有氧运动干预自发性高血压模型大鼠主动脉血管内皮细胞c-Src mRNA表达和c-Src的活性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.49.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：原癌基因c-Src在调节高血压等心血管系统疾病中起着重要的作用，目前尚未看到有关运动干预影响主动脉血管内皮细胞c-Src的表达和活来调节高血压的研究。

目的：观察有氧运动对自发性高血压大鼠主动脉血管内皮细胞c-Src mRNA表达和c-Src活性的影响。

方法：8只雄性Wistar大鼠作为正常对照组，16只自发性高血压大鼠随机分为自发性高血压组8只，自发性高血压运动组8只。自发性高血压运动组每天进行90 min无负重有氧游泳运动，6 d/周，共8周；正常对照组和自发性高血压组大鼠不做游泳运动。每周测定大鼠血压1次，8周后，测定各组大鼠主动脉血管内皮细胞c-Src mRNA表达和c-Src活性。

结果与结论：与自发性高血压组相比，自发性高血压运动组血压明显降低，主动脉血管内皮细胞c-Src mRNA表达和c-Src活性明显升高。与正常对照组相比，自发性高血压运动组大鼠主动脉血管内皮细胞c-Src活性和c-Src mRNA表达高于正常对照组和自发性高血压组(P < 0.01)。结果提示有氧运动可以促进自发性高血压大鼠主动脉血管内皮细胞c-Src活性和c-Src mRNA表达的增加。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织工程, c-Src活性, c-SrcmRNA, 高血压, 运动

Abstract:

BACKGROUND: Proto-oncogene c-Src plays an important role in regulating cardiovascular diseases such as hypertension. At present, there were no studies concerning exercise intervention effects on c-Src expression in aortic endothelial cells so as to regulate hypertension.

OBJECTIVE: To observe the effects of aerobic exercise on c-Src mRNA expression and c-Src activity in the aorta blood vessel endothelial cells of spontaneous hypertensive rats.

METHODS: A total of 8 male Wistar rats were considered as normal control group. Sixteen spontaneous hypertensive rats were randomly assigned to 8 rats as spontaneous hypertension group and 8 rats as spontaneous hypertension exercise group. Rats in the spontaneous hypertension exercise group carried on 90 minutes unloaded aerobic swimming every day, 6 days a week, for 8 weeks. The rats in the normal control group and spontaneous hypertension group did not swim. Blood pressure of rats was measured once a week. 8 weeks later, the c-Src mRNA expression and c-Src activity were determined in aortic vascular endothelial cells of rats in each group.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with spontaneous hypertension group, blood pressure was lower, but c-Src mRNA expression and c-Src activity were significantly higher in the spontaneous hypertension exercise group. The c-Src activity and c-Src mRNA expression were higher in the spontaneous hypertension exercise group than normal control group and spontaneous hypertension group (P < 0.01). Results indicated that aerobic exercise can promote the increase in c-Src activity and c-Src mRNA expression in aortic endothelial cells of spontaneous hypertensive rats.

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Key words: hypertension, rats, inbred SHR, proto-oncogenes, genes, src

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

细胞原癌基因c-Src(非受体酪氨酸激酶)最早在1976年由Mike Bishop和Harold Varmus发现，是正常细胞中的固有基因，通常处于较低的水平，c-Src蛋白主要聚集在心血管组织^[1]。c-Src做为细胞信号传导途径中的关键分子，可被血管切应力直接激活，对细胞的周期控制、细胞增殖、细胞分化、细胞存活和细胞迁移等有着要的调控作用，并与人类的肿瘤、心脑血管、神经等许多疾病有着密切关系。c-Src基因的表达产物c-Src蛋白是一种非受体酪氨酸激酶，主要分布于细胞的内膜系统中，能够专一的磷酸化底物蛋白中的酪氨酸残基。真核细胞中还发现许多与c-Src高度同源的蛋白，包括Lyn、Fyn、Lck、Hck、Fgr、Blk、Yes和Yrk等，它们都具有酪氨酸激酶的活性，被统称为Src激酶家族。Src激酶家族在细胞中广泛表达，但存在表达水平及组织特异性上的差异。

目前研究发现，c-Src是血管切应力变化导致内皮一氧化氮合酶转录活性提高的核事件之一^[2]，c-Src在应答切应力作用于血管时的作用，远大于病理中所起的作用。近年来，许多学者对血管切应力介导内皮型一氧化氮合酶表达的信号转导通路进行了大量实验研究，并取得了一定成就。目前大量资料研究表明c-Src在正常细胞信号通路，尤其在切应力作用于血管内皮上时引起c-Src的激活，对一系列下游信号的激活，起到极其重要的作用^[3]，可以调控一氧化氮合酶的表达。C-Src参与调节血管内皮细胞收缩，细胞骨架重组，粘着斑形成及细胞迁移和生长，因此在高血压等心血管疾病的血管损伤和再狭窄中发挥重要作用^[4-5]。

实验已经证明，c-Src在应答血管切应力中起重要作用，主要是促进内皮型一氧化氮合酶的表达。通过对血管受到切应力作用下内皮型一氧化氮合酶的mRNA表达信号通路的研究表明，c-Src参与了内皮型一氧化氮合酶 mRNA表达信号通路和稳定性的控制^[6]。血液流动加快导致的血管切应力的增加是长期有氧运动改善血管内皮功能的一个主要机制。运动锻炼通过提高血管的切应力，激活了多种信号转导途径，从而改善了内皮功能。内皮细胞膜上的机械传感器，如小窝蛋白、G-蛋白、离子通道和整合素等感受切应力的变化，将刺激转化为生化信号，然后激活了c-Src途径^[7]，导致内皮型一氧化氮合酶活性的提高。此外，还使内皮细胞的抗氧化物酶Cu/Zn以及谷胱甘肽过氧化物酶的合成增加^[8]。

曾锦章等^[9]研究发现，胃黏膜损伤后PTK(非受体型PTK主要有两大家族：Src家族及Jak家族)和一氧化氮合成酶活性呈现相似的变化规律，应用PTK选择性抑制能使胃黏膜一氧化氮合酶活性、组织和胃液一氧化氮水平分别下降25.4%，22.5%和19.3%。表明PTK可能参与一氧化氮合成酶合成的调节。但PTK激活后导致细胞内一氧化氮合酶活性变化的机制仍不清楚，推测PTK激活后导致细胞内Ca²⁺浓度增高可能是其重要的机制之一，因为细胞内Ca²⁺浓度增高是受体型PTK激活后细胞内第二信息传递者，而细胞内一氧化氮合酶活性的提高有赖于细胞内Ca²⁺浓度的增高^[10]。一氧化氮合酶激活后合成一氧化氮增加，而一氧化氮反过来又对细胞内Ca²⁺浓度起负调控作用，因而生长因子受体的激活、一氧化氮的合成、以及Ca²⁺稳态组成细胞内信号传导的一个复杂的调节网络。因此表明，c-Src在调节内皮型一氧化氮合酶表达对血管内皮细胞起到重要作用。

本实验通过观察规律的运动对自发性高血压大鼠主动脉血管内皮细胞c-SrcmRNA表达和c-Src活性的影响，来分析其与主动脉血管内皮功能的关系，为降低血压、改善血管内皮细胞功能的作用开拓新的领域和途径提供新的理论依据。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年12月至2013年9月在扬州大学完成。

材料：6周龄雄性大鼠24只，体质量170-200 g，其中8只Wistar大鼠为正常对照组，16只自发性高血压(Spontaneously Hypertensive Rats，SHR) 大鼠，实验动物均由北京维通利华公司提供，许可证号：scxk2012- 0001。

实验方法：

实验动物与分组：取雄性Wistar大鼠8只为正常对照组，雄性自发性高血压大鼠16只，随机分为自发性高血压组和自发性高血压运动组各8只，实验大鼠均采用分笼饲养，每笼4只，使用塑料饲养笼并配不锈钢罩、不锈钢吸水管和塑料吸水瓶，大鼠均按国家标准固定混合饲料喂养，每天各组大鼠自由进食饮水，自然光照，实验期间动物实验室保持温度22-24 ℃，湿度40%-60%。

运动方式：自发性高血压运动组进行90 min无负重有氧游泳运动，游泳缸大小为150 cm×70 cm×60 cm，水深60 cm，内壁光滑，水温(31±1) ℃，适应性游泳1周，时间分别为10，30，45，60，75，90 min，以后游泳90 min/d，6次/周，直至游满8周。

血压测定：实验大鼠均在清醒状态下，采用无创伤鼠尾尾套加压阻断法测量大鼠血压，以鼠尾光电容积脉搏波随尾套压力下降而重新出现作为收缩压的检测信号。按照RBP-IB型大鼠血压计说明书进行测量整个过程及注意事项。具体操作方法为将待测大鼠放入(40±1) ℃的预热箱，预热10-15 min，取出并装入大小合适的固定网套内，然后将其固定在滑动式大鼠固定台上，尽量将大鼠固定牢靠，选择合适的尾套轻松地套住大鼠尾根，鼠尾放在探头底槽正中平贴光敏内电阻，防止左右摇摆，轻轻盖上探头上盖，使整个尾部没有任何卡压，让大鼠休息 2 min左右使其安静后测量血压，首先用气球加压阻断鼠尾血流，常规设定阻断压力高于大鼠实际血压30 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)左右，待脉搏波消失后，以每秒下降速度2.0-3.0 mm Hg均匀放气，同时观察血压表的指针，听到脉搏波恢复到先前节律的第一搏动声音点的血压即为大鼠的收缩压。每只大鼠重复测量两三次，每次间隔1 min左右，取平均值作为收缩压值。于实验前、实验后5周和8周进行测量。

指标测定：

样本采集与处理：按稍加改进的Jaffe等方法^[11]，采用外翻胶原酶消化法分离主动脉血管内皮细胞。大鼠麻醉后，剖开腹腔，分离主动脉至髂总动脉分支，在靠近髂总动脉分支处截取1.5 cm长血管，放入D-Hanks液中。D-Hanks液冲洗血管腔，并无菌剥除血管外膜的脂肪和纤维组织。把血管移入另一有培养液的培养皿中，用镊子外翻血管使内膜暴露，用灭菌线扎紧血管两端。然后转移血管到含有2.5 g/LⅡ型胶原酶的培养皿中，放入37 ℃水浴箱中，分别于15，30，45，60 min及2 h时收集胶原酶，1 500 r/min离心10 min，弃上清，用PBS洗涤1次，即提取到分离的血管内皮细胞。

RT-PCR检测大鼠心肌c-Src mRNA水平：按照Qi等的方法用Trizol一步法提取各组大鼠血管内皮细胞总RNA^[12-13]，紫外分光光度计(SDU-68型)定量。RT反应：20止反应体系，按照RT试剂盒操作步骤进行，合成cDNA。PCR反应：20止反应体系，95 ℃预变性3 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30个循环；72 ℃充分延伸 7 min，结束温度为4 ℃。取PCR的产物5 μL，以1.5%琼脂糖电泳分离后，溴乙锭染色后，用凝胶成像及分析扫描仪测258 bp(c-Src产物)和291 bp(β-actin产物)的吸光度，以β-actin mRNA标准化。

c-Src活性测定：按照Rijksen方法改良提取c-Src^[14]。将新鲜分离的血管内皮细胞立即悬于溶液中(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，含1 mmol/L EDTA、10 mmol/L DTT、 1 mmol/L PMSF、50 mg/L Aprotinin、10%甘油)，冰浴中超声破膜，离心700 r/min 10 min(4 ℃)，除去细胞核及完整细胞。上清离心4 000 r/min 1 h(4 ℃)，所得上清即为胞浆c-Src提取物。使用紫外吸收法测定蛋白样品的浓度^[15]。检测过程严格按照试剂盒要求完成。

主要观察指标：①各组大鼠血压测量结果。②运动后自发性高血压大鼠主动脉血管内皮细胞c-Src mRNA水平及c-Src活性变化。

统计学分析：由第二作者完成，实验结果均以x(_)±s表示，采用SPSS 13.0统计分析软件进行单因素方差分析，均数的比较用独立样本T 检验，统计学显著性为P < 0.05，非常显著性为P < 0.01。

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讨论

国内外大量的研究证实，运动作为高血压患者的一种非药物辅助治疗的方法之一，具有一定的降压作用^[16-18]。无论是动物实验还是人群研究均表明^[19]，体力活动是一种独立的降压因素。因此有规律的运动作为预防和治疗高血压的非药物措施之一，已引起人们的极大兴趣。众多学者对体力活动与高血压关系的研究发现^[20]，人群中那些久坐少动，缺乏运动者血压偏高，而体力活动多者血压均值偏低，高血压患病率降低，运动少者发生高血压的危险性是运动多者的1.5倍。可见，通过规律的运动能增强患者体力耐受性，可有效地防治或降低心血管疾病的危险性。

规律的持久运动训练可以作为一种独立降压因素，不仅可降低血压且可提高了患者的生存质量^[21-25]。冯红等^[26]研究表明，周无负重游泳运动可有效降低自发性高血压大鼠血压，游泳4周后产生明显的降压效果。

本实验结果显示，自发性高血压运动组大鼠血压较自发性高血压组显著下降，且运动组自发性高血压大鼠血压在第5周时与自发性高血压组相比差异具有显著性。说明运动能有效抑制血压进一步增高。游泳运动8周后，运动组自发性高血压大鼠血压较运动5周时显著降低，说明运动对高血压的作用受运动时间的影响，持续时间越长，血压下降越显著。

c-Src对主动脉血管内皮功能的影响，主要在血管内皮受到切应力作用时，促进内皮细胞一氧化氮合酶的表达，使一氧化氮合成释放增加。研究证明，通过检测WT大鼠、c-Src基因缺失大鼠运动后心肌和主动脉内皮组织内皮型一氧化氮合酶和体外超氧化物过物酶表达水平时发现，WT大鼠内皮型一氧化氮合酶和体外超氧化物过物酶的表达明显高于c-Src基因缺失大鼠^[27-28]，推测血管切应力对激活c-Src起重要作用，引起内皮型一氧化氮合酶和体外超氧化物过物酶蛋白升高。运动可以使内皮型一氧化氮合酶的活性增强，并且推测了可能由于运动引起了血管切应力的增加，导致c-Src活性增强^[29]。

Takeshita等^[30]通过研究血管切应力引起的信号级联反应导致内皮型一氧化氮合酶 mRNA表达升高发现，这条信号通路依赖c-Src的激活，因为当c-Src的活性被其抑制剂PP1和PP2抑制时，内皮型一氧化氮合酶 mRNA表达的升高将受到限制，与腺病毒编码的失活c-Src效果一致，当激活c-Src时，这些信号级联反应又重新发生。表明c-Src在对应答血管切应力过程中调节内皮型一氧化氮合酶表达起重要作用。

c-Src对主动脉血管内皮功能的影响，在国内很少见报道，它主要在血管内皮受到切应力作用时，促进内皮型一氧化氮合酶的表达，使一氧化氮合成释放增加。Davis等^[7]通过检测WT大鼠、c-Src基因缺失大鼠运动后心肌和主动脉内皮组织内皮型一氧化氮合酶和细胞外超氧化物歧化酶表达水平时发现，WT大鼠内皮型一氧化氮合酶和细胞外超氧化物歧化酶的表达明显高于c-Src基因缺失大鼠，推测血管切应力对激活c-Src起重要作用，引起内皮型一氧化氮合酶和细胞外超氧化物歧化酶蛋白升高。

Dewey等^[31]研究证明，运动可以使内皮型一氧化氮合酶的活性增强，并且推测了可能由于运动引起了血管切应力的增加，导致c-Src活性增强。关于c-Src可以应答血管切应力激活内皮型一氧化氮合酶，使合成分泌一氧化氮增多，已有大量的研究。目前，运动是否可使c-Src活性升高尚未见报道。实验通过测定3组大鼠主动脉血管内皮细胞c-Src的活性和c-Src mRNA表达，从结果可以发现，经过8周游泳运动后，c-Src的活性和c-Src mRNA表达明显高于对照组(P < 0.01)，而自发性高血压组与正常对照组比较，活性较低，且差异无显著性意义(P > 0.05)，表明运动对c-Src的活性具有重要的调节作用。

c-Src蛋白参与的高血压相关信号通路有^[32]：①c-Src蛋白参与的钠钾ATP酶(Na⁺/K⁺)ATPase 信号通路。②c-Src蛋白参与的血管紧张素Ⅱ信号转导通路。③c-Src蛋白参与的 5-羟色胺受体介导的信号转导。④c-Src蛋白与其他受体的相互作用：与肾上腺素能受体、G蛋白偶联受体发生相互作用。

结论：运动不仅能产生较平稳持续的降压效果，而且能促进自发性高血压大鼠主动脉血管内皮细胞c-Src活性和c-SrcmRNA表达的增加，对高血压血管内皮损伤有改善作用。