葛根素保护大鼠颈椎间盘纤维环细胞的最佳浓度

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.004

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (7): 1156-1161.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.004

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葛根素保护大鼠颈椎间盘纤维环细胞的最佳浓度

陈少清¹, ²，林建平¹, ³，王诗忠¹, ²，陈乐春³，洪钰¹，张坤木¹

1福建中医药大学，福建省福州市 350003
2教育部省部共建中医骨伤及运动康复重点实验室，福建省福州市 350003
3福建省运动功能康复重点实验室，福建省福州市 350003

收稿日期:2012-06-27 修回日期:2012-07-28 出版日期:2013-02-12 发布日期:2013-02-12
通讯作者: 王诗忠，博士，教授，主任医师，福建中医药大学，福建省福州市 350003；教育部省部共建中医骨伤及运动康复重点实验室，福建省福州市 350003
作者简介:陈少清★，男，1983年生，福建省漳州市人，汉族，2009年福建中医药大学毕业，硕士，助教，医师，主要从事脊柱病康复研究。 chenshaoqd@163.com

Puerarin protects rat cervical intervertebral disc annulus fibrosus cells: An optimal concentration study

Chen Shao-qing¹, ², Lin Jian-ping¹, ³, Wang Shi-zhong¹, ², Chen Le-chun³, Hong Yu¹, Zhang Kun-mu¹

1 Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
2 Key Laboratory of Orthopedics and Exercise Rehabilitation of Ministry of Education, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
3 Fujian Rehabilitation Laboratory of Motor Function, Fuzhou 350003, Fujian Province, China

Received:2012-06-27 Revised:2012-07-28 Online:2013-02-12 Published:2013-02-12
Contact: Wang Shi-zhong, Doctor, Professor, Chief physician, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; Key Laboratory of Orthopedics and Exercise Rehabilitation of Ministry of Education, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
About author:Chen Shao-qing★, Master, Assistant teacher, Physician, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; Key Laboratory of Orthopedics and Exercise Rehabilitation of Ministry of Education, Fuzhou 350003, Fujian Province, China chenshaoqd@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：葛根素能抑制椎间盘纤维环细胞凋亡，在一定程度上延缓椎间盘退变。
目的：观察最佳浓度葛根素对大鼠颈椎间盘纤维环细胞的保护作用。
方法：用不同质量浓度Fas配体(5，20，50 μg/L)诱导大鼠颈椎间盘纤维环细胞凋亡，用流式细胞仪Annexin V–FITC-PI双染法检测纤维环细胞凋亡情况，通过MTT法和流式细胞仪观察不同质量浓度葛根素(0.01，0.1，1 g/L)对纤维环细胞的保护作用。
结果与结论：5 μg/L Fas配体诱导的纤维环细胞存活率及早期凋亡率与胎牛血清对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，20 μg/L及50 μg/L Fas配体组纤维环细胞存活率及早期凋亡率高于胎牛血清对照组 (P < 0.01)，且随着Fas配体质量浓度的增加，大鼠成熟纤维环细胞活性比例逐渐降低，而早期凋亡率逐渐增加。3种浓度的葛根素作用20 μg/L Fas配体诱导的纤维环细胞，随着葛根素质量浓度的增加，纤维环细胞存活比例逐渐增加，而早期凋亡率逐渐减少(P < 0.01)。结果提示：①Fas配体能够诱导大鼠颈椎间盘纤维环细胞凋亡，增加大鼠成熟颈椎间盘纤维环细胞的凋亡率。②3种质量浓度葛根素均有抑制椎间盘纤维环细胞死亡作用，且呈剂量依赖型。③葛根素对大鼠颈椎间盘纤维环细胞有明显保护作用。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 颈椎病, 葛根素, 中药, 最佳浓度, 剂量依赖, Fas/FasL, 细胞凋亡, 纤维环细胞, 大鼠, 国家自然科学基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Puerarin restrains the apoptosis of disc annulus fibrosus cells and delays the degenerationof the intervertebral disc.
OBJECTIVE: To explore the protective role of puerarin in rat cervical intervertebral disc annulus fibrosus cells.
METHODS: Cervical intervertebral disc annulus fibrosus cells were induced by different concentrations of Fas ligand (5, 20, 50 μg/L). The appropriate concentration of puerarin was detected using Annexin V-FITC-PI double staining to establish an in vitro apoptotic model of annulus fibrosus cells. Changes of annulus fibrosus cells in response to different concentrations of puerarin (0.01, 0.1, 1 g/L) were observed by flow cytometry and MTT method.
RESULTS AND CONCLUSION: 5 μg/L Fas ligand had no significant influence on the survival rate and early-apoptotic rate of annulus fibrosus cells (P > 0.05). 20 and 50 μg/L Fas ligand significantly promoted annulus fibrosus cells apoptosis (P < 0.01) in a dose-dependent manner. The 0.01, 0.1 and 1 g/L puerarin could improve the survival rate of Fas ligand-induced annulus fibrosus cells in a dose-dependent manner (P < 0.01). These findings indicate that (1) Fas ligand can induce the disc annulus fibrosus to be in apoptosis status. (2) Puerarin (0.01, 0.1, 1 g/L) can promote the proliferation of disc annulus fibrosus cells in a dose-dependent manner. (3) The apoptosis rate of disc annulus fibrosus cells induced by Fas ligand in vitro can be restrained by puerarin interference.

Key words: tissue construction, cartilage tissue construction, cervical spondylosis, puerarin, Chinese herbs, optimal concentration, dose-dependent, Fas/Fas ligand, cell necrosis, annulus fibrosus cells, rats, the National Natural Science Foundation of China, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

陈少清，林建平，王诗忠，陈乐春，洪钰，张坤木. 葛根素保护大鼠颈椎间盘纤维环细胞的最佳浓度[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(7): 1156-1161.

Chen Shao-qing, Lin Jian-ping, Wang Shi-zhong, Chen Le-chun, Hong Yu, Zhang Kun-mu. Puerarin protects rat cervical intervertebral disc annulus fibrosus cells: An optimal concentration study[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(7): 1156-1161.

图/表（结果） 8

2.1 颈椎间盘纤维环细胞形态观察及鉴定 见图1。

细胞原代培养接种后培养瓶中有很多漂浮的大小不等的散在形态为圆形的细胞，24 h后细胞开始贴壁，见图1A；72 h后细胞形态发生变化，贴壁的细胞伸出突起变为梭形，体积增大，在相邻细胞突起处易发生相互连接，见图1B；培养14 d后细胞长满瓶底(此时可作为传代细胞培养)，见图1C。颈椎间盘纤维环细胞培养传至第3代时甲苯胺蓝染色，倒置相差显微镜观察细胞形态，结果显示：纤维环细胞甲苯胺蓝染色呈异染性，胞浆染为紫色，细胞核染为蓝色，见图2。

2.2 不同质量浓度Fas配体干预第3代大鼠颈椎间盘纤维环细胞成活率和凋亡率比较 用流式细胞Annexin V-FITC-PI双染法检测的细胞凋亡散点图中可以区分出细胞凋亡，见图3。

体积分数为2%胎牛血清组和Fas配体处理组大鼠纤维环细胞的成活率及凋亡纤维环细胞的比例，见表1。结果表明，体积分数为2%胎牛血清组和Fas配体处理组间大鼠成熟纤维环细胞的成活率、死亡率及早期凋亡率均存在一定差异。其中高、中剂量Fas配体组纤维环细胞成活率及早期凋亡率与体积分数为2%胎牛血清组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01，P < 0.05)；但体积分数为2%胎牛血清组与低剂量Fas配体组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 葛根素及Fas配体对颈椎间盘纤维环细胞活力的影响 MTT比色法检测细胞活性结果显示：在24 h和48 h后均显示1 g/L葛根素组细胞活性为最大，与其余各组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，0.1 g/L葛根素组次之，20 μg/L Fas配体组最低，与体积分数为2%胎牛血清组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见表2。

2.4 葛根素对20 μg/L Fas配体诱导凋亡的颈椎间盘纤维环细胞的保护作用 研究结果表明，不同浓度葛根素组间大鼠成熟纤维环细胞的成活率、死亡率及早期凋亡率均存在一定差异。高剂量葛根素组纤维环细胞成活率及早期凋亡率与低剂量葛根素组、胎牛血清组和20 μg/L Fas配体组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，与中剂量葛根素组比较差异亦有显著性意义(P < 0.05)，见图4、表3。

随着葛根素质量浓度的增加，大鼠颈椎间盘纤维环细胞活性比例逐渐增加，而早期凋亡率逐渐减少。由此证明葛根素对大鼠颈椎间盘纤维环细胞有保护作用，能够抑制大鼠颈椎间盘纤维环细胞凋亡，增加大鼠颈椎间盘纤维环细胞的成活率。

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引言

材料方法

设计：细胞水平实验。
时间及地点：实验于2009年9月至2011年9月在福建中医药大学康复医学研究所完成。
材料：
实验动物：1月龄清洁级SD大鼠2只，雌雄不拘，体质量120 g左右，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXX (沪) 2008-0005。
药品、试剂与仪器：葛根素(中国药品生物制品检定所)，重组大鼠Fas-Ligand(R&D Systems 公司，批号：IZN0807011)，AnnexinV-FITC Conjugate(Invitrogen公司，批号：72620204A)，噻唑蓝、二甲基亚砜(Sigma公司)，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、低糖DMEM培养基(Hyclone公司)，CO₂培养箱(美国SHEL-LAB公司)，FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)，ELX808全自动酶标仪(福建省医疗器械公司)，倒置显微照相机(OLYMPUS公司)。
实验方法：
纤维环细胞的取材及培养[17]：取1月龄的SD大鼠，麻醉成功后，无菌条件下取椎间盘纤维环，剪成大小 1 mm³，先用0.25%胰蛋白酶消化20 min， 1 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心5 min，弃掉上清液，继续用0.2%Ⅱ型胶原酶消化4 h，1 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心5 min，收集细胞沉淀，接种培养，细胞长满80%后传代。第3代纤维环细胞进行甲苯胺染色鉴定。
流式细胞仪检测不同质量浓度Fas配体诱导纤维环细胞存活率及凋亡率：取第3代纤维环细胞进行酶消化、离心形成细胞悬液后，以每孔细胞数3×10⁵个传代接种于6孔板。先用体积分数为10%的胎牛血清培养，于光学显微镜下观察，待细胞长满80%，弃掉上清液改用体积分数为2%的胎牛血清培养8 h，弃掉上清液，取4孔分别改用含体积分数为2%胎牛血清、5 μg/L Fas配体+体积分数为2%胎牛血清、20 μg/L Fas配体+体积分数为2%胎牛血清、50 μg/L Fas配体+体积分数为2%的胎牛血清诱导24 h，AnnexinV–FITC和PI双染法检测纤维环细胞的凋亡情况。
MTT比色法：用体积分数为2%的胎牛血清分别配置质量浓度为1 g/L，0.1 g/L，0.01 g/L葛根素溶液和 20 μg/L Fas配体溶液以及单纯体积分数为2%的胎牛血清作为培养液，分别用于干预第3代大鼠颈椎间盘纤维环细胞，取第3代纤维环细胞用排枪种到96孔板中，每孔细胞数4×10³-5×10³，待细胞贴壁后，弃去上清液，洗去未贴壁细胞。用上述培养液干预细胞，分别干预24，48 h。上述细胞按规定的时间干预后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育4 h，终止培养，小心吸弃培养板中的液体，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪上以490 nm波长测定各孔吸光度值。
AnnexinV-FITC和PI双染法：取第3代长满的细胞接种到6孔板，每孔细胞数3×10⁵个。先用体积分数为10%胎牛血清培养液培养待细胞长满80%后，改为体积分数为2%的胎牛血清培养液培养8 h后，弃掉上清液对细胞进行相应的干预，分别为含体积分数为2%的胎牛血清配成20 μg/L Fas配体^[18]，以及含体积分数为2%的胎牛血清配成20 μg/L Fas配体+1 g/L葛根素、20 μg/L Fas配体+0.1 g/L葛根素、20 μg/L Fas配体+0.01 g/L葛根素干预24 h后，冷的PBS清洗2遍，消化收集细胞，分别加入100 μL buffer液悬浮细胞后，加Annexin V-FITC 5 μL和PI 10 μL，避光孵育15 min后，分别加入400 μL buffer液重悬细胞，随即用流式细胞仪进行凋亡率检测(按试剂盒说明)。
主要观察指标：甲苯胺染色鉴定纤维环细胞；MTT比色法观察纤维环细胞的增殖情况；AnnexinV-FITC法检测纤维环细胞的凋亡率。
统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件分析。计量资料均用x(_)±s表示，计量资料进行比较时，先作正态分布及方差齐性检验，正态分布的计量资料多组间均数比较采用单因素方差分析；方差齐用t 检验，方差不齐用秩和检验，均为双侧检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验结果表明Fas配体能够诱导大鼠颈椎间盘纤维环细胞凋亡，这与文献报道一致^[7]， Fas-Ligand是死亡受体Fas的配体，为一种C末端位于细胞外的Ⅱ型跨膜蛋白，为肿瘤坏死因子家族成员。大量研究支持，椎间盘细胞可以通过自分泌或旁分泌配体Fas-Ligand与细胞膜上死亡受体Fas结合作为起始信号介导细胞凋亡程序^{[5-6, 9-12]}。Park等^[5-6]发现所有退变椎间盘样本中均发现Fas和Fas配体的强烈表达，在细胞凋亡区域同时存在Fas和Fas配体的高度表达，提示Fas/Fas配体系统启动了椎间盘细胞的凋亡，同时Fas配体可以通过Fas介导细胞凋亡，故实验利用重组大鼠Fas-Ligand试剂体外诱导大鼠颈椎间盘纤维环细胞建立退变模型。

实验结果表明适宜浓度的葛根素对Fas配体诱导的大鼠椎间盘纤维细胞具有保护作用，关于葛根素对细胞的保护作用已有相关的报道^[19-22]，但其具体的保护细胞机制尚未明确，王万铁等^[19]研究葛根素可通过特异性阻断电压操纵型与受体依赖型钙离子通道，阻止细胞外钙离子内流，一定程度上减轻细胞内钙超载。温葭等^[20]报道葛根素可以抑制缺血-再灌注引起的细胞凋亡；抑制由过氧或缺氧等损伤引起的细胞凋亡；影响心肌及血管平滑肌细胞的凋亡及促进各种癌细胞凋亡等。韩江全等^[21]研究葛根素可通过上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达减少脑缺血再灌注后神经细胞凋亡。肖旭等^[22]研究葛根素可上调Bcl-2蛋白表达，抑制Caspase-3的表达，减少肝细胞凋亡，对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用，但葛根素对椎间盘纤维环细胞凋亡的影响国内外尚未报道，葛根素是通过何种途径参与调控椎间盘纤维环细胞增殖与凋亡的动态平衡，其具体作用机制还有待于进一步的研究。

基金资助：国家自然科学基金(30973764)；福建省卫生教育联合攻关计划项目(WKJ2008-2-48)；福建省科技厅国际合作项目( 2009I0010)。
作者贡献：实验设计为陈少清，王诗忠，实验实施为林建平，陈乐春，实验评估为洪钰，陈乐春，资料收集为张坤木。陈少清成文，林建平审校，王诗忠，陈少清对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

葛根素保护大鼠颈椎间盘纤维环细胞的最佳浓度

Puerarin protects rat cervical intervertebral disc annulus fibrosus cells: An optimal concentration study

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