Bladder tissue engineering scaffold: its application and vascularized strategies

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.47.021

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Along with the increasing improvement of bladder tissue engineering research, the vascularization of tissue-engineered bladder after implantation becomes an issue of concern.
OBJECTIVE: Combined with relevant literature in recent years, to review the choice, design and application of scaffold materials for bladder tissue engineering as well as vascularized strategies following implantation.
METHODS: The first author retrieved PubMed database and CNKI databases for articles relevant to biological scaffold materials in bladder tissue engineering and vascularization of tissue-engineered bladder published between January 2000 to September 2014 using the keywords of “tissue engineering; bladder; biomaterials/scaffolds; vascularization” in English and Chinese, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Recently, the biological scaffolds for bladder tissue engineering include two main categories: natural biomaterials and synthetic polymers. The major target of bladder tissue engineering remains to prepare the best cell-seeded scaffolds, to determine the best source of stem cells, to explore the best differentiation way of stem cells, and to promote angiogenesis and nerve regeneration of implanted scaffolds. Thereinto, promoting vascularization of scaffold materials and building complex tissues is most challenging. At present, it is still difficult to precisely control the directional proliferation, migration and differentiation of the attached endometrial cells. Although the vascular network is necessary for the nutrient supply and metabolic waste removal of cells or tissues, strategies to promote angiogenesis or vasculogenesis are still limited.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

Key words: tissue engineering, bladder, tissue scaffolds

CLC Number:

R318

Qi Na, Li Li-xi, Tian Hong . Bladder tissue engineering scaffold: its application and vascularized strategies[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(47): 7659-7665.

Figures/Tables 1

2.1 支架材料的选择、分类和应用组织工程支架材料旨在提供一个仿生微环境，利于细胞的黏附、增殖、分化和宿主细胞整合。理想的支架需要满足以下条件：①有大量贯通的孔隙，以利于组织和血管在支架上整合。②能够被生物降解或者生物吸收，无毒，支架最终能被组织取代，降解速度能适应不同细胞的组织再生速度[6]。③有适当的表面化学，能与细胞相互作用(如能与配体结合促进细胞归巢)[7]。④有足够的机械能，可以提供临时的机械支撑，足以承受由周围组织及日常活动施加的力，对长入的细胞进行空间重组，维持组织发展的潜在空间，使其能与宿主匹配而不产生排斥反应，并能促进细胞的分化[8]。⑤不会引起任何不良的免疫反应或者代谢后产生副产物。⑥为三维结构，能按照替代组织或器官的需要任意塑性，植入人体后能保持特定的形状。⑦能够支持许多细胞类型的黏附和增殖，包括平滑肌细胞和上皮细胞。不同的支架材料在硬度、弹性、孔隙率、降解时间等物理特性上存在差异，对种子细胞黏附、支持及膀胱组织的再生也具有不同的作用[9]，因此，选择合适的生物支架材料是成功构建组织膀胱的关键之一[10]。组织工程膀胱中目前采用的支架材料主要包括天然生物材料和人工合成聚合物两大类。 2.1.1 天然生物材料天然细胞外基质：天然细胞外基质本身无毒副作用，组织相容性好，能够很好地模拟天然组织和器官，适合细胞黏附与铺展，较少引起免疫应答，可在体内降解吸收[11]。另外，细胞外基质还可以提供生物活性信号(如生长因子)，通过人体需要的因子来调节和改善细胞功能[5]。主要有蛋白多糖、糖蛋白、网状纤维、弹性纤维(胶原、藻酸盐等，其中胶原最为常用)。胶原在人和动物体内含量丰富，是一种有三螺旋结构的蛋白质，可通过酶或者酸/盐从体内分离出来，易于提取且能迅速纯化，很少引起炎症和抗原反应，经美国食品和药物管理局FDA认证，已用于许多类型的医疗材料中，包括伤口敷料和人工皮肤等[12]。胶原通过分子交联可以降低降解率，它包含细胞黏附域序列(如RGD)，可以表现出特定的细胞相互作用，有助于保持许多类型细胞(如成纤维细胞、软骨细胞等)的表型和活性，这种材料还可以根据需要被处理成各种各样的结构，例如海绵、纤维和薄膜。但其机械强度差，因此常将胶原与其他材料优化组合，取长补短，更好地满足组织修复和重建的要求。张明等[13]将天然生物胶原材料制作成疏松多孔的胶原海绵支架材料，将第3代尿路上皮细胞接种在胶原海绵支架上，体外培养4-8 d后，细胞在胶原海绵支架上生长良好，覆盖胶原材料的表面并长入材料内部，能保持尿路上皮细胞的生长特性，结果初步表明了胶原海绵复合膀胱尿路上皮细胞可以构建组织工程膀胱黏膜。何竑超等[14]将胶原蛋白与壳聚糖按9∶1比例共混，以冷冻干燥法制备胶原蛋白-壳聚糖支架。该支架为三维多孔结构，孔径在100-300 µm之间，孔径率达95%以上且孔隙之间相互连通，有利于细胞的黏附增殖和营养成分的渗透。经过溶血试验、皮肤致敏试验、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测，结果显示胶原蛋白-壳聚糖不引起溶血反应，无细胞毒性，生物相容性良好。因此，复合材料胶原蛋白-壳聚糖有望成为较理想的泌尿系统组织工程支架材料。细胞外基质衍生物：主要有膀胱黏膜下脱细胞基质、小肠黏膜下脱细胞基质、脱细胞羊膜等。生物衍生材料是通过机械、化学方法(脱细胞洗涤剂或酶)除去组织中的细胞成分，仅保留无细胞的细胞外基质，其免疫原性低，较少引起免疫应答反应和炎症反应，同时保留了天然的胶原纤维网状结构，有良好的组织相容性，经过脱细胞处理能除去组织中的细胞和抗原等成分。脱细胞的目的旨在保持自然组织的架构，同时保留细胞外基质和生物因素。涉及无细胞基质可能会提供必要的环境以促进细胞迁移，生长和分化的相关研究正在进行中[15]，随着这方面研究的继续，这些基质将在临床膀胱替代中起到一定的作用。膀胱黏膜下脱细胞基质的化学成分主要为Ⅰ、Ⅲ型纤维胶原蛋白和弹性蛋白，在结构上较好地保留了正常膀胱组织细胞外基质的原有特征，由于不含细胞成分，因此抗原性很低。膀胱黏膜下脱细胞基质在抗拉系数、弹性系数等方面与正常膀胱较为接近，其化学成分也和正常细胞外基质相同。膀胱黏膜下脱细胞基质植入体内后，可为周围细胞提供迁移、附着的三维结构，而自身将缓慢降解、重构并逐渐被新的细胞外基质取代。小肠黏膜下脱细胞基质是一种可生物降解的、无细胞的、异于胶原组织基质的移植物，该基质为经脱细胞处理分离去除小肠黏膜、浆膜及肌层中带抗原的细胞成分，形成主要以小肠黏膜下层为主的支架，免疫原性低，用于移植不会引起免疫介导的炎性反应，在跨种交叉移植实验中表现为无免疫原性；同时小肠黏膜下层保留了天然的胶原纤维网状结构(主要由Ⅰ，Ⅲ型纤维胶原蛋白构成)，含有成纤维细胞生长因子2、转化生长因子8及血管内皮生长因子等多种促组织再生和创面愈合的功能性生长因子等，可帮助细胞吸附、移动，使细胞之间形成连接，促进细胞生长分化，有利于组织、血管和韧带的形成。但是，在过去的20年中，几项研究表明该基质异种移植耐用性不高，机械强度下降，还会有DNA残留[16]。人羊膜是一种天然高分子生物材料，用作组织修复材料有以下几个特点：羊膜菲薄，比较容易脱除细胞成分，且过程简便，脱细胞完全，极大地降低了免疫原性，减少了排斥反应；经过交联增厚后机械强度明显增加，具备缝合修补材料的要求；比无细胞膀胱基质等移植物薄，吸收降解迅速；羊膜来源广泛，使用羊膜不违背伦理，但是易感染疾病。段江洁等[17]用14C标记的小肠黏膜下层修复猪膀胱缺损，术后3个月在猪的血和尿中测到高浓度的14C，重塑组织所含的14C不及最初植入时的10%，表明小肠黏膜下层支架材料逐渐被宿主组织替代，重建具有正常结构和功能的膀胱并通过尿液排出体外。Atala[18]将膀胱上皮细胞和膀胱平滑肌细胞种植在小肠黏膜下层上，可形成膀胱上皮细胞和膀胱平滑肌细胞双层结构，成功地制成组织工程化膀胱壁。羊膜也可以作为在膀胱组织再生的基质。Song等[19]首次报道了利用膀胱扩大术将膀胱黏膜下层移植到膀胱部分切除的大鼠模型体内，在移植4 d后，可以观察到完整的黏膜上皮；2周后，可以观察到血管和平滑肌组织再生；4周后，可以观察到神经再生。任鹏程等[20]将正常猪膀胱用低渗、80 ℃反复冻融、DNase和RNase混合液消化和NaOH裂解连续方法制备脱细胞膀胱黏膜下层，细胞外基质结构保持完好。经细胞毒性试验、DNA提取、细胞黏附和SD大鼠皮下植入试验检测，结果证实所制备的脱细胞膀胱黏膜下层结构无细胞毒性，细胞能较好地贴附生长，有良好的组织相容性。因此，其有可能作为组织工程化脱细胞膀胱黏膜下层的载体在修复膀胱缺损中发挥作用。Jerman等[21]将猪尿路上皮细胞分别接种在上皮羊膜、裸露羊膜、间质羊膜上，并培养3周，电子显微镜、组织化学和免疫荧光技术检测显示，所有的支架上都有尿路上皮生长，在上皮羊膜上细胞生长最快。王振显等[22]用物理和酶消化方法制备人脱细胞羊膜。将12只兔行半个膀胱切除后用人脱细胞羊膜移植物进行修补，另外6只兔行半个膀胱切除后单纯缝合作为对照，分别于术后2，4，8周测定膀胱容量并取膀胱进行组织学观察。结果显示，人脱细胞羊膜作为膀胱移植物进行膀胱修补吸收降解迅速，移行细胞和膀胱平滑肌细胞可在移植物支架上再生，可以用做组织工程膀胱的支架材料进一步研究。 2.1.2 人工合成多聚物人工合成多聚物种类多样，如聚羟基乙酸、聚乳酸及两者的共聚物等，这些材料可根据不同需求，制备成不同形状与结构的三维支架。人工合成多聚物支架材料能大规模生产，其机械性能、机械强度、微观结构、孔隙率、孔径和降解速率可调控，使种子细胞在其表面和内部附着生长，但其生物相容性差[23]。 Tian等[1]将骨髓间充质干细胞种在聚-L-乳酸聚合物上，并加入各种所需生长因子，植入裸鼠30 d后取出，可以看到细胞在多孔聚-L-乳酸聚合物支架上均匀的渗透生长，提示用聚-L-乳酸聚合物作为组织工程的支架是可行的。郭希民等[24]在体外分离、培养、扩增犬的膀胱移行上皮细胞和平滑肌细胞，分别接种于预制成囊样结构的聚乳酸-聚羟乙酸聚合物支架材料的内、外两侧表面，形成细胞-支架材料复合体，体外37 ℃培养48 h后植入到裸鼠背部皮下培育20-60 d，在外观上形成了与支架材料形状基本一致的新生组织，组织学和免疫组织化学分析结果表明，其外壁由多层的平滑肌细胞构成，内壁由数层移形上皮细胞层构成，在组织结构上类似于正常膀胱壁，提示采用聚乳酸-聚羟乙酸聚合物支架材料构建膀胱器官是可行的。 2.1.3 天然生物材料和人工合成聚合物结合合成材料已被广泛用于膀胱重建。人造硅胶膀胱的研究正在进行中，在某些疾病状态下，如尿失禁或膀胱输尿管反流，人造材料(如硅胶微粒)已被用作可注射填充的物质，但这些物质是不完全生物相容的。对于泌尿系统修复而言，用具有相容性的可降解材料具有明显的优势，能促进细胞的相互作用和组织生长[5]。由天然生物材料和人工合成聚合物复合形成的支架材料能够综合两种材料的优势，弥补各自的不足，组织相容性较好，从而满足泌尿系统的修复和重建的各种要求。 2006年，Atala等[25]第1次将结合有自体尿路上皮细胞和平滑肌细胞的胶原-聚羟基乙酸基质用于需行膀胱扩张术的患者膀胱组织上，组织工程膀胱与保留三角区的原膀胱残基吻合，术后平均随访46个月，膀胱顺应性增加，肉眼无法区分组织工程膀胱与原膀胱，活检及免疫组化染色均证实膀胱平滑肌和移行上皮表性正常。Ajalloueian等[26]用胶原蛋白和聚己内酯制成的一种合成网状支架，将猪膀胱黏膜制成组织糜并接种于支架上，在体外连续培养6周，可以观察到分层；这样的支架能够承受来自储存尿液所形成的拉伸力，对于将来应用于临床提供了依据。Horst等[27]用聚合物微纤维和天然来源的脱细胞基质制备了一种双层结构的聚乳酸-聚羟乙酸-BAM支架，即在膀胱无细胞基质的腔内表面附着一层由静电纺丝技术制成的聚乳酸-聚羟乙酸微纤维，利用改性纺丝技术维持该双层结构的稳定性，这种三维支架能为平滑肌细胞生长、附着和增殖提供支持。将该支架植入大鼠内，4周和8周分别进行活体组织学分析，可以看到尿路上皮、平滑肌和胶原蛋白再生，并有宿主细胞和微血管渗透，此外，功能测试显示该双层支架能维持正常的膀胱容量。胶原蛋白和聚羟基乙酸聚合物结合的支架可用于促进组织再生。Sharma等[28]用特殊的聚合物(弹性支架POC薄膜)支架在大鼠体内进行膀胱扩大术，研究发现间充质干细胞接种的支架在体内有膀胱组织的部分再生。丝素对泌尿系统组织工程来说是一个新的选择，它已被应用在血管和骨组织工程中，还拥有理想的适于泌尿系统的物理和生物特性。对小鼠的研究中，在膀胱扩大术中应用没有接种细胞的丝素支架，在10周内显示有膀胱组织的形成，并且在丝素支架周围没有纤维化形成。另外，相对于传统的生物材料，丝素有更高的相容性。凝胶丝素为基质的支架在鼠模型中被用来扩大膀胱，结果显示，与小肠黏膜下层及聚羟基乙酸相比，膀胱容量增加，同时保持同等程度的相容性[29-30]。 2.1.4 纳米材料纳米技术，即具有独特属性的小分子，已被用于打造“智能材料”，用于再生医学。纳米材料已经专门用于膀胱支架的制作中。纳米生物材料也可引起细胞整合和组织形成。纳米材料被广泛应用于各种领域，其纳米级别的微粒能够更好地模拟天然组织，支架表面的纳米颗粒可以表现出机械传递的特性，使细胞表面的受体更容易彼此黏附，促进细胞的生长和分化[31]，纳米材料还有助于调节细胞骨架结构的装配和塑形[32]。已证明，与常规的聚合材料相比，膀胱平滑肌细胞黏附到纳米结构的聚合物表面表现出显著优势[33]。Yao等[34]用聚氨酯和聚乳酸-聚乙醇酸制成纳米级别支架，并移植到小型猪体内，结果显示体内膀胱组织再生。面向未来，随着纳米技术领域的进一步发展，纳米结构的聚合物生物材料支架能更好的模拟细胞和支架的相互作用[35]。 2.2 膀胱组织工程的血管化近20年，组织工程领域的研究虽然已经有很大的突破，现有的技术仍然面临着很多待解决的问题，包括种子细胞的选择，再生组织中的新生血管的产生，神经组织和原始生物支架的设计等。早期相关研究证实，尿路上皮、平滑肌、血管和神经的再生都是在大鼠移植的脱细胞基质支架内，因此组织工程支架材料的构建是膀胱再生的关键部分。组织工程支架材料制备之前还需要考虑到各细胞成分的比率，如细胞基质分子、神经生长因子、血管生成因子等，特异蛋白的平衡表达，基因涉及的增殖再生等[36]。当前膀胱组织工程研究最主要的目标仍然是：制备接种细胞的最佳支架，确定干细胞的最佳来源，探索干细胞最优分化方式和促进植入支架的新生血管和神经的再生，其中促进支架材料的血管化和构建复杂的组织是最具有挑战性的。目前来说，使支架上附着的内膜细胞精确的定向增殖、迁移和分化仍然很难控制[37-38]。尽管血管网对于细胞和组织的营养供应和代谢废物清除是必要的，但促进血管生成或血管发生的策略仍有限[39]。能够最终成功培养出器官的最根本问题是，复杂的三维结构支架能否提供足够的氧气和促进新血管的生成。活的组织和器官中的血管网的灌注对于机体稳态的维持是必不可少的：血管为细胞提供了基础代谢需要，即提供营养物质和清除代谢废物[40]。构建一个支持有效的血管灌注的微循环仍旧是一个巨大的挑战。膀胱组织工程的血管化策略：优化支架的促血管能力，包括控制孔隙和功能化细胞基质的成分，如生长因子和胶原蛋白。组织工程的血管构建有两个主要的策略：在体内，依赖于毛细血管发芽和向内生长，从宿主长到支架上；在体外，从内皮前体细胞在原位形成毛细血管。无论哪种方法，限制组织生长的最大问题是一个灌注血管网的发生和成熟所需要的时间。在某些生长情况下，血管发生和成熟的时间可能比细胞存活的时间更长，其中微型血管的形成有助于加快血管管腔形成，以及在宿主和组织之间构建分支。已经证明，在代谢活跃的组织中，氧从毛细管床扩散到达一个细胞的距离大约0.1 mm[41]，但在临床移植物中，从边缘到中心的距离很可能超过其至少50倍。因此，除了少数器官(如软骨)外，氧气限制大多数移植器官中细胞的生存力，也限制了器官组织工程[42]。新血管的形成是一个复杂的形态变化过程[43]，为确保在初始移植后移植组织的存活，有必要采取一些特殊的措施，直到功能血管床已经完全建立。目前，已经有3种类型的策略可以解决供氧问题。第1种，在移植物植入前和植入过程中，利用机械或者化学来源的氧支持，直到新血管形成过程完成且可以为新器官提供足够的血液循环[44]。一个内部组织灌注系统在体外利用大量微针传输氧气和营养物质，消除代谢废物，可以提高组织的生存力和功能，这种方法为体内移植提供了思路[45]。此外，使用携氧分子，如全氟化碳，能提高培养的细胞的功能，促进细胞和器官在动物体内的植入。研究发现，在体内聚乳酸-聚羟基乙酸膜结合氧生成系统(过碳酸钠)可预防组织缺血性坏死[46]。第2种，内皮细胞预先接种入支架，或者利用体内或支架释放的生化信号使内皮细胞聚集，便于血管网的生成[47]。但问题是，以怎样的方式创建一个通道来作为体内的一种天然血管网。一种解决方案是采用脱细胞组织作为支架[48]。一项最近的研究表明，利用组织独立地设计脱细胞灌注技术，结果显示整个器官支架的血管树仍然可用，而且可以重新填充大量的内皮细胞[49]。已经有多种技术被用于制造支架和预制渠道，与细胞结合可以促进新血管的生成。例如，激光制导“写作”是用来塑造内皮细胞，促进其聚合成管状的血管。同样的，喷墨型生物打印细胞和生物材料，通过热喷墨技术可以明显控制组织工程的结构，包括复杂血管网的生成。目前，很多组织工程中已经使用了生物打印技术在构建的三维支架结构上打印内皮细胞，用磁共振图像做评估，结果显示植入体内后有有功能的微血管出现[50]。静电纺丝技术制备的活细胞和生物材料在制造血管化的器官结构上也提供了类似潜力[51-52]。设计一个已存在动静脉循环的数学模型支架，展示了提供氧源的支架可以动态支持新血管和组织的进一步发展[53]。细胞联合培养可防止构建形成血管中的内皮细胞脱落和凋亡，使新生血管网络更加稳定，因此，细胞联合培养技术也被越来越多地应用到实验中。第3种，提供生长因子血管内皮生长因子是促进新血管形成的最主要的调节因子[54]，它有助于改善局部组织的灌注[55]。在以前的实验中，血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子已被纳入生物工程组织，而且显示其有利于血管的生长。最近的研究中扩展了这种方法，新的促血管生产分子已被用于支架中[56]，而且研究发现在支架材料中加入氧化钴能增加血管内皮生长因子的分泌量[57]。能够提供由细胞外基质呈现的信号合成生物材料，最终可能会取代天然分子[58]。 2.3 膀胱组织工程的神经支配尽管组织工程在膀胱的修复中有令人鼓舞的成就，但是膀胱组织的神经支配也是急需解决的问题。组织和器官的神经支配仍然是实现全部功能的重要部分，神经系统不仅对于新生器官的功能有重要作用，而且有证据表明它还可以促进组织再生。组织工程神经支配的恢复构建体在其他系统中已经观察到了，如小肠[59]。控制神经营养因子的释放是促进周围神经突触形成和再生的一个潜在的方法。已证明直接电刺激对于肌肉的再生有作用[60]，并且可以具有更广泛的适用性。"

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