2.1   软骨细胞自噬在骨关节炎中的作用   自噬是一种自我降解的过程，是指细胞通过降解自身结构或物质使细胞存活的自我保护机制，对于维持机体新陈代谢的平衡具有重要作用，并且可调控细胞的生长、分化。虽然自噬不是细胞死亡的一种类型，但它对软骨的稳态很重要。一般来说，自噬通过使细胞适应应激条件来促进细胞存活，但这一过程也被认为是非凋亡性细胞死亡程序，参与了多种疾病的发生和发展。自噬与凋亡之间存在着复杂的交互调控——二者能被多种应激刺激共同激活、共享多个调节分子，甚至互相协调转化等。某些情况下，自噬抑制凋亡是细胞的存活途径，但自噬本身也会诱发细胞死亡，或与凋亡共同作用及在凋亡缺陷的情况下作为备份机制诱导细胞死亡，二者通路相互关联，互为调控。自噬发生最初，细胞内异常的细胞器和大分子被转运至溶酶体降解，内质网和高尔基体膜拉伸形成能包裹周围的细胞质或特定物质双层膜的自噬体。自噬体随后可与溶酶体融合形成自噬溶酶体，而其中包含的物质将被溶酶体内水解酶分解代谢，形成氨基酸、核苷酸等小分子，这些小分子物质可被细胞重复利用[9-11]。 研究发现，骨关节炎发展与软骨细胞自噬变化有关。随着骨关节炎的发展，软骨细胞异常代谢增加，导致凋亡大量发生，同时软骨出现退化，关节功能障碍加重[12-15]。在软骨细胞凋亡的同时，大量的基质金属蛋白酶和血小板反应蛋白分泌增加，这又会加重关节软骨的退变，加剧关节损伤。而自噬可去除这些有害物质，维持细胞的自我稳态，有利于软骨细胞生存，从而改善骨关节炎。但是在骨关节炎发生后，软骨细胞无法维持自噬能力[16-19]，最近的数据支持了这样一个观点，即骨关节炎中的自噬可以与凋亡结合发生[19-20]，实际上研究证明，在骨关节炎的早期阶段，来自浅表区的软骨细胞表现出凋亡和自噬标记物的表达增加，随着退化过程的进展，这些标志物在浅表区和中间区域的软骨细胞中联合表达，可能与软骨细胞修复缺陷有关。另一方面，在深部区域自噬和凋亡未增加，这可能与软骨细胞的替代有关，软骨细胞的异常钙化存在于骨关节炎晚期。因此，骨关节炎发病过程中细胞凋亡与自噬之间的功能关系是复杂的，即在骨关节炎的早期，自噬可能被激活作为一种避免细胞死亡的适应性反应；而在骨关节炎的晚期，这一过程也可能与凋亡同时激活作为细胞死亡的替代途径[20]。上述系列研究表明软骨细胞自噬参与了骨关节炎的发病进程。 2.2   软骨细胞自噬信号通路作用机制 2.2.1   哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路   mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，mTOR信号通路具有促进物质代谢、参与细胞凋亡、自噬、在多种疾病中扮演着不可忽视的角色。mTOR激酶是细胞自噬的负向调节因子，激活的 mTOR可通过Akt和MAPK信号转导通路抑制自噬，而mTOR则通过AMPK和p53信号转导通路的负性调节促进自噬的发生，mTOR激酶含有两种复合体，分别为mTORC1和mTORC2。mTORC1的上游调节因子是生长因子/PI3K/AKT信号通路[21]，生长因子如胰岛素样生长因子激活其同源受体，随后激活PI3K/AKT信号轴，活化的AKT直接磷酸化并因此影响结节性硬化症蛋白质，结节性硬化症2与结节性硬化症1形成的复合物能使Rheb由活化形式转变为非活化形式，从而抑制mTORC1的活性，而活化的AKT能够磷酸化结节性硬化症2从而阻止结节性硬化症复合物的形成，进一步导致mTORC1的激活[22-23]。从mTORC1到mTORC2之间存在多个负反馈电路，mTORC1可将上游信号整合后向下游p70核糖体蛋白s6激酶传递，S6K1磷酸化RICTOR，从而影响mTORC2活性，影响自噬体的形成和降解[24]。当mTOR通路被激活后，软骨细胞自噬活性将会受到抑制，软骨细胞活性也会降低，而细胞凋亡则增加，这将导致存活软骨细胞减少，加速骨关节炎发展[25-28]。 2.2.2   核因子κB信号通路   核因子κB可反式激活许多自噬相关基因(如Beclin-1)，因而核因子κB相关的炎症反应信号通路与自噬信号通路是有重叠的，核因子κB的激活除了减轻炎症、抗凋亡外，还有诱导自噬的保护机制[29-32]。许多细胞外刺激都可以激活核因子κB信号通路，通常胞质中的核因子κB与其抑制剂IκB结合，当被刺激时，IKKβ亚基被磷酸化并被激活，置换出的IκB会被蛋白酶体降解，从而活化核因子κB并使其易位进入细胞核。另外，转化生长因子激活激酶 1和转化生长因子β 活化激酶结合蛋白 2、转化生长因子β 活化激酶结合蛋白3参与IKK的活化，与自噬相关基因Beclin-1形成复合物，即将转化生长因子β 活化激酶结合蛋白2/转化生长因子β 活化激酶结合蛋白3激活IKK的同时，释放Beclin-1启动自噬。研究发现以SM7368抑制核因子κB通路，可激活细胞自噬，而以p65过表达激活核因子κB通路则会抑制细胞自噬。当核因子κB通路活化时，软骨细胞分泌基质金属蛋白酶水平增加，继而加速软骨基质的降解[24]。 2.2.3   p53信号通路   活化的P53会抑制自噬负调节因子mTOR，并通过形成自噬体以及微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)的酯化和剪切引起自噬。P53通过两种机制抑制mTOR调节自噬，一是以依赖P53的方式引起AMPK活化抑制mTOR，一是P53反式激活mTOR的负性调节因子。骨关节炎患者关节软骨组织中p53表达增强，且与Beclin-1在软骨组织中表达呈负相关。骨关节炎中p53的高表达能够抑制软骨细胞自噬，从而减弱软骨细胞对凋亡的抵抗能力，促进软骨细胞凋亡[33]。   2.3   软骨细胞自噬与骨关节炎治疗   由于软骨细胞自噬对骨关节炎有保护作用，激活/活化自噬将有益于骨关节炎的治疗，以下几种因子均对软骨细胞自噬有促进作用。 2.3.1   雷帕霉素   雷帕霉素是一种新型大环内酯类免疫抑制剂，可以抑制mTOR信号通路的mTORC1从而激活自噬。雷帕霉素能够增强软骨细胞自噬，减少软骨细胞肿瘤坏死因子α和白细胞介素1的表达以及抑制细胞凋亡途径进而增强细胞活性，减轻或缓解地塞米松对软骨细胞的损伤，对地塞米松诱导的细胞凋亡具有软骨保护作用。在小鼠骨关节炎模型中，雷帕霉素能在自噬过程中调节mTOR的信号转导，从而减轻对软骨的损伤程度。CARAMéS等[34]实验结果显示雷帕霉素通过抑制核糖体蛋白S6磷酸化(mTOR靶点)和激活自噬的主要标志物LC3，影响小鼠膝关节mTOR信号通路;与对照组相比，雷帕霉素治疗组的软骨退化严重程度显著降低(P < 0.01)，雷帕霉素治疗也维持了软骨细胞的数量，降低了关节软骨中ADAMTS-5和白细胞介素1β的表达。这些结果表明，雷帕霉素至少部分通过自噬激活来减轻实验性骨关节炎的严重程度，药物激活自噬可能是治疗骨关节炎的有效方法。除了保护关节软骨外，雷帕霉素还可以减轻小鼠膝关节滑膜炎的严重程度[35]。然而，长期使用雷帕霉素可能诱发其他疾病，这可能与其抑制免疫功能的能力有关[36]。最近的研究发现，在关节局部注射雷帕霉素可以延缓小鼠关节的退化，这可能是预防骨关节炎的一个潜在途径[37]。 2.3.2   氨基葡萄糖   正常情况下，关节软骨细胞能够合成足够的蛋白多糖等软骨基质，保持软骨正常的生化环境。骨关节炎初期，软骨基质合成代偿性增加，随着疾病的进展，基质合成代谢降低，导致基质流失，其中蛋白多糖代谢失衡较为严重，氨基葡萄糖在治疗骨关节炎时可缓解关节疾病、肿胀，提高关节活动性，具有良好的安全性[38-40]。CARAMéS等[34]研究表明葡萄糖胺可在体内外调节自噬途径的分子靶点，其增强作用主要依赖于Akt/FoxO/mTOR途径，具有抗炎作用，促进软骨细胞代谢，这些研究结果表明，氨基葡萄糖是一种有效的自噬激活剂，并将推动未来关于氨基葡萄糖在改善衰老相关细胞变化和支持关节健康方面的功效的研究。另外，SIMON等[41]研究认为长期使用葡萄糖胺对糖耐量受损的人没有危害。 2.3.3   羟基酪醇   羟基酪醇(hydroxytyrosol)作为一种天然抗氧化剂，广泛存在于橄榄科橄榄属植物的枝叶及果实中[42]，具有很强的清除自由基能力，可预防自由基引起的直接损伤以及紫外线诱导的氧化应激等，已应用于炎症性疾病的治疗。ZHI等[43]研究旨在确定羟基酪醇对软骨细胞自噬和炎症的影响，并阐明羟基酪醇是否通过SIRT6介导的自噬调节炎症反应。结果表明，羟基酪醇以浓度依赖的方式抑制肿瘤坏死因子α刺激的软骨细胞中白细胞介素1β和白细胞介素6水平;此外，羟基酪醇促进细胞自噬，增加肿瘤坏死因子α刺激的软骨细胞SIRT6的mRNA和蛋白表达水平。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤或抑制SIRT6表达可降低羟基酪醇对软骨细胞炎症反应的抑制作用。总的来说，这些发现表明羟基酪醇通过SIRT6介导的自噬抑制软骨细胞的炎症反应。CETRULLO等[44]发现，羟基酪醇可增加自噬相关蛋白的表达，在发生氧化应激反应时保护软骨细胞，减少软骨细胞DNA 损伤及死亡。孙天[45]发现可有效缓解软骨细胞晚期氧化蛋白产物氧化应激损伤，其作用是通过上调SIRT1信号通路而实现的；使用Sirt-1 siRNA特异性干扰后，羟基酪醇对自噬的作用消失。目前对于羟基酪醇的研究尚处于起步阶段，对于其应用研究也较少，但是其具有广阔的应用前景。 2.3.4   Torin 1   与雷帕霉素类似，Torin 1是mTOR的一种特异性抑制剂。CHENG等[46]研究旨在探讨关节内注射Torin 1对兔骨关节炎模型关节软骨退变的影响，结果表明，关节内注射Torin 1可减少胶原酶诱导的骨关节炎关节软骨退变，为预防软骨退变和治疗骨关节炎提供了新的治疗途径，但是关节内注射Torin 1对关节软骨退变的影响尚不清楚。CHENG等[46]使用自噬诱导剂Torin 1干预骨关节炎经典的细胞模型和动物模型，分别以定量实时PCR、组织学、透射电镜、蛋白印迹和免疫荧光进行评价，结果说明模型中软骨和软骨细胞的变性与自噬的缺失有关，Torin 1可通过激活自噬降低了软骨和软骨细胞损伤程度，并认为其具有成为骨关节炎治疗药物的潜力。 2.3.5   二氮嗪   二氮嗪作为一种线粒体ATP敏感性钾通道开放剂，可开放线粒体膜上的钾通道，使钾离子内流增加，线粒体膜去极化，从而导致钙离子内流减少，提高细胞的存活 率[47]；此外，二氮嗪可提高细胞对病理性活性氧的耐受性，从而对抗细胞的氧化损伤[48]。顾运涛等[47]研究表明二氮嗪对双氧水诱导的软骨细胞具有保护作用，可以改善细胞形态、提高软骨细胞生存率；同时具有保护大鼠膝关节软骨，减轻关节及滑膜炎症的作用。陈康等[49]研究表明二氮嗪对兔膝关节骨性关节炎的进展有一定的对抗作用。MENG等[50]在前交叉韧带并半月板内侧横断大鼠模型以及白细胞介素刺激的SW1353细胞模型中，证实了二氮嗪治疗可显著减轻关节软骨变性和SW1353细胞死亡，且细胞自噬明显恢复，同时可调节骨关节炎标志物Ⅱ型胶原A1、基质金属蛋白酶13、基质金属蛋白酶1以及解聚蛋白样金属蛋白酶5的表达；但其作用可被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤阻断，表明线粒体膜K+ATP开放剂二氮嗪可通过促进自噬起到骨关节保护作用。 2.3.6   白藜芦醇   白藜芦醇是一种对健康有益的天然多酚。大量的研究已经表明白藜芦醇能减轻炎症反应以及诱导癌细胞死亡,这些作用与它诱导细胞自噬有关[51]。季丹等[52]研究表明，白藜芦醇可抑制氧化应激状态下佐剂性关节炎大鼠软骨细胞增生，其作用机制可能与白藜芦醇诱导的软骨细胞自噬改变有关。QIN等[53]研究表明，Sirt1激动剂白藜芦醇能显著提高骨关节炎软骨细胞自噬水平，并上调Beclin-1及LC3蛋白及基因的表达，抑制软骨细胞凋亡，下调Bax表达，上调Bcl-2表达，降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性，进而阻断mTOR信号通路，抑制关节软骨细胞自噬和凋亡，结果表明白藜芦醇关节内注射延缓关节软骨退变，促进软骨细胞自噬，可能是通过调节AMPK/mTOR信号通路来实现的。YI等[54]的研究表明，白藜芦醇可调控核因子κB信号通路，从而抑制软骨细胞的炎症和基质降解。 2.3.7   其他   姜黄素不仅可通过阻断炎症因子介导的NLRP3信号通路抑制炎症，改善氧化还原体系，通过上调整合素促进软骨基质修复，同时其也可通过促进自噬和增加抗凋亡蛋白活性来抑制软骨细胞凋亡促进软骨细胞增殖[55]。MOUSSA等[56]的研究显示，富血小板血浆可明显增加软骨细胞的增殖，减少细胞凋亡，并增加自噬，此外还可导致基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5、白细胞介素6和环氧化酶2呈剂量依赖性下调，同时上调转化生长因子β、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、白细胞介素4、白细胞介素10以及白细胞介素13的表达。经白细胞介素1β刺激构建大鼠骨关节炎软骨细胞模型中，以30 mg/L臭氧干预后，软骨细胞活性增强，细胞中PPARγ及自噬相关蛋白LC3Ⅱ及Beclin-1的表达水平增加，而P62蛋白表达受到抑制，表明臭氧可促进骨关节炎软骨细胞自噬，且PPARγ在这一过程中起重要作用[57-58]。 2.4   中药复方制剂对软骨细胞自噬的影响   在临床上多种中药复方制剂被用于治疗骨关节炎，其中右归饮、透骨消痛胶囊、桃仁膝康丸、五味温通除痹胶囊等的作用机制与自噬相关。右归饮治疗骨性关节炎模型大鼠后，发现Beclin-1表达升高，mTOR 蛋白表达降低，同时凋亡蛋白Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3含量降低，说明右归饮治疗可诱导大鼠膝关节滑膜自噬表达上调，减少细胞凋亡[59]。以氯化钴诱导的原代软骨细胞作为体外骨关节炎模型，以200 mg/L透骨消痛胶囊溶液干预可使软骨细胞中Beclin-1、自噬相关基因3(autophagy-related gene 3，Atg3)、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12和LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ表达增加，同时促进自噬的发生，提示其可能用于减少骨关节炎软骨降解[60]。秦娜等[61]以改良Hulth法制备了大鼠膝关节骨关节炎模型，2周起给予桃仁膝康丸1.25 g/(kg?d)灌胃，连续用药12周后，发现桃仁膝康丸能明显降低膝关节骨关节炎大鼠的Mankin评分，上调软骨组织中Ⅱ型胶原A1和聚集蛋白聚糖的表达，降低基质金属蛋白酶13和解聚蛋白样金属蛋白酶5 mRNA的表达，还能增加ULK1、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达；表明其可通过延缓软骨细胞自噬缓解膝关节骨关节炎大鼠软骨的退变，但其激活软骨细胞自噬的机制还需进一步研究。五味温通除痹胶囊由桂枝、茯苓、淫羊藿等制备，姜辉等[62]以五味温通除痹胶囊治疗弗氏完全佐剂诱导佐剂性关节炎大鼠，结果显示，五味温通除痹胶囊不仅可减轻关节炎模型大鼠关节病理损伤，还可增加自噬相关因子Beclin-1和LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白水平，这说明五味温通除痹胶囊对骨关节炎的治疗作用与促进细胞自噬有关。 2.5   微小RNA(miRNA)   许多研究探索了miRNAs在骨关节炎中的功能和机制[62-64]。通过深入的研究，越来越多的miRNA被证实能调节骨关节炎软骨细胞的自噬。由于软骨细胞丢失是不可逆的，因此研究miRNAs在维持稳定自噬中的机制尤为重要。根据基因组学分析，miR-155在骨关节炎软骨中高度上调[65]。WAN等[66]研究表明miR-155的过表达增加了人鼻咽癌和宫颈癌细胞的自噬活性，敲除内源性miR-155能抑制缺氧诱导的自噬；此外，通过下调mTOR信号转导，  miR-155还可抑制细胞增殖，诱导G1/S细胞周期阻滞。总的来说，这些数据表明miR-155通过mTOR信号诱导自噬的发生。miR-30家族成员中，miR-30b对软骨细胞自噬的调节作用最为突出。CHEN等[67]的研究表明miR-30b是维持肿瘤坏死因子α诱导的自噬和凋亡之间平衡的关键因素。抗   miR-30b增强了ATDC5细胞的自噬作用，减轻软骨的降解，对肿瘤坏死因子α诱导的ATDC5细胞凋亡具有保护作用。因此，抗miR-30b可提高炎症期间的细胞存活率，并对骨关节炎等炎症性疾病具有治疗潜力。根据miR-146a通过Bcl-2诱导软骨细胞自噬的基本实验结果以及miR-146a与Bcl-2mRNA的错配[68]，大量研究证实，TRAF6和IRAK1是miR-146a的直接靶点，是缺氧诱导软骨细胞自噬中Bcl-2调控的中间因子[69]。考虑到这些结果，缺氧诱导因子1α的诱导作用值得重视。在骨关节炎和正常软骨中均可检测到缺氧诱导因子1α[70]，其表达水平可能受到炎性细胞因子或生长因子的影 响[71]。一般来说，缺氧诱导因子1α作为一个上游位点，直接作用于miR-146a，调节下游基因，诱导软骨细胞自噬。用双链miRNA-335-5p模拟物/抑制剂转染人骨关节炎软骨细胞后，细胞中miRNA-335-5p表达明显降低，细胞存活以及自噬相关因子的表达显著增加，且炎症递质表达减少，3-甲基腺嘌呤可以抑制过表达miRNA-335-5p的作用，说明  miRNA-335-5p可通过激活自噬来减轻人骨关节炎软骨细胞的炎症反应[72]。以miRNA-335-5p作为骨关节炎诊断和治疗的靶点在未来临床研究中具有重要意义。"