脂肪间充质干细胞向睾丸间质细胞的诱导分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0465

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1364-1369.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0465

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脂肪间充质干细胞向睾丸间质细胞的诱导分化

符津山，梁培育，欧善际

海南医学院第一附属医院泌尿外科，海南省海口市 570102

修回日期:2017-10-20 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 梁培育，博士，主任医师，海南医学院第一附属医院泌尿外科，海南省海口市 570102
作者简介:符津山，男，1981年生，海南省琼海市人，汉族，主治医师，主要从事泌尿外科方面的研究。
基金资助:
海南省自然科学基金项目(812190)

Induced differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells into Leydig cells

Fu Jin-shan, Liang Pei-yu, Ou Shan-ji

Department of Urology, First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China

Revised:2017-10-20 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Liang Pei-yu, M.D., Chief physician, Department of Urology, First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China
About author:Fu Jin-shan, Attending physician, Department of Urology, First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hainan Province, No. 812190

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
睾丸间质细胞：成群分布在曲精小管之间，胞体呈圆形、椭圆形或不规则形，胞体较大，直径约20 μm，胞质呈嗜酸性，细胞核呈圆形或卵圆形，常位于中央，染色较淡，有1个或2个核仁，线粒体多，呈管嵴状，无分泌颗粒。从青春期开始，睾丸间质细胞受垂体前叶嗜碱性细胞分泌的间质细胞刺激素(黄体生成素)的作用，能合成分泌雄性激素，可促进精子的发生和男性生殖器官发育，以及维持第二性征和性功能。
3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)：是一类依赖于NAD+/NADP+接受质子的氧化还原酶。在胆固醇转化为类固醇激素中起限速酶作用，在体内广泛分布。3β-羟基类固醇脱氢酶催化孕烯醇酮生成孕酮，17α-羟孕烯醇酮转化为17α-羟孕酮，雄烯二醇生成睾酮等多步化学反应。3β-羟基类固醇脱氢酶通过参与细胞内类固醇激素生成，进而在生殖系统中发挥功能。

摘要
背景：近年来干细胞的发展，为治疗雄激素缺乏疾病提供了新的思路。
目的：探讨脂肪间充质干细胞是否可分化为睾丸间质细胞。
方法：取生长状态良好的第3代大鼠脂肪间充质干细胞，分2组培养：实验组加入0.1 mg/L人绒毛膜促性腺激素、10.0 μg/L血小板源性生长因子及10.0 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，进行向睾丸间质细胞的诱导培养；对照组不加入上述细胞生长因子，常规培养。诱导培养1，7，14，21 d，进行相关指标检测。
结果与结论：①免疫荧光染色：对照组无3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)阳性细胞；实验组可见3β-HSD阳性细胞，并且随着诱导时间的延长，3β-HSD阳性细胞逐渐增多，荧光染色增强；②睾酮分泌水平：对照组无睾酮分泌；诱导培养7 d后，实验组检测到睾酮分泌，并且随着诱导时间的延长，睾酮分泌增加；③RT-PCR检测：对照组无黄体生成素受体、类固醇合成急性调节蛋白、3β-HSD阳性条带；实验组诱导培养7 d后，可见黄体生成素受体、类固醇合成急性调节蛋白、3β-HSD阳性条带，并且随着诱导培养时间的延长，阳性条带增强；④结果表明，脂肪间充质干细胞可分化为睾丸间质细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5992-9509(符津山)

关键词: 睾丸间质细胞, 干细胞, 脂肪间充质干细胞, 诱导分化, 睾酮, 免疫荧光染色, 海南省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The recent development of stem cells has provided new ideas for the treatment of androgen-deficient diseases.
OBJECTIVE: To investigate whether adipose-derived mesenchymal stem cells can differentiate into Leydig cells.
METHODS: Passage 3 rat adipose-derived mesenchymal stem cells that grew well were taken and cultured in the medium with (experimental) or without (control) 0.1 mg/L human chorionic gonadotropin, 10.0 μg/L platelet-derived growth factor and 10.0 μg/L basic fibroblast growth factor. Indicator detection was done at 1, 7, 14, 24 days of induced culture.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Immunofluorescence staining results showed that there were no 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) positive cells in the control group, while the number of 3β-HSD positive cells was gradually increased in the experimental group with the induction time, which presented with fluorescence enhancement. (2) There was no secretion of testosterone in the control group, while in the experimental group, testosterone secretion was detected at 7 days of induced culture, and moreover, the testosterone level was increased with the induction time. (3) RT-PCR findings showed no luteinizing hormone receptor, steroidogenic acute regulatory protein, and 3β-HSD positive bands in the control group, while these positive bands appeared in the experimental group after 1 day of induction, and strengthened with the induction time. To conclude, adipose-derived mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into Leydig cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Leydig Cells, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

符津山，梁培育，欧善际. 脂肪间充质干细胞向睾丸间质细胞的诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1364-1369.

Fu Jin-shan, Liang Pei-yu, Ou Shan-ji. Induced differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells into Leydig cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1364-1369.

图/表（结果） 1

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引言

雄激素在维持男性第二性征、生殖功能和肌肉骨骼发育方面具有重要作用。睾丸间质细胞是合成分泌雄性激素的主要细胞，其主要分布在曲精小管之间，胞体呈圆形、椭圆形或不规则形，胞体较大，直径约20 μm，胞质呈嗜酸性，细胞核呈圆形或卵圆形，常位于中央，染色较淡，有1个或2个核仁，线粒体多呈管嵴状，无分泌颗粒^[1-3]。如睾丸发育不良或者睾丸间质细胞数量、质量下降，均可导致雄激素缺乏疾病，引发男性严重的身体及生理发育障碍。传统的治疗方法是外源性的雄激素补充与替代治疗，但是长期的激素用药会引发全身多器官的损伤^[4-5]。近来干细胞的发展，为治疗雄激素缺乏疾病提供了新的思路。

目前已有采用骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞诱导分化为睾丸间质细胞的报道，例如：刘明锴等^[6]将骨髓间充质干细胞分别经尾静脉及睾丸内直接注射途径治疗雄性激素部分性缺乏综合征模型大鼠，结果发现尾静脉及睾丸移植骨髓间充质干细胞对大鼠睾丸组织均有修复作用；邢晓宇等^[7]表明在睾丸间质细胞来源的条件培养液诱导下，人脐带间充质干细胞能够向睾丸间质细胞方向分化。脂肪间充质干细胞来源于脂肪组织，具有多向分化能力。与其他间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞来源广泛，取材方便，分离简单，易于培养，传代培养和冻存过程中性状稳定，其含量和增殖潜能几乎不受患者年龄、性别等影响，不受伦理限制，受到广大学者的关注^[8-10]。

实验以脂肪间充质干细胞为研究对象，观察其向睾丸间质细胞分化的能力，以期为雄激素缺乏疾病提供更好的治疗方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年5至12月在海南医学院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 成年健康雄性SD大鼠5只，体质量200-230 g，购自凯学生物科技(上海)有限公司。

1.3.2 实验用主要试剂 PBS(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；DMEM培养基(美国Sigma公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶(北京百奥莱博科技有限公司)；Stro-1、CD90、CD105、CD34流式抗体(Biolegend 公司，美国)；成骨、成脂细胞诱导培养液(上海赛弗生物科技有限公司)；兔抗- HSD-3β1、FITC-羊抗兔IgG、DAPI染色液、抗荧光衰减封固剂(武汉博士德生物有限公司)；大鼠睾酮ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；人绒毛膜促性腺激素(上海盈公试剂有限公司)；血小板源性生长因子(中科物源生物技术有限公司)；碱性成纤维细胞生长因子(北京双鹭药业股份有限公司)；反转录试剂盒(上海妍琦生物科技有限公司)。

1.3.3 实验用主要仪器 流式细胞仪(苏州药明康德新药开发有限公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；离心机(北京时代北利离心机有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的分离培养 取SD大鼠，使用7%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉，在无菌条件下迅速取出腹股沟处脂肪组织，用含1%青链双抗的D-Hank’s液冲洗3次，剥离脂肪组织上的血管，将脂肪组织剪碎，直到组织变为液体状，加入8-10 mL胰蛋白酶，37 ℃消化90 min。消化完成后，加入等量含血清的DMEM培养基终止消化，过200目筛网去除大块组织，以1 500 r/min离心5 min，去上清液，加入含胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。以2×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种至6孔板，放入37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养。细胞稳定培养24 h后换液，去掉未贴壁的细胞，更换DMEM培养基继续培养。以后每2 d换液1次。大鼠脂肪间充质干细胞培养约24 h即可贴壁生长，细胞呈长梭形，生长速度较慢，换液后细胞增殖明显，出现以长梭形为主的形态，培养5-7 d，70%-80%细胞可融合，即可传代培养。

1.4.2 脂肪间充质干细胞的鉴定

流式细胞仪检测：取生长良好的第3代脂肪间充质干细胞，弃掉原培养液，以胰蛋白酶消化，采用含牛血清白蛋白的PBS清洗，制成细胞悬液，加入Eppendorf管中，每管100 μL(1×10⁶个细胞)，分别加入小鼠抗大鼠STRO-1、CD90、CD105、CD34各20 μL和同型对照流式抗体，4℃避光孵育45 min，PBS漂洗，空白对照用PBS代替，用含牛血清白蛋白的PBS洗涤后，上流式细胞仪检测。

脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化：取生长良好的第3代脂肪间充质干细胞，以1×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种至6孔板，加入成骨细胞诱导培养液(含10 μmol/L地塞米松，50 μmol/L维生素C，10 mmol/L β-磷酸甘油钠，体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基)培养21 d，进行茜素红染色，观察钙结节形成情况。

脂肪间充质干细胞的成脂诱导分化：取生长良好的第3代脂肪间充质干细胞，以1×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种至6孔板，加入成脂细胞诱导培养液(含1 μmol/L地塞米松，200 μmol/L吲哚美辛，0.5 μmol/L IBMX，10 mg/L胰岛素，体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基)培养10 d，进行油红O染色，观察脂滴形成情况。

1.4.3 脂肪间充质干细胞向睾丸间质细胞的诱导分化 取生长状态良好的第3代脂肪间充质干细胞，以1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于6孔板，细胞贴壁达到80%时，分为2组培养，实验组加入0.1 mg/L人绒毛膜促性腺激素、10.0 μg/L血小板源性生长因子及10.0 μg/L碱性成纤维细胞生长因子^[11]，进行诱导培养；对照组细胞不加入上述细胞因子，常规培养，每组4个复孔，每三四天更换诱导培养液。

1.4.4 免疫荧光染色 于诱导1，7，14，21 d，制作细胞爬片，进行3β-HSD抗体免疫荧光染色，每组细胞爬片随机选取5个视野，计数阳性细胞数目及比例。实验重复3次。

1.4.5 睾酮分泌检测 于诱导1，7，14，21 d，收集各组细胞培养上清，严格按照大鼠睾酮ELISA试剂盒检测标准检测睾酮水平。实验重复3次。

1.4.6 RT-PCR检测 于诱导1，7，14，21 d，提取各组细胞总RNA，按反转录试剂盒说明书操作获得cDNA，PCR条件为95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，其产物用2%琼脂糖进行凝胶电泳鉴定。实验重复3次。

1.5 主要观察指标 ①诱导1，7，14，21 d，两组细胞3β-HSD免疫荧光染色阳性表达；②诱导1，7，14，21 d，两组细胞培养上清睾酮水平；③诱导1，7，14，21 d，两组细胞黄体生成素受体、类固醇合成急性调节蛋白、3β-HSD基因表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 12.0 进行统计学分析，实验数据以x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，检验水准为α=0.05。

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讨论

脂肪间充质干细胞具有取材方便、来源丰富、对机体损伤小、增殖迅速、生物学性状稳定、排斥反应小等优点，近年来成为组织工程研究的首选细胞之一，用于骨及软骨的损伤修复、心脑血管组织再生及尿路系统重建等^[12-15]。据文献报道，间充质干细胞移植后可恢复雄激素水平，接收到机体信息的反馈，符合生理要求，可成为治疗雄性激素缺乏疾病的方法^[16-18]。因此实验选择脂肪间充质干细胞为研究对象，观察其是否可分化为睾丸间质细胞，为脂肪间充质干细胞用于治疗雄性激素缺乏疾病提供一定的参考。

实验采用胰蛋白酶消化法分离培养了脂肪间充质干细胞，为鉴定分离培养的细胞是否为间充质干细胞，进行了表面标记物鉴定、成脂及成骨诱导分化鉴定，脂肪间充质干细胞表面CD105、CD90、STRO-1阳性表达，CD34阴性表达，说明分离的细胞为间充质干细胞；成骨诱导培养21 d茜素红染色可见钙结节，成脂诱导培养10 d油红O染色可见红色的脂滴颗粒，说明培养的细胞具有向成脂肪细胞及成骨细胞分化的能力。以上结果证实实验培养的干细胞为间充质干细胞，取第3代细胞进行诱导实验。

目前诱导间充质干细胞向睾丸间质细胞分化的条件不是很明确。血小板源性生长因子为一种碱性蛋白，具有促

进特定细胞趋化与生长的生物活性。研究发现，在出生后11 d小鼠的肾间充质中血小板源性生长因子受体α (PDGFRα)表达尚低，而在体腔上皮及中肾-性腺交界区血小板源性生长因子受体α表达则明显增高；而到12.5 d时，血小板源性生长因子受体α主要高表达于雄性胎儿小鼠睾丸间质细胞内。通过观察血小板源性生长因子受体α的表达，发现血小板源性生长因子信号系统在睾丸间质细胞谱系中对干细胞定型和分化有重要作用。人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)是由α和β亚基组成的大分子糖蛋白，其结构与黄体生成素(又称间质细胞促进素)基本相似，在诱导睾丸间质细胞芳香化并分化成熟，进而合成睾酮的过程中发挥重要作用^[19-21]。以上可以得出，人绒毛膜促性腺激素和血小板源性生长因子在睾丸间质细胞分化成熟过程中有至关重要的作用。因此大多数研究采用人绒毛膜促性腺激素或血小板源性生长因子或两种因子联合的方法诱导间充质干细胞分化为睾丸间质细胞。但是有关碱性成纤维细胞生长因子诱导间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的报道并不多见。碱性成纤维细胞生长因子是一种生物活性很强的促细胞分裂原，通过与细胞膜表面的特异性受体结合，可以促进血管内皮、神经样细胞的分化和增殖，对各种干细胞向成骨、成纤维、成血管内皮细胞方向分化也具有重要的调节作用^[22-25]。近年有实验证明，碱性成纤维细胞生长因子对睾丸间质细胞分化再生有促进作用，可促进未成熟的睾丸间质细胞分化和睾酮分泌^[11]。因此实验选择血小板源性生长因子、人绒毛膜促性腺激素与碱性成纤维细胞生长因子作为诱导培养成分，诱导脂肪间充质干细胞向睾丸间质细胞分化。

3β-HSD为类固醇合成基因，在胎儿出生7-11 d的睾丸间质区可检测到3β-HSD表达，因此可将3β-HSD视为睾丸间质细胞的标志物^[26-27]。睾酮是最重要的男性激素(雄激素)，主要由睾丸分泌，对健康有着重要的影响，包括增强性欲、力量、免疫功能、对抗骨质疏松症等功效^[28-35]。研究中，实验组以血小板源性生长因子、人绒毛膜促性腺激素与碱性成纤维细胞生长因子作为诱导培养成分，诱导脂肪间充质干细胞向睾丸间质细胞分化后，采用免疫荧光染色、睾酮分泌及RT-PCR检测来验证分化结果。免疫荧光染色结果显示，对照组无3β-HSD阳性细胞，实验组可见3β-HSD阳性细胞，并且随着诱导时间的延长，3β-HSD阳性细胞逐渐增多，荧光染色增强，说明实验组经诱导后稳定表达睾丸间质细胞标志物3β-HSD。睾酮检测结果显示，对照组无睾酮分泌；诱导培养7 d后，实验组检测到睾酮分泌，并且随着诱导时间的延长，睾酮分泌增加，说明经诱导培养后的脂肪间充质干细胞具有分泌睾酮的能力。为了更进一步的证明脂肪间充质干细胞是否分化为睾丸间质细胞，实验进行了RP-PCR检测相关基因表达，结果显示，对照组无黄体生成素受体、类固醇合成急性调节蛋白、3β-HSD阳性条带；实验组诱导培养7 d后，可见黄体生成素受体、类固醇合成急性调节蛋白、3β-HSD阳性条带，并且随着诱导培养时间的延长，阳性条带增强，亦证实了脂肪间充质干细胞可诱导分化为睾丸间质细胞。

尽管实验证实脂肪间充质干细胞可分化为睾丸间质细胞，但将其应用于临床移植治疗雄性激素缺乏疾病还有很长的路要走，还有很多问题需要解决，例如：分化的细胞是否具有功能，分化的细胞数量是否足够，分化是否具有一致性，是否具有致癌风险等。为进一步观察分化的细胞是否具有功能性，下一步将进行体内动物移植实验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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[1]	麦丽萍, 何国东, 陈少贤, 朱杰宁, 侯兴华, 张梦珍, 李晓红. 乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞自然衰老过程中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 40-44.
[2]	杨腾云, 李彦林, 刘德健, 王国梁, 郑竹君. 转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 45-51.
[3]	孟德峰, 李长仔, 吴春涛. LINC02532靶向miR-145影响胰腺癌干细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 52-58.
[4]	黄涛, 程志坚, 贾志强, 赵晓光, 王磊, 翟文静, 周永新. miR-146a调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 70-75.
[5]	刘璐, 杨宇明, 商艾晨, 刘翠, 孙策, 王静. CD44⁺膀胱癌干细胞中角蛋白6B的表达和调控[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 76-83.
[6]	孙孟军, 郭建美, 周更苏, 董泽飞, 郑春贵, 曹翠丽. DNA拓扑异构酶Ⅱ在ICR小鼠神经干细胞中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 84-89.
[7]	敬劲, 赵珊笛, 陈龙, 彭双麟, 唐辉, 郭代金, 曾馨仪, 肖金刚. 骨质疏松症小鼠脂肪干细胞结合双相磷酸钙陶瓷修复骨质疏松症小鼠颅骨缺损#br#[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 90-95.
[8]	胥雪玲, 刘军, 杨爱华, 王惠芳, 郭丹丹, 刘雪梅, 徐岩. 高糖诱导人肾小管上皮细胞高表达干细胞因子[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 96-100.
[9]	崔帅帅, 杨晓红. miRNA在骨髓间充质干细胞自我更新、多向分化及命运和功能调控中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 101-106.
[10]	康悦, 刘洁. 环状RNA在间充质干细胞成骨分化中的生物学作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 107-112.
[11]	冯志国, 孙海飚, 韩晓强. 长链非编码RNA对骨相关细胞增殖、分化、凋亡的调控[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 113-120.
[12]	刘小刚, 李甜, 张舵. 中药有效成分促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 121-126.
[13]	魏珊, 李勤, 苏怡. 人乳牙牙髓干细胞的研究热点及应用潜能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 127-131.
[14]	赵旭, 毛鑫, 李春天, 王峰. 间充质干细胞治疗心肌缺血再灌注损伤的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 132-137.
[15]	帅芝琴, 陈家蒙, 刘滔滔, 胡安玲, 李利生, 余丽梅, 徐尚福. 干细胞及其来源外泌体防治血管再狭窄的研究现状与问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 138-144.