Chinese Journal of Tissue Engineering Research ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (34): 5530-5536.doi: 10.12307/2021.251
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Liu Jingchen1, Li Mingjun1, Sun Shuguang1, 2, Li Cairui1, 3
Received:
2020-08-17
Revised:
2020-08-26
Accepted:
2020-09-26
Online:
2021-12-08
Published:
2021-07-28
Contact:
Li Cairui, Professor, Chief physician, Clinical Medical College, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China; Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China
About author:
Liu Jingchen, Master candidate, Attending physician, Clinical Medical College, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China
Supported by:
CLC Number:
Liu Jingchen, Li Mingjun, Sun Shuguang, Li Cairui. Application of acellular tissue in ophthalmology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(34): 5530-5536.
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2.1 脱细胞材料来源 目前眼科领域使用的脱细胞支架主要由特定部位人体及动物组织通过脱细胞处理而获得,随着研究的深入及技术的发展,组织的来源不断扩大,不同部位组织的生理特性具有不同的特点,使疾病的治疗拥有更多的选择。根据组织的供体不同,目前可以用于脱细胞的组织主要有以下几种来源。 2.1.1 人源性组织脱细胞材料 同种异体来源的组织是当前组织重建的热点研究方向,但受体部位大范围缺损时移植物存活能力下降、供者和受者之间的免疫不匹配会导致的排斥反应、需进行长期免疫抑制治疗等因素,严重限制了异体组织的应用。通过脱细胞技术处理的人体组织能有效去除组织中的抗原成分,其作为支架材料可以支持人体细胞的生长,有效解决同种异体移植中的排斥问题。ALIO DEL BARRIO等[4]以脱细胞人角膜基质植片为支架,对支架使用人脂肪来源成体干细胞进行再细胞化后移植入兔角膜的基质层,评估发现脱细胞人角膜基质植片中的人脂肪来源成体干细胞体外再细胞化能力优异,移植后的角膜植片基质透明,未发现移植排斥反应,具有良好的生物相容性,在移植的人脂肪来源成体干细胞中有人角化蛋白的表达,脱细胞人角膜基质植片具有促进人脂肪来源成体干细胞向角化细胞分化的作用。人脱细胞真皮组织材料具有保护周围组织、预防挛缩、感染率低等特点[5],在临床中应用于跟腱断裂[6]、全层皮肤创伤[7]、糖尿病足溃疡等疾病的治疗[8],在眼眶疾病及眼表修复中脱细胞真皮材料也具有良好的效果。CHO等[9]的研究中使用人脱细胞真皮基质对眼球缺失或萎缩的患者进行矫正手术,手术效果良好,术后患者均可成功佩戴假体。JIANG等[10]使用人脱细胞真皮基质对角膜边缘变性患者进行角膜移植,移植术后不同时间点的复诊发现,在移植物中角化细胞重新聚集并生长,基底上皮中可见神经纤维,角膜内皮细胞形态未受明显影响,证实了人脱细胞真皮基质移植在治疗边缘性角膜变性患者中具有良好的透明性、生物相容性和安全性。另外,人脱细胞羊膜也被广泛应用于皮肤和眼表组织的修复中[11]。人组织脱细胞支架的生物安全性及组织相容性高于异种脱细胞组织,但其供体来源受社会文化因素的影响较大,在部分国家和地区供体的来源较少。 2.1.2 动物源性脱细胞材料 动物组织因其供体来源广泛越来越受关注,但异种抗原的存在可能引发明显的炎症反应及免疫介导的组织排斥,通过脱细胞技术去除异种抗原获得的有细胞外基质生物活性的脱细胞支架具有临床治疗的巨大潜力。异种脱细胞角膜材料是当前角膜疾病中应用最多的脱细胞支架材料,已有从鸵鸟、猪、牛等多种动物组织中获取脱细胞角膜基质材料应用于角膜移植的基础和临床研究[12-14]。ZHENG等[15]通过对13例单纯疱疹病毒性角膜炎患者使用脱细胞猪角膜基质进行角膜移植发现,脱细胞猪角膜基质对单纯疱疹病毒性角膜炎患者有较好的治疗效果,角膜透明度与术前相比有显著提高。异种脱细胞真皮的来源广泛,是眼部整形修复手术中使用的明显材料。BARMETTLER等[16]在一项下睑回缩修复的前瞻性、随机比较研究中发现,使用猪脱细胞真皮基质、牛脱细胞真皮基质和自体耳郭软骨进行下睑重建的术后效果和并发症没有统计学差异。高眼压引起的视神经损伤是青光眼最常见的临床表现,但在体外青光眼视神经损伤研究中能够重现视神经头复杂解剖和生物力学环境的方法极少。LIOU等[17]通过对猪眼球的后极部进行脱细胞处理,发现经脱细胞视神经乳头的模型在保持原有细胞外基质微结构的同时,视神经乳头的生物力学响应能力未受明显影响,在压力测试中能产生与对照组相似的位移,可以满足青光眼发病机制研究的需要。动物来源的脱细胞支架供体来源广泛、易于获取,但植片溶解、适应时间较长、植片收缩及细胞化不完全等并发症困扰着该类材料的大范围应用。 2.1.3 体外细胞基质脱细胞材料 在人体内存在一些重要的组织,结构菲薄,但对组织功能的发挥具有关键性作用,常规技术难于获取,限制着疾病的治疗。眼部的视网膜色素上皮细胞是血-视网膜外屏障的重要组成部分[18],损伤后可以导致严重的视力障碍,但由于组织极薄且对视力恢复具有重要作用而受到研究者的广泛关注。MCLENACHAN等[19]将体外培养的视网膜色素上皮细胞ARPE19进行脱细胞处理后获得的细胞外基质应用于人视网膜色素上皮细胞的培养,发现在ARPE19细胞外基质上培养的细胞能保持色素表型,经ARPE19细胞外基质培养的多能干细胞能产生色素,并表达人视网膜色素上皮标记物RPE65。因此,对于体内某些重要而精细的组织,在体外培养大量扩增细胞的基础上制备脱细胞支架,在组织重建中是一个有潜力的研究方向。目前这类材料多用于体外研究,支架制备后进行体内移植的技术并不完善,同时体外培养细胞所使用的试剂对人体的长期安全性也需进一步研究。 2.2 脱细胞组织材料的眼科研究 眼部是外伤、年龄相关性疾病的好发部位,病变组织的重建及再生是眼科研究的热点。临床上外伤出现的泪小管离断、大面积眼部皮肤缺损、眼肿瘤切除后组织缺损及角膜移植片供给紧张等问题一直困扰着眼科的临床治疗,随着脱细胞技术的不断进展,眼科脱细胞材料的应用越来越广泛,使这类疾病的治疗有了新的选择。 2.2.1 泪腺 泪腺是眼部重要的分泌腺,分泌液中含有水、电解质及免疫球蛋白等物质,参与形成覆盖眼表面的泪膜,能润滑结膜和角膜、支持眼表的代谢[20],在维持眼表健康、保持眼部稳定屈光状态和保护眼表免受环境影响方面起着重要的作用[21]。干眼症是一种常见的眼表疾病,其特征是泪液分泌减少、泪膜失去稳态,并伴有眼部症状[22],重症干眼可能发生严重的眼表并发症,引起角膜混浊而导致失明。干眼症的治疗主要是抗炎及泪液替代治疗,但这些治疗对于重症干眼患者效果不佳。严重干眼症的主要原因是泪液分泌功能障碍,利用颌下腺腺组织的自体移植来恢复泪液功能性分泌是治疗此类患者的有效方法,但颌下腺移植后并没有明显改善重症干眼的眼表[23],部分患者存在溢泪、静脉血栓形成、口干、涎石症等并发症[24];并且由于唾液成分不同于泪液,可能会导致眼表上皮的进一步损害,需开发新的治疗方式以改善这些不足。其中构建具有分泌性功能的生物工程泪腺是一种有潜力的干眼症治疗方式。SPANIOL等[25]通过脱细胞技术处理猪泪腺后得到具有泪腺形态的三维脱细胞泪腺支架,然后将具有分泌活性的猪泪腺细胞移入脱细胞支架中培养,发现细胞可以形成类似于泪腺的形态,并表现出分泌活性。LIN等[26]将接种有兔泪腺祖细胞的新西兰兔泪腺脱细胞支架放入三维培养体系中培养,发现可以诱导形成具有导管样和腺泡样的组织结构,通过对脱细胞支架泪腺基质中的细胞形态、免疫染色和氨基己糖酶分泌进行检测,发现其显示出良好的细胞活力、细胞分化和分泌功能。MASSIE等[27]使用脱细胞猪空肠作为泪腺上皮细胞的支架进行静态(细胞冠)或动态培养(灌注室),发现泪腺上皮细胞在脱细胞猪空肠上可以良好地生长,透射电镜发现细胞之间具有良好的连接,且上皮细胞上表面出现与原生上皮细胞相似的极化,免疫组化检测发现脱细胞猪空肠支架上培养的细胞能够产生泪腺特异性蛋白,并且在动态培养中溶菌酶和乳铁蛋白的表达量更高,说明脱细胞猪空肠是支持泪腺上皮细胞生长的合适支架,在动态培养条件下可以促进泪腺细胞的代谢活性和功能。利用脱细胞技术获取的生物支架能良好地支持泪腺细胞的生长,维持其代谢活性和功能,在泪腺组织再生方面具有潜在的应用价值。目前应用脱细胞支架进行泪腺再生的研究多为体外实验,再生的泪腺虽然具有一定的代谢活性和功能,但其应用于人体移植需进一步研究。 2.2.2 眼睑 眼睑直接与外界环境接触,是眼球重要的保护组织,眼睑形态异常导致的眼睑严重退缩、外伤及恶性肿瘤导致的眼睑大面积缺损,可导致角膜严重发生,甚至出现角膜溃疡,最终影响患者的视力,在眼睑修复过程中需寻找有效的移植物支撑眼睑,以达到治疗效果。SUN等[28]使用牛脱细胞真皮基质对甲状腺相关性上睑退缩患者进行提上睑延长术,术后未发现排斥病例,92%患者的治疗效果评价为可接受及良好,牛脱细胞真皮基质作为可吸收支架术后可延伸提上睑腱膜,是纠正甲状腺相关性严重眼睑收缩的一种有效选择。MCGRATH等[29]使用猪脱细胞真皮基质对下眼睑退缩的患者进行治疗,同样发现患者术后下眼睑退缩均有显著改善,植片的组织相容性较好,在随访期间患者无明显眼部刺激,未发现移植排斥病例,但脱细胞植片会在术后出现一定的吸收和收缩。章余兰等[30]使用牛脱细胞真皮组织在眼睑恶性肿瘤切除术中替代切除眼睑的结膜睑板组织,随诊半年发现牛脱细胞真皮内表面均被结膜上皮覆盖,基质部分已溶解,外表面皮瓣生长良好、未见坏死,术后仅部分患者出现程度较轻的眼睑闭合不全及睑球粘连。脱细胞基质可为眼睑组织提供有效的支架以保持眼睑的正常外形,在眼睑病临床治疗中具有重要的应用价值,目前大多数文献中所研究的病例数较少,安全性的确定需进行大样本的随机对照临床试验。 2.2.3 泪小管 泪道损伤是面部外伤的常见并发症,泪小管断裂后泪道修复是眼科的一个难题,常因瘢痕收缩导致治疗的失败,当前有多种组织及材料用于其治疗,但效果并不理想。CHEN等[31]将自体结膜瓣贴附在脱细胞牛真皮基质,做成以结膜上皮为内壁、脱细胞真皮基质为外壁的管状结构,对5例泪道部分或完全缺失的患者进行泪小管重建,随访6-12个月,鼻内窥镜下5例患者均可观察到鼻腔内的重建泪小管的开口,泪道冲洗通畅,溢泪症状均得到缓解。表明脱细胞真皮基质在治疗复杂泪道病变方面具有潜力,是泪道重建的一种新的方法,目前研究显示的短期疗效满意,但病例数较少且长期效果需进一步观察。 2.2.4 结膜 结膜是眼表的重要组成部分[32],是眼部对抗病原体的天然屏障,并能分泌黏蛋白维持泪膜的稳定。结膜损伤的愈合常伴随着瘢痕增生,容易导致结膜囊收缩,在眼表严重破坏的疾病中,结膜缺损面积过大在愈合后可形成睑球粘连,导致眼球运动受限,结膜大面积损伤后出现黏蛋白分泌减少,使泪膜稳定性下降,进而导致角膜疾病的发生,严重影响患者视力。因此对于结膜的重建非常重要,临床上对于结膜缺损患者通常采用自体结膜或羊膜移植进行治疗,但自体结膜供应有限,羊膜对大面积结膜缺损的长期治疗效果并不稳定,需寻找新的材料来提高该类患者的疗效。魏利娜等[33]采用脱细胞牛心包生物补片对32例义眼台植入后结膜囊狭窄患者行结膜囊成形术,术后观察植片未发现脱落及溶解,可见上皮细胞生长到脱细胞植片上,手术3个月后植片上呈正常结膜色泽外观,可以顺利配戴义眼片,并且眼外形良好。HUANG等[34]使用脱细胞牛心包植片进行兔结膜重建,发现结膜上皮能够良好地生长在脱细胞牛心包植片支架上,上皮下组织为随机排列的胶原组成的松散网络,并且与正常结膜中一样可发现杯状细胞分散在上皮细胞中,脱细胞植片重建的结膜比羊膜重建组具有更强的力学性能和弹性,但同时也发现脱细胞植片在重建过程中上皮需更长时间恢复的不足。ZHAO等[35]在兔严重睑球粘连模型研究中发现,脱细胞猪结膜的应用可以增强移植稳定性和改善上皮再生,将脱细胞猪结膜应用于翼状胬肉和睑球粘连患者治疗时发现,移植的脱细胞猪结膜表现出良好的组织相容性,所有病例的移植物均完全重新上皮化,未见移植物融化或纤维增生。石璐等[36]应用异种脱细胞真皮基质对睑球粘连和结膜囊狭窄患者进行结膜囊成形术,发现术后新生结膜可爬行生长在异种脱细胞真皮基质上,结膜囊成形良好,异种脱细胞真皮基质在术后40 d至2个月发生溶解,观察结束时手术眼睑球无粘连,结膜囊成形良好的总有效率可达89.5%。由此可见,脱细胞技术获得的细胞外基质在结膜疾病治疗方面具有良好的效果,可以促进结膜修复及上皮生长,是一种良好的结膜替代生物膜。但使用脱细胞支架材料术后炎症反应时间相对较长,降解过程的免疫学机制尚不明确,需继续对其进行研究并探索有效的解决方法。 2.2.5 角膜 角膜作为眼睛的最外层容易受到物理和化学损伤,从而导致角膜透明度下降甚至消失,导致失明[37]。对于角膜混浊的患者目前尚无可靠的治疗药物,角膜移植是目前使病变角膜恢复透明最有效的方法[38]。人角膜供体主要来源于器官捐赠,但由于社会文化因素,多数国家捐献死亡器官的比率非常低[39],需开发新的角膜移植供体源来解决角膜供给困难问题。角膜胶原纤维的规则排列是维持角膜透明度的重要因素,通过脱细胞技术获取规则的细胞外基质可满足这一要求。经脱细胞处理的猪角膜基质与天然角膜基质结构相似,其免疫原性较低、透明性和生物相容性良好,是一种优良的角膜供体材料[40]。HASHIMOTO等[41]使用脱细胞猪角膜基质进行兔板层移植研究,组织学分析显示脱细胞角膜基质可与兔角膜完全融合,可见与正常角膜相似的角膜上皮再生;随着术后观察时间的延长,脱细胞猪角膜基质中逐渐出现兔角化细胞的浸润,并逐渐重构到兔角膜组织中;透射电镜显示,脱细胞猪角膜基质内出现与正常角膜相似的超微结构改变。段虎成等[42]对5例使用脱细胞猪角膜基质行板层角膜移植的患者进行扫描共聚焦显微镜检查,显示术后3 d脱细胞猪角膜基质上开始出现上皮化,整个上皮化过程在10 d左右可以完成,随诊半年发现角膜上皮细胞的密度与对照眼无差异,但细胞的排列较疏松。李上等[43]使用脱细胞猪角膜基质植片对感染性角膜溃疡进行深板层角膜移植,发现脱细胞猪角膜基质植片生存良好,角膜保持透明,共聚焦显微镜检查显示脱细胞猪角膜基质植片上覆盖满角膜上皮细胞,但植片深基质层靠近内皮面仍可见脱细胞纤维排列,与新鲜角膜植片对比基质内的细胞密度明显减少。脱细胞猪角膜基质因其在角膜移植治疗上较好的治疗效果受到了极大关注,目前国内已有上市商品化的脱细胞猪角膜基质应用于临床治疗中,是替代人角膜组织的有效方法[44],但目前脱细胞技术主要通过化学或物理方法去除移植组织中的细胞成分,如何在脱细胞处理的同时保持组织固有结构仍是一大难题,基质结构受影响可能导致角膜植片的稳定下降,导致移植失败,需进一步研究来完善。 2.2.6 小梁网 青光眼是世界范围内不可逆性盲的主要原因,眼内压是目前青光眼唯一可改变的危险因素。小梁网在房水流出调节中起关键性作用[45],小梁网细胞的功能失调使房水流出减少,导致眼压升高,是发生青光眼性视神经病变的重要危险因素。因此对小梁网进行脱细胞,或者小梁网脱细胞联合有功能小梁网细胞移植可能是治疗青光眼的有效方法。DANG 等[46]将处理后的新鲜猪眼前节在-80 ℃及室温下循环冻融2次,经实验分析确认冻融的小梁网内细胞完全消融后,在相同灌注压情况下对小梁网脱细胞后猪眼进行眼压监测,发现24 h内比基线眼压平均下降了约30%,在另一组使用0.02%皂苷进行脱细胞处理的猪眼前节中,48 h内也有同等程度的眼压下降。 ABU-HASSAN等[47]使用皂苷对人眼前节进行脱细胞处理,发现经皂苷脱细胞的小梁网失去了维持眼内压的稳态功能,在小梁网移植培养的人小梁网细胞或小梁网样诱导多能干细胞后这一功能得到了恢复。说明在进行小梁网脱细胞处理后可显著改变眼内压,但小梁网维持眼内压稳态的功能受损,使用有功能小梁网细胞对脱细胞的小梁网组织再细胞化,然后使用该组织进行小梁网移植,能达到一定的降眼压及维持眼压稳定功能,可能是青光眼治疗的新方向。 2.2.7 视网膜 视网膜病变引起的神经元凋亡和丢失会导致不可逆转的失明,视网膜前体细胞是治疗这类患者非常有潜力的方法[48],但视网膜前体细胞增殖能力有限及细胞倾向于胶质细胞分化等问题限制了其临床应用[49]。细胞外基质因其可以提供适当的细胞黏附及诱导细胞分化的微环境,为视网膜前体细胞研究提供了新的方向。JI等[49]通过对培养的人脂肪间充质基质细胞进行脱细胞处理生成脂肪间充质细胞脱细胞基质,再将分离培养的小鼠视网膜前体细胞与脂肪间充质细胞脱细胞基质共培养,发现脂肪间充质细胞脱细胞基质对视网膜前体细胞增殖具有促进作用,扫描电镜检查可见脂肪间充质细胞脱细胞基质上培养的视网膜前体细胞形态正常,同时出现正常生长的神经突,免疫细胞化学分析发现视网膜前体细胞所分化的感光细胞数量也显著增加,通过蛋白印迹及PCR检测发现,脂肪间充质细胞脱细胞基质通过视网膜前体细胞内的Akt和Erk信号通路促进细胞的增殖,当这两条通路被抑制时脂肪间充质细胞脱细胞基质对视网膜前体细胞增殖及分化的促进作用减弱。KUNDU等[50]对牛视网膜进行脱细胞处理,再将人视网膜前体细胞接种到脱细胞视网膜基质进行培养,发现人视网膜前体细胞可以在脱细胞视网膜基质上良好地附着、增殖和分化,与在正常组织培养平板表面和纤维连接蛋白涂层表面培养的人视网膜前体细胞相比,脱细胞视网膜基质能促进视网膜祖细胞的成熟,并促进光受体标记的表达。 视网膜色素上皮细胞是视网膜的重要组成部分,在视网膜稳态中起重要作用[51],视网膜色素上皮细胞的萎缩可严重影响患者视力,目前尚无有效的治疗方法。MCLENACHAN等[19]通过对硫酸葡聚糖中培养的ARPE19细胞进行脱细胞处理获得了ARPE19细胞外基质,将其应用于人视网膜色素上皮细胞的培养后,与geltrex及vitronectin上培养的视网膜色素上皮细胞进行对比发现,虽然3种培养条件下的视网膜色素上皮细胞数量均增加,但仅有ARPE19细胞外基质上的细胞能保持色素表型;而将诱导多能干细胞在ARPE19细胞外基质上培养后,发现诱导多能干细胞产生色素,并且细胞中视网膜色素上皮细胞标记物RPE65的表达明显增加,表明ARPE19细胞外基质具有维持视网膜色素上皮细胞表型和促进诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的功能。因此,在视网膜疾病中脱细胞基质可以维持细胞表型及促进细胞分化,在治疗视网膜疾病方面有广泛的应用前景,但脱细胞基质支架中的干细胞分化率低、诱导分化后的细胞与视网膜的整合较差、如何建立移植片与视网膜神经信号连接等都是需要解决的难题。 2.2.8 眼眶 眼眶对眼球具有重要的保护作用,许多眼球疾病的病理改变与眼眶关系密切,需通过眼眶手术来治疗。后巩膜葡萄肿是病理性近视的标志,可以诱发黄斑病变导致视力的丢失[52],对后极部巩膜进行加固能预防病理性近视的进一步发展,可以有效保护患者的现有视力。王甜等[53]使用异体脱细胞真皮基质对日本大耳白兔行后巩膜加固术,发现术后加固条带表面及受体巩膜融合区均有结缔组织增生,受体巩膜未发现溶解征象,ELISA检测实验眼脱细胞真皮基质加固区的碱性成纤维细胞生长因子较对照眼明显升高,提示脱细胞真皮基质加固后可以刺激巩膜成纤维细胞的增生,表明脱细胞基质在后巩膜加固治疗中具有应用的潜力。 义眼台暴露是义眼植入后一个比较常见的问题,目前临床上一直寻求合适的材料解决。刘凤霞等[54]使用脱细胞牛心包补片对12例中重度义眼台暴露的患者进行修复,随诊时患者双眼外观对称,结膜能良好地覆盖脱细胞补片,未见明显的排异反应,表明脱细胞补片对义眼台暴露具有良好的治疗效果。脱细胞基质在眼眶重建方面也具有重要的作用。KIM等[55]对29例使用脱细胞异体真皮基质进行眶壁重建的患者进行回顾分析,发现脱细胞异体真皮基质能很好地适应眼眶内部轮廓,进行眼眶重建手术操作方便,在眼眶壁重建后患眼的眼球内陷、眼球活动受限及复视的症状均有改善,随访期间未发现并发症的发生,认为脱细胞异体真皮基质可能是一个很好的眼眶重建材料。SCOFIELD-KAPLAN等[56]报道了2例进行眶底重建的眼眶肿瘤患者,术中使用钛板重建眶底,为防止锋利的边缘接触眼睑组织,在弯曲钛板前部后使用脱细胞真皮连接眼睑与钛板,在术后随诊发现术后外观良好,没有眼球内陷及瘢痕性睑内外翻,脱细胞真皮的使用减少了单纯钛板重建导致的潜在性瘢痕收缩引起的眼睑外观异常。"
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