓间充质干细胞可能分泌白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素10来促进肝细胞生长，延长肝细胞生存时间。白细胞介素1β是白细胞介素1主要表现形式，目前关于白细胞介素1β与肝细胞关系的研究很少，故实验将白细胞介素1β联合肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞。白细胞介素1β主要存在于血液中，能够发挥出与肿瘤坏死因子α类似的生理及代谢作用，并能与肿瘤坏死因子α一起产生协同作用。因此，作者将白细胞介素1β用于骨髓间充质干细胞体外诱导研究。

白蛋白是成熟肝细胞合成及分泌最多的蛋白质类型，并且随着肝细胞的成熟白蛋白分泌及合成逐渐增加，其他细胞基本不合成及分泌白蛋白，使用免疫组化方法很难检测到^[23]，因此白蛋白是检测肝细胞的常用指标。细胞角蛋白18是肝细胞相对特异性的蛋白，在肝前体细胞中表达很少，随着时间推移，细胞角蛋白18生成会随着肝细胞的成熟而增加。该实验中空白对照组不表达白蛋白及细胞角蛋白18，与陈鹏飞等^[24]实验结果一致。该实验诱导生成的细胞表达白蛋白及细胞角蛋白18，说明骨髓间充质干细胞体外被诱导分化为肝细胞样细胞^[25]。

细胞因子及生长因子在组织和细胞分化中起着重要作用。它在细胞分化中的发生机制仍是研究重点。骨髓微环境能够分泌多种细胞因子，例如肝细胞生长因子、白细胞介素6、白细胞介素11和巨噬细胞集落刺激因子等，最主要的细胞因子是肝细胞生长因子^[26]。近年研究证明，肝细胞生长因子是诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的有效因子之一^[27]。参考陈鹏飞等^[2⁴^]实验，肝细胞生长因子质量浓度在5-100 μg/L有促进肝细胞增殖的作用，在低至1 μg/L时有促进细胞有丝分裂的能力。潘兴南等^[2⁸^]研究表明肝细胞生长因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞以质量浓度≥20 μg/L为宜，故该实验肝细胞生长因子质量浓度采用20 μg/L。将不同质量浓度白细胞介素1β分别联合肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞转化，诱导生成的细胞白蛋白及细胞角蛋白18表达阳性，证明白细胞介素1β联合肝细胞生长因子能诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞。已有大量研究证实骨髓间充质干细胞在适宜条件下能被诱导分化为肝细胞样细胞，但是在骨髓间充质干细胞诱导分化过程中也发现了一些问题。首先，骨髓间充质干细胞诱导生成的肝细胞样细胞在体内有促进肿瘤发生的可能^[²⁹^-3⁰^]；其次，进行骨髓间充质干细胞移植时，所需要的细胞数量以及是否需要体外培养及扩增；最后，骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞到底经历了多少阶段，其详细进程仍不明确；分化为肝细胞样细胞的最佳时机不清楚；细胞扩增方法、移植数量、移植途径，移植后的评价也不一致^[3¹^-3³^]。因此，随着对骨髓间充质干细胞进一步的研究与了解，如何将诱导生成的肝细胞样细胞移植入体内治疗肝衰竭是下一步研究的热点。随着研究不断深入，将逐步解决上述问题，为疾病治疗手段带来新的变化^[3⁴^]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

白细胞介素1β联合肝细胞生长因子体外培养骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞的分化

Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes under induction by interleukin-1 beta combined with hepatocyte growth factor in vitro

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