Research progress in bone marrow mesenchymal stem cells for promotion of islet regeneration

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.019

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells transplanted into diabetes mellitus rats can decrease glucose level.
OBJECTIVE: To summarize the research progress in bone marrow mesenchymal stem cells for promotion of islet regeneration.
METHODS: A computer-based online retrieval of PubMed and Wanfang databases was performed to search papers published during July 2003 to December 2011 with the key words bone marrow mesenchymal stem cells, islet cells in English and Chinese. Twenty-five papers were included in the final analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: At present, transplantation of islets has made great advance in treatment of diabetes mellitus. Many patients with diabetes mellitus hardly benefit from islet transplantation because of limited islet origins and the immunological rejections of heterogenous or xenogenous islets. Bone marrow mesenchymal stem cells are characterized by easy to operate, easy in vitro isolation, culture and purification, and multipotential differentiation. Islets induce-differentiated by bone marrow mesenchymal stem cells are expected to solve islet-related problems of the limited origin and immunological rejections. This paper summarizes the research progress in bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of diabetes mellitus and points out the existing problems and further study direction.

Key words: stem cells, stem cell review, bone marrow mesenchymal stem cells, islet cell, diabetes mellitus

CLC Number:

R318

Fan Zi-yang, Bai Jin-bao, Wang Hui, Qie Hong-zheng, Deng Xin-sheng, Hu Ying, Liang Hai-sheng, . Research progress in bone marrow mesenchymal stem cells for promotion of islet regeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 118-123.

Figures/Tables 1

2.1 骨髓间充质干细胞的研究背景骨髓间充质干细胞是1976年Friedenstein等首次在骨髓中加以分离得到，间充质干细胞是指存在于骨髓基质内的非造血细胞来源的细胞亚群，后来被证实广泛存在于骨髓基质、脂肪、骨实质、胎盘、肝脏及骨骼肌等多种组织中的一群非造血干细胞，该群细胞起源于早期中胚层和外胚层，有高度的自我更新和分化潜能，在不同的诱导条件下可以分化为除造血细胞以外的多种组织细胞，如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、星形胶质细胞、神经细胞、内皮细胞和胰岛细胞等。该群细胞并非是单一的细胞群，而是包含了许多干/祖细胞的混合细胞群[8]。根据“国际细胞疗法协会(ISCT)”的最新规定，应称其为“多潜能基质细胞”[9]，根据该规定符合以下标准的细胞群体才可以称为“多潜能基质细胞”：在标准培养条件下黏附于塑料制品生长；表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14(或CD11b)及CD19，也不表达HLA-DR；体外必须有分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞的能力。随着研究的深入，人们发现间充质干细胞还有独特的免疫学特性，表现出具有很低的免疫原性，并且在体内外都显示了很强的免疫调节能力。而且具备多向分化和组织修复能力，在体内外容易分离培养和扩增。基于以上特点在胰岛移植方面备受关注。 2.2 骨髓间充质干细胞治疗糖尿病的研究现状骨髓间充质干细胞作为一种可扩增的细胞资源，近几年在治疗糖尿病方面得到了广泛的关注。但是目前在骨髓干细胞的分离、培养、转化等方面仍然存在一些问题。目前，分离骨髓间充质干细胞的常用方法主要有以下几种[10]：①密度梯度离心法。是应用淋巴细胞分离液通过离心分层，将有核细胞和造血细胞分离，获取界面的有核细胞进行细胞培养。②贴壁筛选法。骨髓间充质干细胞具有贴壁生长特性，而造血细胞则悬浮生长，反复冲洗可去除悬浮生长的造血细胞，就可以收集贴壁生长的骨髓间充质干细胞。在实际工作中，贴壁筛选法多与密度梯度法联合应用，密度梯度离心将大部分的造血细胞分离出去，只收集骨髓中的单核细胞，再通过贴壁培养，换液去除悬浮生长的造血细胞，便可获得较纯的贴壁生长的骨髓间充质干细胞，这是比较理想的分离纯化方法。③细胞表面分子标记分选法。主要是根据骨髓间充质干细胞的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但因目前尚未发现间充质干细胞特异性很强的表面标记物，且这种方法对细胞活性的影响较大、实验条件要求较高、需要骨髓量较大，所以较少应用于骨髓间充质干细胞的分选。④细胞筛选法。主要是根据细胞大小，利用一种有3 μm小孔的塑料培养皿从骨髓中筛选骨髓间充质干细胞。目前常用Transwell细胞共培养技术在体外将间充质干细胞诱导分化成具有功能的胰岛样细胞。间充质干细胞进入新环境后，对新环境的调节信号做出反应，分化成与新的生长环境相适应的细胞。胰岛细胞合成分泌的多种细胞营养因子如胰岛素、胰高血糖素、葡萄糖转运子2及pdx-1等，以及多种细胞外基质成分、细胞黏附因子和细胞间的相互作用均在间充质干细胞的定向分化成胰岛样细胞上起着重要作用[11]。间充质干细胞向胰岛细胞的诱导分化方面，常用实验如下：体外实验：Choi等[12]在提取兔的骨髓间充质干细胞加入胰腺的提取物后发现了类似胰岛素分泌细胞的聚集，并且表达4种胰腺内分泌激素，胰岛素分泌细胞还可以释放胰岛素调节血糖；同时证实骨髓源基质细胞表达CD44、CD71分子，但不表达CD34和CD45分子。Oh等[13]采用体外横向分化技术，将骨髓来源的细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞，利用免疫组织化学法鉴定发现，诱导后的胰岛素分泌细胞可以表达胰岛素、胰多肽、生长抑素等多种蛋白和基因。Western blot和酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析证明其可表达胰岛素前体和有活性的胰岛素。在高血糖鼠肾脏被膜下移植入诱导后的细胞可以降低血糖并维持90 h左右。电镜下观察诱导后的细胞和胰岛细胞具有相似的超微结构。由此证实成体骨髓细胞可以在体外诱导分化为胰岛素分泌细胞。体内试验：Hess等[14]将骨髓来源的细胞移植到链脲菌素诱导的糖尿病小鼠体内，虽然受者体内一定量的供者胰岛素阳性细胞存活并可以降低糖尿病小鼠的胰腺损伤，但是这些细胞并不能明显降低血糖水平。移植后的细胞大多数聚集在导管和胰岛结构附近，而且它们的出现伴随着分泌胰岛素的胰腺细胞的扩增。由此说明骨髓来源的细胞可以使胰腺再生。Ianus等[15]将标有绿色荧光蛋白雄性小鼠的骨髓通过尾静脉移植到放射线照射的雌性小鼠体内，无菌条件下喂养4-6周后处死。用胶原酶等消化胰腺获取单个胰岛细胞，并采用免疫组织化学、RT-PCR、胰岛素分泌方法检测，结果移植后的4-6周，受者的胰岛细胞内表达Y染色体和绿色荧光蛋白。而且供者和受者骨髓和外周血的有核细胞内均未检测到绿色荧光蛋白。从胰腺内分离出来的绿色荧光蛋白细胞表达胰岛素Ⅰ、Ⅱ，葡萄糖转运体Ⅱ和胰岛β细胞特有的转录因子胰十二指肠同源异形盒基因(IPF)，而不表达HSC表面标志、胚胎干细胞和间充质干细胞表面标志。体内外实验结果表明，骨髓间充质干细胞不但能够分化为胰岛样细胞而且具有一定的β细胞功能，能够降低血糖，从而为糖尿病患者进行胰岛细胞移植的治疗提供了新思路。在基因工程方面，通过将外源性胰岛素相关基因导入间充质干细胞内，使其分泌胰岛素，在糖尿病模型体内可以有效的控制血糖并有部分β细胞特性[16]。但间充质干细胞在体内能否直接转化为胰岛细胞还存在较多的争议。Ianus等通过外周静脉将雄性小鼠的间充质干细胞移植到雌性小鼠体内，得到了可以表达胰岛素的功能完全的胰腺内分泌β细胞。同时CRE-COXP系统也排除了细胞融合的可能。但Choi等将骨髓移植到糖尿病小鼠体内后，虽然在胰腺内检测出了外源性骨髓来源的细胞，但这些外源细胞并不表达胰岛素，不过他们也没有否定间充质干细胞有向胰岛细胞转化的可能。Mathews等[17]认为，骨髓干细胞只是在胰腺内促进了胰岛的再生。以上不同结论的产生可能与实验者实验设计不同或实验条件不同有关。总结目前的研究，诱导机制多为以下方法和原理：Schuldiner等[18]经过一系列的研究发现，胰腺组织与神经组织有相似生长发育机制，认为神经生长因子可能是胰腺发育的关键信号。现阶段实验中体外诱导大多根据此原理。实验过程中发现表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子具有扩增神经干细胞的功能[19]，所以先用两者将骨髓间充质干细胞诱导成为nestin阳性细胞[20]，然后添加含有胰岛细胞赖以生存的条件培养液，为诱导骨髓间充质干细胞创造一个适宜的微环境。有研究表明，间充质干细胞可以在糖尿病鼠的肝脏、胰腺内定植存活，且植入后细胞数无明显差异，考虑可能与局部组织的血管通透性及组织器官的血流分布有关，此外还与组织器官自身表达释放引起间充质干细胞向靶器官迁移的趋化因子有关。常见的趋化因子包括基质金属蛋白酶、血小板衍生生长因子和SDF-1/CXCRE4等，其中SDF-1/CXCRE4对细胞的趋化作用得到了较多的证实。Xu等[21]报道，带有绿色荧光蛋白的间充质干细胞在体内移植6周后仍能存活。在标记有绿色荧光蛋白的间充质干细胞移植后28 d小鼠胰腺组织内发现了散在的绿色荧光蛋白阳性细胞；这些阳性细胞也能表达胰岛素，提示外源性间充质干细胞可以在糖尿病的小鼠体内转化为胰岛样细胞[22]。另有研究发现，骨髓间充质干细胞可以自然的产生一些细胞因子和生长因子，并可以提高周围细胞的存活率，这就是所谓的旁分泌机制[23]。新近的研究显示，旁分泌机制已被证实在组织再生和修复过程中扮演着重要角色。因此，有人推测，将骨髓间充质干细胞移植入受体糖尿病动物体内，它是通过像血管再生、细胞保护、抗炎、促有丝分裂及抗凋亡等旁分泌机制抑制受损的B细胞凋亡，并增强内源性B祖细胞的增殖分化。这种假说一旦被证实是正确的，对于糖尿病的分子和基因疗法又将是一个重大的突破。"

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