构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：腺病毒的表达时间有限，会限制目的基因的表达时间和表达量，不利于实验的持续进行，故文章选择慢病毒作为载体，与目的基因大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因片段进行基因重组。
目的：探讨构建含有大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体的方法。
方法：根据GenBank中大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体序列(NM 145681.1)，设计出该基因的特异性引物Trail-AgeⅠ-F和Trail-AgeⅠ-R，用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因，AgeⅠ酶切将该基因克隆入真核表达载体GV218中，产生目的重组质粒，用脂质体 Lipofeetamine 2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体，3个质粒共同转染293T细胞，产生含有表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的慢病毒颗粒，收集病毒进行滴度鉴定，收集细胞提取蛋白进行基因表达情况的检测。
结果与结论：筛选出的克隆阳性菌测序获得肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，全长861 bp，与GenBank中发表的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体核苷酸序列完全一致。包装后的病毒LV-mTrail在转染2 d后收集病毒液，经PCR和Western blot方法鉴定，从基因和蛋白的层面均证实携带有目的基因肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因。孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2×109 TU/mL。提示大肠杆菌同源重组法能有效和方便地构建出含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 肿瘤坏死因子, 相关凋亡诱导配体基因, 慢病毒载体, 重组质粒, PCR, Western blot

Abstract:

BACKGROUND: Adenovirus, expressing within a limited period, can limit the expression time and amount of target genes that is not conducive to ongoing experiments. Here, we select adenovirus as vectors for genetic recombination with tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (Trail) gene fragment.
OBJECTIVE: To explore the construction of recombinant lentiviral vector carrying Trail in rats
METHODS: The Trail gene was obtained: according to GenBank in rat Trail gene sequence (NM_145681.1), we designed the gene specific primers of Trail-Age I-F and Trail-AgeI-R, and used AgeI as enzyme cutting site. PCR was applied to amplify Trail gene from rat cDNA Library and construct recombinant plasmids after cutting Trail gene to be cloned into expression vector GV218 by AgeI. Recombinant plasmids were transfected into 293T cells by Lipofeetamine2000 encapsulated recombinant plasmid and auxiliary packaging carrier. The Trail protein of lentiviral plasmids was expressed. Following virus collection, we identified virus titer and extracted protein from cells to detect Trail expression by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Screened positive Escherichia coli DH5a competent cells were sequenced with 861 bp, which was consistent with Trail nucleotide sequence in GenBank. After transfection 2 days, virus liquid was collected and confirmed as recombinant plasmid including Trail gene by PCR and Trail proteins expressed in 293T cells by western blot assay. Hole dilution method and real-time fluorescent quantitative PCR determination showed that the virus titer was 2×109 TU/mL. In this study, recombinant lentiviral vector carrying Trail is successfully constructed by homologous recombination in Escherichia coli.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: TNF-related apoptosis-inducing ligand, genes, plasmids, polymerase chain reaction, blotting, western

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

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引言

随着对肿瘤发生、发展的机制的深入研究和生物科技的飞速发展，生物治疗逐渐引起人们的广泛关注和积极探索，近些年来，生物治疗尤其是其中基因靶向治疗在恶性肿瘤的治疗中发挥了重要的作用，寻找有效的的细胞毒性分子诱导肿瘤细胞凋亡逐渐成为治疗恶性肿瘤的研究热点^[1-2]。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)又称凋亡素2配体，属于肿瘤坏死因子家族，在病理状态下可特异性诱导肿瘤细胞或病毒感染细胞凋亡，而对正常细胞无凋亡诱导作用^[3]。正因为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抗肿瘤的这一特性，成为目前肿瘤治疗及基因治疗的研究热点^[4-5]。自Pietersen等^[6]首次报道了携带了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的腺病毒载体可诱导细胞凋亡之后，携带肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的各种表达载体(如腺病毒载体、慢病毒载体等)在体内外的研究相继出现。最近的研究显示，携带肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的各种表达载体可在体内外诱导肺癌、肝癌、胃癌、子宫颈癌、胰腺癌等肿瘤细胞凋亡^[7-16]。但腺病毒的表达时间有限，会限制目的基因的表达时间和表达量，不利于实验的持续进行，故本文选择慢病毒作为载体，与目的基因大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因(mTrail)片段进行基因重组。

文章旨在探讨构建大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因过表达慢病毒载体的可行性，为后续把肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体转导进神经干细胞进行基因治疗奠定基础。

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材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：于2011年2月至2012年2月在泸州医学院附属医院神经外科完成。

材料：

构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体实验的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因引物(primer)	捷瑞生物
dsDNA Oligo、慢病毒载体系统	上海吉凯基因技术有限公司
大肠杆菌菌株DH5a，DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、脂质体2000	Invitrogen公司
Plasmid抽提Kit	Promega公司
限制性内切酶、T₄ DNA连接酶	New England Biolabs公司

方法：

实验步骤：①引物设计合成。②目的基因PCR扩增、酶切；表达载体酶切、纯化。③定向克隆连接、重组；感受态细胞制备。④转化。⑤PCR鉴定转化子。⑥阳性克隆测序。⑦病毒包装辅助质粒；高纯度质粒抽提。⑧目的基因过表达载体(病毒载体)。⑨共转染293T细胞；荧光显微镜观察；收集细胞提取蛋白。⑩病毒颗粒的包装、生产；Western-blot检测目的基因表达情况。?病毒的收获、浓缩。?病毒滴度检测。

获取肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因：以吉凯公司提供的大鼠cDNA文库为模板，PCR法扩增肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因序列。根据GenBank中大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因序列，设计基因的特异引物，引入AgeⅠ酶切位点。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体上游引物：Trail-AgeⅠ-F：GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG GCT TCC ACC GGG AAC CT；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体下游引物：Trail-AgeⅠ-R：TCA CCA TGG TGG CGA CCG GGC TCA CAC TCA ACT GGG C；含交换配对碱基、酶切位点(下划线标记的)，表达增强序列(双下划线记的)以及目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因。PCR反应条件：在94 ℃预变性5 min；然后进行30个循环的变性(30 s、94 ℃)、退火又叫复性(30 s、55 ℃)及延伸(2 min，72 ℃)如此反复循环30次；最后72 ℃保温10 min。将PCR产物在含EB的10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，切下分子大小为1 kb目的条带并回收，以备后用。

目的质粒的构建与鉴定：Age Ⅰ酶切PCR回收产物(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因)和GV208载体，分别回收后用T₄ DNA连接酶连接，产物转化入DH5a感受态细胞中进行克隆筛选，使用Plasmid质粒抽提试剂盒提取质粒, 通过Age Ⅰ酶切及测序鉴定(上海吉凯基因技术有限公司)检测连接产物的正确性。正确产物命名为LV-mTrail。

慢病毒的包装：在转染前1 d，调整293T细胞浓度为0.6 ×10⁹ L^-1，在含10% DMEM的15 cm细胞培养皿中重新接种，培养1 d。向灭菌离心管中加入所制备的各种DNA溶液(Trail-LV载体20 μg，pHelper1.0载体15 μg，pHelper 2.0载体10 μg)1.25 mL及相应体积的Opti-MEM混合均匀，室温下温育5 min。取100 μL轻柔摇匀的Lipofectamine 2000试剂在另一管中不混合，室温下温育5 min。把稀释后的DNA和不稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀5 min，混和均匀后，在室温下温育20 min。再把混合液移至293T细胞的培养液中培养。8 h后倒去培养基，加入20 mL的PBS洗涤残余的转染混和物后弃去PBS，再加入含10%DMEM 25 mL，放置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内48 h，之后进行病毒的收获及浓缩。

Western blot检测：转染2 d后，提取病毒感染后的293T细胞蛋白。取蛋白样品30 μg采用Western blot，对目的蛋白肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的表达水平进行检测，按常规方法进行SDS-PAGE电泳、转膜。经脱脂牛奶封闭，加兔源抗鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抗体(一抗)及羊抗兔IgG(二抗)后暗室操作曝光底片。

病毒滴度的孔稀释法测定：将病毒原液倍比稀释制备病毒浓度梯度感染293T细胞，测定病毒原液滴度；Real-time定量PCR法测定病毒滴度，加入不同病毒量的细胞样品，通过提取总RNA后反转录为cDNA，之后做PCR定量检测，通过比较试验组及对照组的Ct值差值来测量病毒滴度的值。一般Ct差值在2以上则认为存在明显差异，在反转录后得到的20 μL cDNA 中只用了1 μL来检测滴度，所以在计算滴度时就应该乘以20。

主要观察指标：阳性克隆DNA测序结果，Western Blot结果，目的质粒转染后细胞荧光观察及病毒滴度的检测结果，Real-time PCR曲线图检测不同浓度病毒感染293T细胞后样品组的Ct值及表达量。

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讨论

随着对肿瘤发生、发展机制的深入研究和生物科技的飞速发展，生物治疗逐渐引起人们的广泛关注和积极探索^[17]。近些年来，生物治疗尤其是其中基因靶向治疗在恶性肿瘤的治疗中发挥了重要的作用。寻找有效的的细胞毒性分子诱导肿瘤细胞凋亡逐渐成为治疗恶性肿瘤的研究热点^[18-19]。目前有许多研究证实肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可调控神经系统的一系列疾病。Prinz-Hodad等^[20]研究发现肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可改善神经变性的进程。Chiu等^[21]在小鼠模型中发现，通过诱导rAAV2调控的白细胞介素12，从而激活小神经胶质和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，可以有效治疗多形性成胶质细胞瘤。Irina等^[22]利用基因工程的手段，通过慢病毒载体使神经干细胞表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，在小鼠模型中研究其治疗神经胶质瘤的疗效。

基因治疗载体主要包括非病毒载体和病毒载体两大系统，由于导入效率的问题，前者在基因治疗中的使用率不到20%，病毒载体在基因治疗领域中的应用最为广泛^[23-25]。病毒载体包括各种反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等。反转录病毒是第一个利用病毒进行基因转移的工具，但其感染和转导效率低下，且外源基因随机插入，可能导致突变。腺病毒载体虽然是病毒载体中最常使用的载体，但由于外源基因表达时间短，免疫原性较强等缺点，研究者们一直致力于改造腺病毒和研发更为有效的病毒载体。而腺相关病毒受到越来越多的关注，但其应用还处于探索阶段。近年来，新建立的慢病毒载体(Lentiviral vector)不仅能整合到分裂和非分裂细胞的DNA中，还对淋巴细胞、干细胞和多种肿瘤细胞具有较高的转导效率，其表达时间长，具有十分优越的应用前景^[26-27]。

本实验采用慢病毒载体系统构建了大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体，并对其进行鉴定。发现该基因的慢病毒载体的构建是方便可行的，该包装体系也是成熟的，基本过程和结果的要点如下：首先设计出该基因的特异性引物，用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因。然后采用In-Fusion技术，线性交换连接酶切目的基因和真核表达载，产生目的重组质粒。再将连接产物质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，扩增目的重组质粒。用脂质体 Lipofeetamine 2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体，三质粒共同转染293T细胞，产生含有表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的Lentivirus病毒颗粒。此时进行病毒的检测：将重组质粒转入293T细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，进行Western blot 鉴定及使用Real-time 定量PCR法检测病毒滴度。经上述多种手段检测证实本实验成功地构建了大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体。该载体的构建方便易行，可重复性强，与之前相关的研究有一致性和延续性。Fu 等^[28]成功构建了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体，于体外研究了其对淋巴瘤细胞的感染效率，结果发现该载体可以感染一系列的淋巴瘤细胞株，均表达了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，说明不但慢病毒载体的构建是成功的，其表达也是顺利的，这就为后续试验打下坚实的基础。

本实验成功地构建了LV-mTrail慢病毒重组载体，为后续研究奠定了基础，也进一步拓宽了慢病毒在基因治疗中的作用。

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