2.1   单细胞RNA测序原理   自TANG等[18]于2009年首次使用单细胞RNA测序分析基因表达谱以来，目前该技术已广泛用于肿瘤、免疫学、神经生物学等领域[11-14]，完整的单细胞RNA测序实验包括单细胞分离、文库制备和数据分析3个部分。 2.1.1   单细胞分离   单细胞分离是单细胞RNA测序技术的关键步骤，决定了研究的成败。目前有多种方法可进行单细胞分离，包括显微操作法、微流控法、荧光激活细胞分选法(FACS)，激光捕获显微切割法(LCM)等，其中荧光激活细胞分选法和微流控法是最常用的方法。荧光激活细胞分选法(比如Smart-seq、CEL-seq/CEL-seq2等分离技术)是基于细胞表面特异性分子标记或利用预先用荧光标记的细胞光散射特性并通过流式细胞术来进行单细胞分离，然后将得到的单细胞分配到96或384孔板中进行RNA测序并建立文库；基于荧光激活细胞分选法分类的优势之一是能够在特异性和非特异性分离之间进行选择，具有高准确度[19]，但其一次检测到的细胞数量有限。此外该方法也有几个明显的缺点：第一，其需要大量的细胞悬浮液，这降低了获得低丰度细胞的速度；第二，检测细胞数量有限导致每个细胞的测序成本明显升高。相反，最近开发的微流体技术一次可以捕获并处理大量细胞[20-21]；该技术使用独特的标记磁珠与单个细胞结合形成单个液滴；当细胞裂解后，磁珠上的标记与释放的mRNA杂交，并反转录成带有独特标记的cDNA，然后构建测序文库。该方法具有样品消耗少、分析速度快、自动化程度高等显着优势，而且还可以将反应、预处理、检测等过程集成到微流体系统集中完成，由于其低成本和高通量，目前已成为主流的单细胞分离方法。 2.1.2   文库制备   单细胞RNA测序文库制备首先需要将单个细胞中的RNA通过PCR反转录成cDNA，由于单个细胞中的总RNA含量非常少，仅约10 pg[22]，故直接对单个细胞的RNA进行测序不太可能[23]，因此首先需要对RNA进行扩增，然后再进行测序、建立文库。既往进行全基因组扩增的方法主要包括3种：PCR技术、多重置换扩增技术及多次退火环状循环扩增技术(表1)。"

随着测序技术的发展，最初使用全转录组测序对单细胞RNA进行扩增以获得基因表达谱[19-20]，但其鉴定的基因及未知的剪接点有限；TANG等[18]改进了单细胞全转录组扩增方法，使用新一代测序技术对单细胞全转录组进行扩增，该技术使用寡脱氧胸腺苷酸作为引物来进行反转录，然后通过PCR技术选择性扩增聚腺苷酸化mRNA。SMART-seq技术则使用莫洛尼鼠类白血病病毒(moloney murine leukemia virus，MMLV)反转录酶来构建全长cDNA文库[26]，其最大的优点是能将单细胞中的RNA扩增为全长cDNA，从而发现可变剪切的外显子，灵敏度低是其最大的缺点；而改良的SMART-seq2技术可以同时对数百个细胞的转录组进行测序，明显提高了测序的效率及灵敏度。近几年来被广泛使用的基于液滴的微流控技术可以对成千上万个细胞同时进行测序，并且可以通过消除扩增偏差来提高全基因转录组测序的准确性；独特的分子标识符标记技术的应用可以对每个基因的来源进行追踪，以此来区分细胞类型及进行复杂的分析。 2.1.3   数据分析   最后，将测序得到的数据进行统计分析，其中无监督聚类分析是最常使用的分析方法之一，可以根据细胞基因表达的不同来揭示细胞间的异质性并对其进行分类，以寻找出感兴趣的基因及细胞进行研究，对探索相关疾病的发生发展、预防及指导临床治疗具有重要意义；此外，可以根据特征基因的表达来推断出细胞种类及其来源，甚至发现新的细胞类型，例如：PARK等[27]使用单细胞RNA测序技术对肾脏组织进行测序发现3个新的细胞种类；还可以根据基因的表达对细胞的发育轨迹进行追踪、筛选差异基因以及进行拟时序分析等[28]。 2.2   单细胞RNA测序在骨骼系统中的应用   目前单细胞RNA测序在肿瘤、免疫学、神经生物学等领域研究中取得较大的进展[11-14]，并逐渐开始用于骨骼系统生物学相关研究。 2.2.1   单细胞RNA测序在骨骼干细胞中的应用   骨骼组织正常的发生发育及创伤后的自我修复对于维持人体的完整及肢体的功能具有重要作用，但对参与其中的具体细胞类型及是否有骨骼干细胞的参与目前尚不清楚。CHAN及其同事[29]对围产期小鼠生长板及周围细胞进行单细胞RNA测序，发现被分离出来的AlphaV(CD51)+ Thy1(CD90)‐ CD105‐ CD200+细胞具有多能骨骼干细胞的特性，能进行自我更新，并将其称为小鼠骨骼干细胞(mSSCs)，随后他们通过谱系追踪实验发现骨骼干细胞确实存在于生长板的静息区[30]；最近他们通过对人类胎儿生长板进行单细胞RNA测序发现在生长板肥大前区和肥大区中的细胞表达小鼠骨骼干细胞特异基因的人类直系同源基因，故将该细胞称为人类骨骼干细胞(hSSCs)，并推断人类骨骼干细胞也存在于生长板中[31]。通过单细胞RNA测序证实了骨骼干细胞的存在，发现其在生长板及骨骼完整性的维持中起着重要作用，这将对治疗创伤引起的骨骼组织损伤提供新的临床见解，但骨骼干细胞是通过何种细胞分子信号或通路参与骨骼组织的维持及修复尚未能阐明，仍需进一步的研究。 生长板在骨的生长与维持中起着重要作用，但存在于靠近软骨膜生长板边缘的“交界性”软骨细胞在体内的具体作用及命运却不得而知，有研究报道称在软骨膜附近的特殊微环境中，生长板周围的“边缘”软骨细胞可以在培养条件下产生成骨样细胞[30]，为了探究生长板周围“边缘”软骨细胞的性质及潜在的功能，MIZUHASHI等[32]对新生小鼠生长板进行单细胞RNA测序发现了一种新的软骨细胞群，将其称为“交界性”软骨细胞，后续的血统追踪实验证实其表现为短暂的间充质前体细胞，发现“交界性”软骨细胞早期可以在干骺端分化产生成骨细胞及骨髓基质细胞，到成年期后其细胞数量明显减少，表现为短暂的分化过程；而TAKAHASHI等[33]和MIZUHASHI等[32]利用单细胞RNA测序技术也分别标记和描述了牙囊和长骨生长板中的间充质细胞群，这有助于理解骨的生长发育及停止的全过程，以及进一步了解这些细胞群的起源、命运及细胞间的异质性。 骨膜是附着在骨表面的坚固结缔组织包膜，有丰富的血管与神经，对骨的营养及新陈代谢具有重要意义，另外其膜内成骨的能力对骨折迅速愈合尤为重要，虽然对骨膜进行了大量的研究，证实了其基本的细胞类型及相关功能，但是否存在其他细胞亚型及其作用尚无法得知。单细胞RNA测序可以从细胞分子层面去解决上述问题。DEBNATH等[34]对骨膜组织进行单细胞RNA测序，发现了一种被组织蛋白酶K(CTSK)标记的新的骨膜干细胞群体，该细胞群与存在于骨膜腔的间充质干细胞不同[35-36]，它们不表达有造血功能的间充质细胞相关标记物，如LEPR或CD146，且只在基线时介导膜内骨化。他们将骨膜细胞聚类为4组：第1组高表达Sox9和Col2a1；第2组表达成骨细胞标记物，如Bglap和Alpl；第3组表达Ly6a；第4组以高表达α-平滑肌肌动蛋白(Acta2)为特征。他们发现被鉴定为骨膜干细胞的细胞几乎都高表达软骨细胞的特异性转录物Sox9和Col2a1[37]。另外有研究也发现Sox9和Col2a1在长骨及颅骨的骨膜细胞中高表达[38-39]，并且Sox9缺失将严重影响骨的形成[40]，因此DEBNATH等[34]推测Sox9和Col2a1可以作为骨膜干细胞的标记物；同时第2组成骨细胞标记物(如Bglap和Alpl)的高表达也确定了骨膜干细胞可以产生成骨细胞，并发现了Ifitm5基因的高表达，这表明Ifitm5可能成为单细胞RNA测序研究中用于鉴定成骨细胞的重要标志物；另外他们还推断Acta2+细胞可能是骨膜干细胞与成熟成骨细胞过渡的中间祖细胞，但需进一步的体外移植研究来验证。因此可以通过单细胞RNA测序去鉴定新的细胞类型及细胞标志物，从而分析该细胞类型的潜在功能。 2.2.2   单细胞RNA测序在肢体发育中的应用   哺乳动物肢体的正常发育，涉及到一系列复杂且相互协调的分子过程，例如以高度协同及时间依赖的方式进行各种基质蛋白和信号分子的合成与降解，虽然在肢体发育的某些方面已经有相关阐述，但参与其中的相关细胞亚群的发育轨迹、在肢体发育过程中的潜在分化能力及相关功能暂不清楚。单细胞RNA测序技术可以采用拟时序分析来阐明在肢体发育过程中细胞亚群与时间、空间的变化关系，更加全面的了解肢体细胞的发育轨迹及细胞成熟的连续性。KELLY等[41]对胚胎小鼠后肢行单细胞RNA测序，发现在不同时间点包含不同的细胞类型，包括：软骨前体(Hoxd13和Col2a1)、骨/肌腱前体(Tbx13和Col1a1)、皮肤(Krt14)、脉管系统(Cdh5)、血液(Lyz2)、生长板(Col10a1)和肌肉(Myog)，并且这些细胞类型在不同时间点所占百分比也不尽相同，还确定了小鼠后肢中发育的5个主要分支。KELLY等在胚胎的第13.5和15.5天发现了表达Col10a1的细胞簇，但在胚胎第18.5天时未发现，可能是由于细胞捕获受限而导致的细胞类型脱落，也可能是肥大软骨细胞在最成熟的时间点更类似于骨骼或软骨细胞；另外他们并未发现与关节形成相关的重要标记基因Gdf5，有可能是由于细胞捕获的局限性所致，但也有研究表明Gdf5本身仅在少量细胞中表达[42]。虽然单细胞RNA测序在单细胞分离过程中可能存在捕获细胞类型不全的现象，但可以为已捕获的不同类型细胞之间的相互作用提供新的见解，以透彻了解组织发育过程，促进组织修复或最终促进组织或肢体再生。 2.2.3  单细胞RNA测序在肌腱和韧带中的应用   肌腱及韧带的正常发育对关节活动的维持具有重要意义，但对参与肌腱及韧带的细胞类型组成及创伤后组织修复的内在细胞异质性仍不清楚，为了探讨及解决上述相关问题，SWANSON等[15]对小鼠肌腱进行单细胞RNA测序，他们共鉴定出11种不同的细胞类型，其中包括以前尚未报道过的3种成纤维细胞类型，将其分别称为肌腱成纤维细胞1和2，以及连接成纤维细胞；令人惊奇的是他们发现这3种成纤维细胞都高表达Ⅰ型胶原蛋白，另外连接成纤维细胞还高表达Col22a1，并且支持表达跨膜蛋白CD146的周细胞是成人肌腱成纤维细胞祖细胞群的观点[43]。肌腱组织细胞亚群之间和内部显著的异质性，可能有助于加深对肌腱细胞外基质的组装和维持的理解；另外成纤维细胞专一性地产生肌腱细胞外基质的不同成分，这可能给肌腱病变的治疗提供新靶点。此外，多项研究发现Scx、Tnmd和Mkx是肌腱发生发育过程中重要的标记[44-45]，但SWANSON等[15]和KELLY等[41]的研究结果却与之相反，他们通过单细胞RNA测序和RNA ISH检测并未发现Scx、Tnmd和Mkx在肌腱细胞中广泛表达；SWANSON等[15]与DISSER等[46]在髌骨肌腱中未发现成骨细胞标记物骨唾液蛋白(Bsp)、Msx2或osterix，这与之前的报道称在髌骨肌腱中发现了大量成骨细胞的结果相悖[47]。故单细胞RNA测序分析可以从细胞分子层面去验证或者推翻先前研究的结果，也可以寻找出新的细胞分子标志物来发现细胞间的异质性，并进一步阐明其相关功能。 2.2.4   单细胞RNA测序在骨骼肌中的应用   骨骼肌是一种复杂的异质组织，由多种细胞类型组成，除了参与运动外，还影响人体的免疫、代谢和认知等方面，了解骨骼肌的细胞组成类型及其潜在的功能将有助于加深肌肉对运动的各种影响以及肌肉相关疾病的认识。多项研究表明Mesp1细胞在心脏及骨骼肌的发生发育中起着重要作用[48-50]；而有趣的是，HAREL等[49]和CHAN等[50]发现来源于Mesp1+祖细胞的肌肉干细胞主要存在于颅面部的骨骼肌中，几乎不存在于躯干及后肢，这打破了传统的认知观念，为了深入了解头面部和躯干/四肢骨骼肌肉发育过程的差异，PENALOZA等[51]对Mesp1诱导的骨骼肌细胞进行单细胞RNA测序，对骨骼肌源性祖细胞标志物PDGFRα和VCAM的动态观察发现Mesp1诱导的骨骼肌细胞分化是从PDGFRα+VCAM- (Tcf15+)到PDGFRα+VCAM+(Myf5+Tbx1+Pitx2+)，然后再到PDGFRα- VCAM+(Myod1+ Myog+)的过程，同时他们还观察到在Mesp1诱导的骨骼肌细胞分化时出现了不同的细胞亚群和非肌源性细胞，包括一些未分化或分化早期的中胚层及外胚层细胞，以及表达于胚胎/胎儿成肌细胞中的蛋白Acta2和Tagln，这说明Mesp1诱导的骨骼肌成肌祖细胞可能是胚胎性质的。通过单细胞RNA测序可以重建不同细胞亚群的单细胞轨迹来预测细胞的命运，这将有助于破译组织发生的分子机制，从而产生这种独特的细胞类型为未来的再生医学提供见解。 骨骼肌组织中不同细胞亚群内的细胞组成是否会随着年龄、性别、运动等变化尚不清楚，单细胞RNA测序可以通过对不同年龄人群及各种干预后的骨骼组织细胞进行深入分析，来剖析其细胞类型比例变化并推测其潜在的功能。RUBENSTEIN等[16]利用单细胞RNA测序技术在人的股外侧肌中发现了11种人类骨骼肌单核细胞亚群，包括两种新的成纤维脂肪祖细胞(FAP)亚群：纤维蛋白1+(FBN1+)和lumican+(LUM+)FAP亚型，并且揭示了特定单核细胞类型比例的显著变化与年龄、性别、急性运动和训练有关，这将有助于对运动的各种影响以及肌肉疾病的病理生理学的了解；相反，BARRUET等[52]和DE MICHELI等[53]的研究发现肌纤维类型组成和基因表达并不会根据供者的年龄而改变，这一冲突可能需要进一步的研究去探索。另外，RUBENSTEIN等在小鼠的骨骼肌中也发现了同样的成纤维脂肪祖细胞亚型，并且在小鼠的FBN1+FAP亚型中发现了在人类中没有的特异性标记物TEK。此外，小鼠体内发现的具有软骨生成/成骨潜能的Tie2+FAPs，可能是骨骼肌异位骨化的主要促因，而Tie2蛋白的基因前体TEK在小鼠的FBN1+FAP亚型中表达，因此RUBENSTEIN等推测FBN1+FAP亚型可能在人类的骨骼肌异位骨化起作用。BARRUET等[52]在人骨骼肌卫星细胞中发现了一种新的亚群：CAV1+卫星细胞。CAV1先前已被证明由小鼠卫星细胞表达[54-55]，BARRUET等通过对CAV1+卫星细胞中静止基因标记物的表达发现CAV1+卫星细胞与人类卫星细胞的静止和细胞黏附特性有关，可以抵抗细胞的活化、维持卫星细胞生态位及表型。 2.2.5   单细胞RNA测序在创伤后骨组织修复中的应用   骨折后促进骨形成及愈合过程中细胞内分子改变及细胞间相互作用的具体机制尚不清楚，在组织修复过程中需要细胞增殖与凋亡达到一个新的平衡，有研究表明临床中发现的骨折不愈合很大程度上是由于缺乏足够的祖细胞所造成的[56]；而骨形态发生蛋白2能够在体外扩增骨骼干细胞并在软组织中诱导骨骼干细胞再生，是骨形成和骨折愈合所必需的[57-58]。有研究报道称人骨膜来源的细胞(hPDC)可以通过激活骨形态发生蛋白信号来增强异位体内骨形成[59]，而激活的骨形态发生蛋白可进一步增强骨愈合能力[60]，并且人骨膜来源的细胞的成骨潜能可能与细胞内骨形态发生蛋白1型和2型受体的mRNA转录升高有关[61]。但骨形态发生蛋白在骨折愈合中的具体分子机制、参与的信号通路及激活下游何种靶分子目前尚不清楚，单细胞RNA测序可以在单个细胞水平获得基因组全转录信息，以此来探究参与骨折愈合过程中的相关通路及分子机制。BOLANDER等[62]对经无血清处理的人骨膜来源细胞进行单细胞RNA测序及体外验证实验发现，激活的骨形态发生蛋白可进一步引起下游骨软骨祖细胞、CD34+祖细胞、软骨细胞和BMPR2+骨软骨祖细胞簇中的骨形态发生蛋白2型受体表达明显上调，然后进一步诱导磷酸核糖焦磷酸合成酶1基因表达、增加谷氨酰胺的消耗及谷氨酰胺酶的表达来增强骨形成及骨愈合能力，这将为临床中治疗骨折不愈合或延迟愈合提供新的靶点。 2.2.6   单细胞RNA测序在骨关节性疾病中的应用   骨性关节炎、类风湿性关节炎及银屑病关节炎等是常见的骨关节性疾病，其主要病变在关节的软骨及其滑膜组织，先前的研究已经报道在关节软骨中存在几种不同亚型的软骨细胞，包括增殖性软骨细胞(ProCs)、肥大前软骨细胞(preHTCs)、肥大软骨细胞(HTCs)、纤维软骨细胞(FC)、衰老细胞(SNCs)[63-64]，它们分布在软骨中的不同区域并具有不同的功能；另外成纤维细胞在炎症性疾病生物学中具有重要意义，但对其潜在的细胞异质性来源了解甚少[65]。虽然发现了不同的细胞亚群与某些骨关节疾病相关，但对于某个特定疾病中存在的细胞亚群的了解尚不完全清楚，同时上述细胞群在疾病的发病机制中的作用也尚不清楚。单细胞RNA测序可以从单个细胞基因表达的差异去剖析、了解不同细胞亚群在疾病的发生发展全过程中的作用机制。最近多项研究利用单细胞RNA测序技术对骨关节炎滑膜组织进行测序后确定了组织中主要的一些细胞亚群，并发现了以前尚未报道过的成纤维细胞亚群，它们分布在滑膜组织的不同区域，其发挥的作用也不一样，揭示了疾病的特定病理改变与不同细胞亚群之间的关系[66-69]。另外不同的疾病其滑膜组织内细胞亚群组成也不尽相同，且同一类型细胞亚群在不同的疾病中具有不同的病理改变及作用。STEPHENSON等[67]对类风湿性关节炎患者滑膜组织进行单细胞RNA测序，将获得的细胞归类为13个亚群，鉴定出多种以前尚未报道过的新的细胞亚群，同时推测出其在疾病过程中可能发挥的作用。WADE等[70]应用单细胞RNA测序技术在银屑病关节炎滑膜组织中分离出来一种多功能性T细胞的特定亚群的富集即：CD4+CD161+ T细胞，这些细胞表达多种细胞因子：包括白细胞介素17A、干扰素γ、肿瘤坏死因子、集落刺激因子，并且这些细胞因子与银屑病关节炎的疾病活动密切相关。单细胞RNA测序在滑膜组织中的运用及发现可以为未来滑膜性疾病的诊断及治疗提供新的靶点。 最近JI等[17]对骨性关节炎患者关节软骨进行单细胞RNA测序，鉴定了以前尚未发现的3种新的软骨细胞簇：即效应软骨细胞(EC)、调节性软骨细胞(RegC)和体内稳态软骨细胞(HomCs)，以及软骨细胞簇的新标记物，其中效应软骨细胞、调节性软骨细胞和体内稳态软骨细胞可以保护软骨延缓骨性关节炎的发展，而之前报道过的软骨细胞亚群可以促进骨性关节炎的发生；此外，他们发现体内稳态软骨细胞高表达人类昼夜节律标志物，如PER1和SIRT1[71]，以此推断该软骨细胞群可能在骨性关节炎软骨的昼夜节律调节中起着重要作用，这为骨性关节炎的治疗提供了新的靶标及方向。"