缺血性脑卒中治疗中干细胞移植的作用机制及应用价值

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0655

摘要/Abstract

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文题释义：
缺血性脑卒中：是指脑部血液供应障碍所导致的局部脑组织缺血、缺氧性坏死，进而出现相应神经功能缺损的脑血管疾病。局限性脑缺血的病因有：大脑中动脉栓塞，颅外颈内动脉或椎动脉狭窄、闭塞或血栓形成，脑动脉痉挛。弥漫性脑缺血的病因有：心搏骤停、低血压、贫血、低血糖等。
神经干细胞移植：是将神经干细胞移植到宿主体内，使神经干细胞向神经系统病变部位趋行、聚集，并存活、增殖、分化为神经元和/或胶质细胞，从而促进宿主缺失功能的部分恢复的一种技术。近年来，神经干细胞研究成为治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的热点。

摘要
背景：缺血性脑卒中一旦发病形成神经损伤，尚无有效的治疗方法促进神经功能恢复。大量的实验研究证实干细胞移植不仅具有神经功能保护作用，而且具有细胞替换和功能恢复的潜力。
目的：从干细胞的特殊性、干细胞移植治疗缺血性脑卒中可能的机制、可以应用干细胞的类型、移植的时期、位置、剂量以及手术的安全性等几方面进行综述。
方法：第一作者以“stem cells；transplantation；ischemic stroke”为英文关键词，以“干细胞；移植；缺血性脑卒中”为中文关键词，检索2013年1月至2018年2月期间收录在PubMed，中国知网数据库中与干细胞移植治疗缺血性脑卒中相关的文献，文献类型包括临床研究、基础研究及综述类文章，排除与文章研究目的无关及重复性的文献，最终纳入55篇文献进行综述。
结果与结论：①随着科学技术及医学的发展，更多类型的干细胞被发掘，但由于存在细胞来源、分离纯化及安全性等问题，目前对于间充质干细胞移植治疗缺血性脑卒中的研究应用最为广泛；②在选择移植时机、途径及剂量时，在缺血损伤24-72 h，经静脉移植8×10⁵-8×10⁶细胞量在基础或临床研究中多次被应用，这为以后的研究提供思路，但是否为最佳方法需要进一步验证；③干细胞移植治疗缺血性脑卒中具有广阔的应用前景，干细胞的价值一再被证实，无疑为将来脑缺血的治疗提供了一条新的途径；④同时，这一治疗方法在应用于临床前面临许多挑战，仍有较多的难题亟待解决。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5313-051X(张栋林)

关键词: 干细胞, 移植, 神经传导, 胚胎干细胞, 畸胎瘤, 神经营养因子, 立体定向植入, 缺血性脑卒中

Abstract:

BACKGROUND: Once a nerve injury is developed after the onset of ischemic stroke, there is no effective treatment to promote the recovery of nerve function. A large number of experimental studies have proved that stem cell transplantation not only has neuroprotective effects, but also has the potential of cell replacement and functional recovery.
OBJECTIVE: To review the specificity of stem cells, the possible mechanisms of stem cell transplantation for the treatment of ischemic stroke, the viable types of stem cells, the time, location and dose of stem cell transplantation, and the safety of surgery.
METHODS: Using the keywords of “stem cells; transplantation; ischemic stroke” in English and Chinese, respectively, the first author retrieved relevant articles about stem cell transplantation in the treatment of ischemic stroke published from January 2013 to February 2018 in PubMed and CNKI databases. The literature types included clinical research, basic research and review articles. After removal of the articles that were not related to the purpose of the study or repetitive, 55 articles were finally analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: With the development of technology and medicine, more types of stem cells have been discovered. However, due to the problems of cell origin, isolation and purification, and safety, mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of ischemic stroke is the most widely used and studied. When selecting the timing, route, and dose of transplantation, 8×10⁵ to 8×10⁶ cells that are transplanted intravenously at 24 to 72 hours after ischemic injury have been widely used in basic or clinical experiments, which provide ideas for future research. However, whether it is the best method requires further experimental verification. Stem cell transplantation has broad application prospects in the treatment of ischemic stroke, and the value of stem cells has been repeatedly confirmed, which undoubtedly provides a new approach for the treatment of cerebral ischemia. However, this treatment method will encounter many challenges and there are still a lot of problems that need to be solved before it is used in clinical practice.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Transplantation, Stroke, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张栋林，李丹，王敏娟. 缺血性脑卒中治疗中干细胞移植的作用机制及应用价值[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5393-5398.

Zhang Dong-lin, Li Dan, Wang Min-juan. Mechanism and application of stem cell transplantation in the treatment of ischemic stroke[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5393-5398.

图/表（结果） 1

2.1 干细胞的特殊性 干细胞是一类具有多向分化和自我更新潜能的细胞。在适当的条件下，其可以分化成各种功能细胞，如神经元和少突胶质细胞。这使得干细胞基础及转化医学相关研究成为当前国际上最受关注的领域之一，随着干细胞技术的不断发展，干细胞应用于越来越多疾病的治疗，包括中枢神经系统疾病、心肌损伤、骨关节炎、糖尿病、肝脏疾病、肿瘤等^[6]。缺血性脑卒中发病后对于不同种(系)的神经细胞都有影响，这种复杂和广泛的神经元-胶质细胞-内皮细胞相互作用并影响，这就要求用于治疗缺血性脑卒中损伤的移植细胞需要具有干细胞的特性，即分化潜能，可在特定的条件下分化、增殖为成熟的体细胞，如神经细胞、胶质细胞、内皮细胞等。因此，细胞移植只能利用干细胞作为主要的移植细胞治疗缺血性脑卒中。

2.2 干细胞移植治疗缺血性脑卒中可能的机制 干细胞移植治疗缺血性脑卒中可能的作用机制：①细胞替代：移植的干细胞进入脑组织结构中，代替损伤的神经元，促进神经传导通路和连接结构的重建；来源于骨髓的骨髓间充质干细胞可分泌碱性成纤维细胞生长因子、胎盘生长因子、血管内皮生长因子等多种细胞因子，可诱导大脑缺血边界区形成新的血管^[7-11]；②神经保护和营养：移植的干细胞可分泌神经营养分子、酶、细胞因子等；如脑源性神经营养因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子、胶质细胞源性神经营养因子、肝细胞生长因子、表皮生长因子、干细胞因子等，这些因子在脑损伤的保护和促进已损伤神经功能的恢复中起着重要的作用^[12-13]。以脑源性神经营养因子为例，脑源性神经营养因子可与其具有高亲和力的酪氨酸激酶受体B蛋白结合启动膜受体酪氨酸蛋白激酶信号传导途径和磷脂酶C信号传导途径等细胞内信号传导途径，发挥促进神经再生和保护作用^[14]。在大鼠实验中证实干细胞分泌的神经营养因子可增强神经细胞发生，并减少卒中大鼠模型脑中的小胶质细胞/巨噬细胞浸润，促进卒中后功能恢复^[15]。此外，Jablonska等^[16]将人脐血衍生神经干细胞移植入缺血性卒中大鼠模型中的研究证实缺血事件可促进内源性神经再生，这可能是通过激活内源性干细胞从而促进内源性神经发生，促进脑损伤区域的内源性神经营养因子表达增加；③炎症和免疫调节：移植的干细胞可以通过抑制炎症局部T淋巴细胞和巨噬细胞的分化阶段发挥免疫调节减轻炎症反应，M1型巨噬细胞或小胶质细胞可分泌破坏性的炎性介导因子，而M2型巨噬细胞或小胶质细胞则能够分泌营养因子对组织起到保护作用，还可以清除损伤的细胞或细胞碎片可促进预后恢复^[17-18]。而干细胞可通过分泌因子作用于巨噬细胞，使其由M1型转变为M2型，影响免疫分泌的细胞因子图谱，从而抑制和极化胶质细胞^[19-20]。

2.3 可以应用的干细胞类别 治疗缺血性脑卒中的干细胞中可分为内源性和外源性2种类型。前者是应用自身的干细胞，包括神经干细胞和造血干细胞。内源性神经干细胞存在于人类和其他哺乳动物中枢神经系统中，主要分布在海马、脉络从和室管膜下区，在缺血缺氧的条件下内源性神经干细胞细胞可发生增殖、迁移，并向神经元细胞和胶质细胞等分化，进而修复中枢神经系统^[21-22]，造血干细胞则是通过粒细胞集落刺激因子发挥作用，但由于条件不足且数量有限没有能形成足够的细胞来完全修复缺血损伤区^[23-24]。

可用于移植的外源性干细胞主要有胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞^[8]。胚胎干细胞具有干细胞所有的特性，具有在适当的环境、条件下转换为任何神经细胞的潜能，是最理想的移植细胞，但是由于其来源存在伦理及法律问题且存在保存及移植后的安全问题^[25-26]。虽然胚胎干细胞移植在缺血性脑卒中动物模型研究中表现出理想的效果，但要应用于人类治疗还受到多方面限制^[27-28]。

外源性成体干细胞包括神经干细胞和间充质干细胞，外源性神经干细胞一般取自胚胎或流产的胎儿，Huang等^[29]在动物实验中证实神经干细胞治疗效果显著，但是由于来源受限，不能实现同体移植，且后续存在排斥反应及移植细胞不纯等问题，目前难以应用于临床。间充质干细胞属于成体干细胞中的一大类，其研究最多、使用最广，可来源于人体多处组织、器官中^[30]。根据来源不同可分为骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脐带间充质干细胞以及脂肪间充质干细胞等^[31]。间充质干细胞的优势在于来源广泛易获取、保存、自体移植不存在免疫排斥反应，且同样具有分化为神经元和神经胶质细胞等的能力。已经开始应用于临床试验，Honmou等^[32]应用自体人间充质干细胞进行移植，首次评估了干细胞治疗缺血性脑卒中的可行性与安全性，在其后5年的随访中虽然患者的神经功能恢复的不理想，但并没有发现不良反应。Honmou等^[33]在其另一试验中经静脉注射自体骨髓间充质干细胞，对12例缺血性脑损伤患者进行试验，在移植后一周患者的NIHSS评分持续改善，MRI显示梗死体积减小，且无不良反应。

诱导多能干细胞最早是由Kazutoshi Takahashi和Shinya Yamanaka报道，由于其可以来源于任何体细胞，所以被认为是过去的十余年中干细胞领域中最令人兴奋的突破之一^[34]。诱导多能干细胞与胚胎干细胞功能十分相似，可以分化为机体任何类型的细胞，目前限制诱导多能干细胞应用于临床的唯一问题就是其可形成畸胎瘤，如果这一问题得以解决，那么诱导多能干细胞在细胞移植方面拥有巨大潜力^[35-36]。除了上述几种干细胞外，目前在研究的可应用于移植治疗缺血性脑卒中的细胞还包括人畸胎瘤衍生的细胞、源自人类第3磨牙的成人牙髓干细胞、内皮祖细胞等^[37-38]。见表1。

2.4 移植的时机 目前，最佳治疗时间还需要进一步研究。许多研究结果显示缺血后72 h进行细胞移植治疗可促进肢体功能的恢复。动物研究表明，缺血性脑卒中发生24，72 h移植可改善大鼠脑缺血后的神经功能，但影响不显著，而7 d后移植则无明显改善^[39]。然而另一些研究人员认为在亚急性期，移植细胞存活率最高，移植效果最佳，可能与神经毒性物质减少、神经营养因子释放和血管生成有关；而急性期的炎症环境和慢性期的胶质瘢痕则不利于移植细胞的进入和生存^[40-43]。

2.5 移植的位置-途径 目前已有研究证实，移植的位置与移植细胞的种类以及途径相关，其中移植途径起决定性作用。不同部位的脑组织有利于不同类型干细胞的存活和增殖。因此，根据植入细胞的不同，所选择的植入部位也应不同^[44]。从理论上讲，将干细胞通过静脉或动脉途径移植到血液供应丰富的区域将有助于干细胞的迁移^[45-46]。然而，丰富的血液流动会削弱局部干细胞的浓度。一些研究将大量的干细胞通过立体定向植入缺血区域中心可减少干细胞损失且直接作用于病灶及其周围，但由于损伤区域生理平衡被破坏，局部促炎细胞因子等调节因子的作用，使得移植细胞的存活率降低、分化被抑制^[47-48]。在急性期，将移植细胞直接移植到大脑皮层，有助于挽救缺血半暗带，促进神经功能的恢复，但在神经核损伤模型中不宜使用此种方法移植^[49]。为避免损伤部位的炎症反应对植入细胞的影响，一些观点认为应选择离损伤部位远或者血管分布少的区域，将干细胞通过腰椎穿刺或者侧脑室穿刺植入，甚至是立体定向移植到损伤区对侧脑半球，这可能有利于植入细胞的分化和增殖，但缺点是缺血及炎症不利于植入细胞的扩散，最终导致损伤区域细胞浓度不够^[50-52]。

2.6 移植的剂量 王亮等^[53]在不同数量神经干细胞移植治疗脑梗死的实验中，分别将6×10⁵，8×10⁵，10×10⁵数量的神经干细胞通过立体定向、微量泵注射法植入大鼠脑梗死模型中。在移植3个月后观察发现移植组比对照组大鼠行为评分均明显升高，其中8×10⁵数量组升高最明显，其余2组则无明显差异。在临床试验中Kim等^[54]所使用的间充质干细胞剂量为每人1×10⁶/kg细胞数，通过静脉通路进行移植，相当于大鼠实验中每只大鼠1×10⁵-3×10⁶剂量。结合以上研究，关于移植干细胞数量方面，在缺血性脑卒中动物实验模型中移植数量达约8×10⁵(在人体约1×10⁶/kg的移植数量)时可有效改善神经功能缺损症状，促进神经功能恢复。但由于目前试验数据较少，更为准确的治疗剂量还需要验证。

2.7 手术安全性 手术安全问题主要和移植的方式和细胞类型相关。干细胞经静脉途径移植可能阻塞肺静脉，经动脉途径移植可引起脑血管阻塞，诱发癫痫等，而无论经腰椎穿刺还是经颅立体定向到缺血损伤区、大脑皮质、侧脑室或损伤对侧大脑皮质都有出血感染的风险^[45-46]。移植后的主要风险：肿瘤。经颅途径可导致脑肿瘤形成。而通过静脉途径，移植的细胞可被带到身体的所有器官或组织，可能导致多器官肿瘤。如诱导多能干细胞，限制其应用的最大问题是其可诱导肿瘤的形成，有研究显示诱导多能干细胞经颅内注射治疗出现形成畸胎瘤的概率比较高(在短暂性大脑中动脉阻塞大鼠模型中，将诱导多能干细胞移植到同侧纹状体和皮质，发现移植28 d后在大脑中有畸胎瘤的形成)^[36]。但目前为止通过硬膜下移植还没有发现出现肿瘤形成。此外因干细胞来源有限，很难实现自体干细胞移植，因此带来后续的免疫排斥等不良反应和细胞不纯带来的生物安全隐患也不容忽视。

2.8 目前存在的问题 自人类首次成功获得干细胞至今，围绕着干细胞的相关研究一直在争议与希望之间发展，虽然正朝着期待的方向积极前进，但到目前为止仍存在诸多问题。首先，绝大多数研究限于动物实验，移植后的动物模型所发生的生物学改变不能完全反映植入细胞在人体内会如何发生变化，且模拟的动物模型单一，不能全面体现不同病患的情况。而现有临床试验虽然取得了一定成果，但大多是短期观察，尚缺乏长期的、全面观察的研究数据。以间充质干细胞为例，在目前干细胞移植治疗缺血性脑卒中研究领域中间充质干细胞研究、使用最为广泛，在大量动物实验中其疗效得到肯定，但在临床试验中疗效并不十分确切，且因病例数少，观察时间短从而很难得出满意的结论^[55]。

其次，干细胞移植治疗缺血性脑卒中的机制仍不十分明确，除了细胞替代、神经保护和营养、炎症和免疫调节等共同机制外，不同类型的干细胞移植治疗缺血性脑卒中其机制是否不同，有待进一步探索。干细胞移植治疗缺血性卒中在临床中被广泛应用之前，安全问题是其首要问题。再者如何进行移植细胞的提纯、如何预防肿瘤的形成，如何防止移植后的排斥反应都是需要解决的棘手问题。

此外还有干细胞选择的问题，根据不同的干细胞类别的比较，可以知道目前常用的干细胞都存在一定的局限性。在法律、道德以及宗教的约束下，一些具有良好应用前景的干细胞(如胚胎干细胞)来源受到了限制；外源性神经干细胞因免疫排斥和分离不纯等问题，限制其在临床中的应用；具有可为患者提供与自身匹配的个性化医疗潜能的诱导多能干细胞，不仅绕开了使用胚胎干细胞引发的伦理道德问题同时还可以降低免疫排斥及细胞不纯所致风险，但是诱导多能干细胞却存在致瘤的问题；间充质干细胞目前看来似乎是最理想的移植细胞，但要将其应用于临床治疗前需进行大量随机对照设计的、大样本量的临床试验进行广泛而深入的研究。

最后对于移植方式及部位的选择，迄今为止所有的移植方法均有一定的局限性，在探索合适的移植部位以及寻找最安全有效的方式，还有很多工作要做。移植时机与移植数量方面目前仍存在争议，还需进一步研究。

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