炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基调控急性辐射损伤小肠炎症反应的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1658

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (13): 1969-1974.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1658

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炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基调控急性辐射损伤小肠炎症反应的作用

郑跃^1，2，马发鑫²，李金亮²，卢铨²，骆昱均²，沙卫红^1，2，陈浩²

¹南方医科大学第二临床医学院，广东省广州市 510280；²广东省人民医院(广东省医学科学院)消化内科，广东省广州市 510080

修回日期:2018-12-22 出版日期:2019-05-08 发布日期:2019-05-08
通讯作者: 沙卫红，教授，博士生导师，主任医师，南方医科大学第二临床医学院，广东省广州市 510280；广东省人民医院(广东省医学科学院)消化内科，广东省广州市 510080；并列通讯作者：陈浩，博士，医师，广东省人民医院(广东省医学科学院)消化内科，广东省广州市 510080
作者简介:郑跃，男，1981年生，汉族，广东省潮州市人，2006年南方医科大学毕业，硕士研究生，主治医师，主要从事胃肠病诊治及干细胞的基础和临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81300279，81741067)，项目负责人：陈浩；广东省自然科学基金(2016A030313815)，项目负责人：沙卫红；广东省自然科学基金(2017A030313464)，项目负责人：陈浩；广东省科技计划项目(2015A020212029)，项目负责人：陈浩；广州市科技计划项目(201707010419)，项目负责人：沙卫红；广州市科技计划项目(201804010050)，项目负责人：陈浩

Conditioned medium derived from bone marrow mesenchymal stem cells with inflammatory activation regulates inflammatory response to acute radiation-induced intestinal injury

Zheng Yue^{1, 2}, Ma Faxin², Li Jinliang², Lu Quan², Luo Yujun², Sha Weihong^{1, 2}, Chen Hao²

¹Second Clinical Medical College of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China;²Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Revised:2018-12-22 Online:2019-05-08 Published:2019-05-08
Contact: Sha Weihong, Professor, Doctoral supervisor, Chief physician, Second Clinical Medical College of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China; Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; Chen Hao, MD, Physician, Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Zheng Yue, Master candidate, Attending physician, Second Clinical Medical College of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China; Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81300279 and 81741067 (both to CH); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2016A030313815 (to SWH) and 2017A030313464 (to CH); the Scientific Research Plan Project of Guangdong Province, No. 2015A020212029 (to CH); the Scientific Research Plan Project of Guangzhou, No. 201707010419 (to SWH) and 201804010050 (to CH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
炎症预激活条件培养基：条件培养基是在静息或应激状态下收集细胞培养过程中的上清液，其内含有细胞以旁分泌或自分泌方式分泌的多种细胞因子、趋化因子以及膜微泡等生物活性分子。近年来研究显示，与炎症预激活间充质干细胞条件培养基相比，正常状态的间充质干细胞条件培养基可能由于缺乏体内激活的程序，常无法发挥其生物学效应。
间充质干细胞的免疫调节作用：间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，还具有免疫调节作用。间充质干细胞的免疫调节作用可能通过免疫系统中的免疫细胞与免疫分子之间，以及免疫系统与神经内分泌系统之间的相互作用，使机体的免疫应答维持合适的水平进而维持内环境的稳定。近年研究发现，间充质干细胞可通过其免疫调节作用调控移植物抗宿主病及自身免疫性疾病等多种疾病的免疫应答状态。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞具有强大的免疫调节和抗炎能力。前期实验发现，炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基可促进急性辐射小肠损伤结构和功能的修复，但其对急性辐射小肠损伤炎症反应的作用机制尚未完全明确。
目的：探讨炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基对急性辐射小肠损伤炎症反应的影响。
方法：随机将80只SD大鼠(中山大学北校区实验中心提供)分为对照组、单纯辐射损伤组、辐射损伤+正常间充质干细胞条件培养基治疗组(IR+MSC-CM^IEC-6(NOR)组)、辐射损伤+辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基治疗组(IR+MSC-CM^IEC-6(IR)组)，每组20只。使用尾静脉联合腹腔给药，辐射后第1，3，5，7天，取小肠组织行苏木精-伊红染色观察小肠组织学变化，取小肠组织及血清采用ELISA检测炎症因子水平，辐射后第3天取小肠肠系膜淋巴结组织用流式细胞仪检测CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞数量百分比。
结果与结论：①与单纯辐射损伤组和正常间充质干细胞条件培养基治疗组相比，辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基组小肠上皮绒毛及隐窝结构明显改善；小肠组织中前炎症因子如白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平显著减少，抗炎因子白细胞介素10水平显著升高；血清中前炎因子Activin A、白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平显著减少，抗炎因子白细胞介素10水平显著升高，以辐射后第3天最为明显；小肠肠系膜淋巴结中CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞数量百分比显著升高，差异均有显著性意义；②上述结果表明，辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基能调控前炎因子和抗炎因子的平衡，增加小肠肠系膜淋巴结中CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞数量，抑制急性辐射小肠损伤全身水平及小肠黏膜的炎症反应，促进小肠黏膜损伤的修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4389-2048(郑跃)

关键词: 放射性肠损伤, 骨髓间充质干细胞, 条件培养基, 细胞治疗, 炎症, 炎症反应, 炎症因子, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) have powerful anti-inflammatory and immunomodulatory properties. Our previous experiments have demonstrated that conditioned medium from bone marrow MSCs with inflammatory activation (MSC-CM^IEC-6(IR)) could improve the structural and functional repair of the small intestine after acute radiation-induced intestinal injury, but its effects on the inflammatory response to acute radiation-induced intestinal injury have not been elucidated.
OBJECTIVE: To investigate the effects of MSC-CM on the inflammatory response to acute radiation-induced intestinal injury.
METHODS: Eighty Sprague-Dawley rats (provided by the experimental center of the North Campus of Sun Yat-Sen University in China) were randomly divided into four groups (n=20/group): control group, irradiation (IR) group, irradiation+MSC-CM^IEC-6(NOR) group (IR+MSC-CM^IEC-6(NOR) group) and irradiation+MSC-CM^IEC-6(IR) group (IR+MSC-CM^IEC-6(IR) group), followed by continuous administration via the tail vein and abdominal cavity. Intestinal tissue and serum samples were collected 1, 3, 5, 7 days after radiation for hematoxylin-eosin staining and analysis of the concentrations of inflammatory factors usingELISA. Mesenteric lymph nodes were collected 3 days after radiation for analysis of the percentage of CD4⁺Foxp3⁺Treg cells using flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the IR group and IR+MSC-CM^IEC-6(NOR) group, the intestinal structure (small intestine epithelial villi and crypt) was significantly improved and the pro-inflammatory factors such as interleukin-1β, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in the small intestine were significantly decreased in the IR+MSC-CM^IEC-6(IR) group, whereas the level of anti-inflammatory factor interleukin-10 was significantly increased. Similarly, the levels of pro-inflammatory factors such as Activin A, interleukin-1β, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in the serum samples were significantly decreased and the level of anti-inflammatory factor IL-10 was significantly increased. The levels of inflammatory factors changed most significantly at 3 days after irradiation. The number of CD4⁺Foxp3⁺Treg cells in mesenteric lymph nodes in the IR+MSC-CM^IEC-6(IR) group was significantly higher than that in the control group and IR+MSC-CM^IEC-6(NOR) group. These results suggest that MSC-CM^IEC-6(IR) can regulate the balance of pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors, and increase the number of CD4⁺Foxp3⁺ Treg cells in mesenteric lymph nodes, thus inhibiting the inflammatory response at systemic and mucosal levels in acute radiation-induced intestinal injury and promoting the repair of small intestinal mucosal injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Culture Media, Conditioned, Radioactivity, Intestine, Small, Inflammation, Tissue Engineering

中图分类号:

郑跃，马发鑫，李金亮，卢铨，骆昱均，沙卫红，陈浩. 炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基调控急性辐射损伤小肠炎症反应的作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 1969-1974.

Zheng Yue, Ma Faxin, Li Jinliang, Lu Quan, Luo Yujun, Sha Weihong, Chen Hao. Conditioned medium derived from bone marrow mesenchymal stem cells with inflammatory activation regulates inflammatory response to acute radiation-induced intestinal injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(13): 1969-1974.

图/表（结果） 3

2.1 各组大鼠一般状况比较 单纯辐射损伤组及辐射损伤+正常间充质干细胞条件培养基治疗组大鼠第2，3天进食量及活动量开始减少，并出现间歇性或持续性排黏液血便，在第4天单纯辐射损伤组有1只大鼠死亡；而输注辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基后，大鼠进食量及活动量改变不明显，出现一过性排稀便，随后逐渐减少直至恢复。与辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基治疗组比较，单纯辐射损伤组及辐射损伤+正常间充质干细胞条件培养基治疗组大鼠第5天的体质量明显下降，见表1。

2.2 各组大鼠小肠病理改变 由于第3天各组差异最显著，该文章重点选择第3天结果进行表述。辐射后第3天苏木精-伊红染色显示单纯辐射损伤组及正常间充质干细胞条件培养基治疗组小肠上皮细胞出现不同程度变性、坏死和脱落，绒毛缩短，隐窝变浅或消失，而辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基治疗组小肠上皮的绒毛及隐窝结构未见明显病理改变，见图1。

2.3 各组大鼠小肠组织中炎症因子水平 与单纯辐射损伤组及正常间充质干细胞条件培养基治疗组相比，输注辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基后，小肠组织中前炎症因子如白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α显著减少；抗炎因子白细胞介素10显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2A。

2.4 各组大鼠血清中炎症因子水平与单纯辐射损伤组及正常间充质干细胞条件培养基治疗组相比，输注辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基后，血清样本中同样观察到前炎因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α显著减少；抗炎因子白细胞介素10显著升高，而激活素A呈现明显下降的趋势，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2B；虽然能观察到转化生长因子β1有上升趋势，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 各组大鼠小肠淋巴结中CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞数量与单纯辐射损伤组及正常间充质干细胞条件培养基治疗组相比，输注辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基后，损伤小肠肠系膜淋巴结中CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞数量显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2C。

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引言

急性辐射小肠损伤(radiation-induced intestinal injury，RIII)常见于腹腔、盆腔恶性肿瘤放射治疗患者，高达90%-95%的患者可发生不同程度的急性辐射小肠损伤，临床上可出现频繁呕吐、腹泻及便血等症状，重症患者可出现脓毒血症、贫血、消瘦等表现，严重影响患者生存质量及放射治疗的进一步应用^[1-2]。目前尚缺乏有效的治疗手段，亟需深入探讨急性辐射小肠损伤的发病机制以寻找更有效的治疗方法。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类在特定条件下具有多向分化潜能的干细胞，间充质干细胞移植在再生医学领域已被广泛应用，其修复组织损伤的作用在肾、肺、肝脏及小肠损伤等诸多研究中得到了证实^[3-4]。多项研究发现，间充质干细胞具有强大的免疫调节和抗炎能力，可调控炎症性肠病、移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮等疾病的炎症反应状态^[5-8]。近年研究显示，急性辐射小肠损伤时核因子κB等转录因子的激活可上调多种前炎因子包括白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的活性，参与肠道黏膜损伤及炎症反应^[9]，提示前炎因子在炎症损伤过程中发挥重要作用。目前不同状态的间充质干细胞条件培养基(conditioned medium derived from mesenchymal stem cells，MSC-CM)对急性辐射小肠损伤炎症反应的作用和机制尚未完全明确，该研究旨在探讨炎症激活前后不同状态间充质干细胞条件培养基对急性辐射小肠损伤炎症反应调控作用的差异及其机制，为探索新的治疗手段提供理论基础和实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 动物体内实验。

1.2 时间及地点 2016年10月至2018年6月期间，在广东省人民医院中心实验室、中山大学实验动物中心及南方医科大学实验动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雌性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，6-8周龄，平均体质量约250 g，SPF级，用于建立急性辐射小肠损伤模型；雌性SD幼鼠，三四周龄，体质量60-80 g，SPF级，用于获取骨髓间充质干细胞，均由中山大学北校区实验中心提供，所有动物经检疫符合实验动物标准，实验方法符合医学伦理学要求。

1.3.2 细胞株 大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6，购于American Type Culture Collection (ATCC)，辐射损伤的IEC-6用于诱导激活骨髓间充质干细胞。

1.3.3 实验试剂与材料 DMEM-F12培养基(美国Hycolne公司)；胎牛血清(美国Hycolne公司)；TrypLE^Express胰酶代替物(美国Invirogen公司)；小鼠抗大鼠CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC单克隆抗体(美国Biolegend公司)；ELISA试剂盒(美国R&D公司)；CD4和Foxp3单克隆抗体(美国eBiosciences公司)，5 ku离心超滤管(Millipore公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定 参照课题组既往文献的实验方法^[10]，经原代分离、培养、传代后使用流式细胞仪对细胞表型CD29、CD34、CD44、CD45进行鉴定。

1.4.2 间充质干细胞条件培养基的制备 参照课题组既往文献的实验方法^[10]，分别制备辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^IEC-6(IR))及正常间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^IEC-6(NOR))，于-20 ℃冰箱储存备用。

1.4.3 辐射损伤模型建立及分组 使用PRIMUS直线加速器一次性照射(速率300 cGy/min，总辐射剂量14.0 Gy)建立辐射损伤模型。根据辐射后处理方式不同，随机将80只SD大鼠分为4组，每组20只，分别为对照组、单纯辐射损伤组、辐射损伤+正常间充质干细胞条件培养基治疗组(IR+MSC-CM^IEC-6(NOR)组)、辐射损伤+辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基治疗组(IR+MSC-CM^IEC-6(IR)组)。

1.4.4 给药方式 参照课题组既往文献报道的给药方式^[10]。动物造模成功后，于4 h内经尾静脉注射联合植入式胶囊渗透压泵的方式注入DMEM-F12培养基、正常间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^IEC-6(NOR))及辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^IEC-6(IR))。每只大鼠每天尾静脉一次性注射200 μL，连续注射3 d，胶囊泵内含2 mL浓缩条件培养基，植入腹腔后以10 μL/h的速率匀速释放。

1.4.5 标本留取 各组分别于辐射损伤后第1，3，5，7天时处死大鼠取材，每个时间点各5只，开腹观察小肠大体标本，距回盲部10-15 cm取出小肠约2 cm，PBS冲洗肠腔，40 g/L多聚甲醛固定，苏木精-伊红染色，光镜下观察小肠病理改变；同时收集距回盲部5 cm的回肠组织约50 mg用于ELISA检测。所有动物均于处死前经眼眶后静脉丛取血，每只取全血1.0-1.5 mL置于含有抗凝剂的试管，轻轻晃动后室温静置30 min，1 000×g离心15 min后留取血清标本用于ELISA检测。在辐射后第3天收集各组大鼠肠系膜淋巴结标本用于流式细胞分选。

1.4.6 ELISA检测血清和小肠组织中前炎因子和抗炎因子水平 辐射后第1，3，5，7天，收集各组大鼠血清和小肠组织样本。动物处死后收集的小肠组织样本即刻加入4 mL组织匀浆缓冲液冰浴下用5 mL玻璃匀浆器匀浆，4 000 r/min低温离心后取上清液密封存放于-80 ℃保存。①加样：分别设置空白孔、标准孔及待测样品孔。加样品稀释液100 μL至空白孔，余孔分别加标准品或待测样品100 μL，并轻轻晃动混匀，酶标板加上盖后于37 ℃反应120 min；②弃去液体，甩干。每孔加检测溶液A工作液100 μL，酶标板加上覆膜后于37 ℃反应60 min；③弃去孔内液体，甩干后洗板3次，每次浸泡一两分钟，大约400 μL/孔，再次甩干；④每孔加检测溶液B工作液100 μL，酶标板加上覆膜于37 ℃反应60 min；⑤温育60 min后弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡一两分钟，350 μL/孔，再次甩干；⑥依序每孔加底物溶液90 μL，酶标板加上覆膜后于37 ℃避光显色(30 min内，此时大体观察可见标准品的前3孔或4孔有明显的梯度蓝色，而后3孔或4孔梯度不明显，即可终止)；⑦依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色；⑧用酶联仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度值，在加终止液后立即进行检测。

1.4.7 流式细胞分选检测小肠肠系膜淋巴结中CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞数量变化 辐射后第3天，收集各组大鼠肠系膜淋巴结标本。动物处死后立即剖腹收集各组大鼠的肠系膜淋巴结，随后将其切成碎块组织，置于37 ℃含Ⅷ型胶原酶的RMPI培养基中孵育50 min，搅拌后收集含细胞的上清液进行清洗并重悬于RMPI完全培养基，重悬的细胞用丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA) (50 μg/L)和离子霉素(750 μg/L)孵育4 h，用CD4和Foxp3单克隆抗体标记细胞进行流式细胞分选检测。

1.5 主要观察指标 ①大鼠进食量、活动量、排便情况及体质量变化；②小肠上皮绒毛及隐窝结构变化；③小肠组织中前炎因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和抗炎因子白细胞介素10水平变化；④血清中前炎因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、激活素A和抗炎因子白细胞介素10、转化生长因子β1水平变化；⑤小肠肠系膜淋巴结中CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞数量变化。

1.6 统计学分析 计量资料以x(_)±s表示，采用SPSS 19.0统计软件，各组数据符合正态分布时，组间比较用单因素方差分析与t 检验，非正态分布时用非参数秩和检验，计数资料以百分率表示，率的比较采用χ²检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

3.1 炎症预激活对间充质干细胞条件培养基调控急性辐射小肠损伤炎症反应的重要作用 间充质干细胞的免疫调节和抗炎能力在克罗恩病、移植物抗宿主反应和脊髓损伤众多模型中已经得到证实^[11-13]；然而，间充质干细胞的这种免疫调节和抗炎能力并非天然存在，需要在一定的条件下诱导产生。既往有研究报道，在结肠炎发生前输注间充质干细胞，由于缺乏体内激活程序，无法激活间充质干细胞，导致间充质干细胞免疫活性不足，无法改善结肠炎损伤^[14]。目前研究证实，间充质干细胞的免疫调节效应需要炎症因子如肿瘤坏死因子α、干扰素γ、Toll样受体配体等参与，通过改变炎症环境调节间充质干细胞介导的免疫抑制作用。新近研究显示，Toll样受体3预处理以及干扰素γ过表达均可显著增强间充质干细胞对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎的疗效^[15-16]。同样有研究证实，间充质干细胞在低氧或炎症环境中，Toll样受体的表达增高，可增加间充质干细胞对炎症环境的敏感性，促使间充质干细胞向抗炎方向分化^[17-18]；相反，在缺乏炎症因子的环境中(如低水平的肿瘤坏死因子α、干扰素γ)，间充质干细胞向促炎方向分化，并且可通过分泌炎症因子将淋巴细胞招募到炎症部位，促进炎症的发展^[4^，^19]。在此次实验中，利用非接触式Transwell系统构建小肠辐射损伤炎症环境，模拟间充质干细胞在辐射损伤大鼠体内的激活过程，结果显示，与单纯辐射损伤组及正常间充质干细胞条件培养基治疗组相比，输注辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基后小肠组织中前炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α显著减少，抗炎因子白细胞介素10显著升高；与之相似，输注辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基后血清样本中同样观察到白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α释放减少以及白细胞介素10显著增加。激活素A作为一种反映系统性炎症严重程度的指标，其水平与炎症程度显著相关，此实验中也观察到输注辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基后血清中激活素A明显下降。上述结果提示辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基可调控小肠局部及系统炎症因子表达，抑制小肠炎症反应，而正常状态的间充质干细胞条件培养基对炎症因子的调控作用并不明显。因此，不同状态的间充质干细胞条件培养基对调节小肠炎症反应的作用有明显差异，表明炎症预激活对间充质干细胞条件培养基调控炎症反应具有重要的作用。

3.2 炎症预激活间充质干细胞条件培养基调控急性辐射小肠损伤炎症反应的作用机制 间充质干细胞具有强大的免疫调节和抗炎能力，可通过本身对炎症环境的应答发挥其抗炎作用。Liu等^[20]研究发现，损伤组织可激活间充质干细胞的TSG-6基因，通过分泌TSG-6蛋白促进组织损伤修复。研究证实，激活不同的Toll样受体能使间充质干细胞分化为具有促炎功能的间充质干细胞1或具有抗炎功能的间充质干细胞2，而激活Toll样受体3能够诱导出间充质干细胞2并促进吲哚胺2，3-双加氧酶、前列腺素E2和白细胞介素10等抗炎因子的分泌，抑制炎症反应的发生发展^[18]。此外，间充质干细胞还可通过分泌免疫抑制因子和生长因子如白细胞介素6、转化生长因子β等调控炎症反应，维持组织稳态。作者前期实验也发现，缺氧诱导间充质干细胞条件培养基中的白细胞介素10水平明显升高，可抑制辐射损伤IEC-6细胞的炎症反应，促进对辐射损伤IEC-6细胞的修复作用^[21]。上述研究表明间充质干细胞可通过自身分泌免疫抑制因子或抗炎因子直接参与炎症反应过程，调控前炎因子/抗炎因子的平衡，这可能是炎症预激活间充质干细胞条件培养基调控急性辐射小肠损伤炎症反应的作用机制之一。

与此同时，间充质干细胞可通过调节宿主免疫细胞如T淋巴细胞、巨噬细胞等间接参与免疫调节及炎症过程，促进组织损伤的修复。间充质干细胞可通过分泌转化生长因子β、前列腺素E2、白细胞介素6等免疫调节因子抑制T细胞增殖、分化，募集Tregs细胞，并诱导促炎性的M1型巨噬细胞向具有免疫调节作用的M2型巨噬细胞转化，下调白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和IP10等炎症因子分泌，同时促进抗炎因子白细胞介素10的表达^[6^，^22-23]。近年研究显示，CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞可通过与效应免疫细胞的直接接触以及分泌白细胞介素10、白细胞介素35及转化生长因子β等抗炎细胞因子进而发挥其免疫调节功能，而在炎症性肠病患者体内伴有CD4⁺Foxp3⁺Treg数量下降，提示CD4⁺Foxp3⁺Treg的数量在免疫调节及炎症过程中可能具有重要作用^[24]。该实验中，通过细胞内染色和流式细胞分析观察到输注辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基后小肠的肠系膜淋巴结中CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞数量显著升高，表明辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基可促进小肠肠系膜淋巴结中T淋巴细胞向CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞的转化，上调CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞的比例，调控急性辐射小肠损伤的炎症反应。实验结果表明，炎症预激活间充质干细胞条件培养基可能通过间充质干细胞分泌免疫抑制因子或抗炎因子直接参与炎症反应过程，还可通过免疫调节因子间接作用于宿主免疫细胞共同参与对急性辐射小肠损伤炎症反应的调控。

综上，炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基可调控急性辐射小肠损伤前炎因子/抗炎因子的平衡，上调局部小肠黏膜CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞的比例，抑制急性辐射小肠损伤全身水平和小肠黏膜局部的炎症反应，促进急性辐射小肠损伤的修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基调控急性辐射损伤小肠炎症反应的作用

Conditioned medium derived from bone marrow mesenchymal stem cells with inflammatory activation regulates inflammatory response to acute radiation-induced intestinal injury

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