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早在1997年，Asahara等^[1]描述了一群人类循环CD34⁺细胞，在体外经过分化后具有内皮细胞特征，这些细胞被称为“内皮祖细胞”。这个里程碑式的研究向传统的“血管发生”的概念提出了挑战，提示成人外周血的循环细胞也参与新血管形成。而且，随后的研究显示这些细胞来源于骨髓，循环于外周血，并向新血管形成的部位(包括缺血组织及肿瘤微环境)归巢^[2-4]。近来的研究发现其他组织，包括实体器官及血管，也可以作为内皮祖细胞的来源^[5-6]。尽管越来越多的研究认为内皮祖细胞可以作为强有力的再生医学工具或者作为肿瘤治疗的靶点，但不管在临床前研究或临床研究中，自相矛盾的报道也时有出现；还有许多问题存在争议，如内皮祖细胞的定义、鉴别、特征及其在血管的动态平衡及疾病中的作用^[7-14]。本实验主要应用细胞贴壁培养法，分别从外周血、脐带血、骨髓及脐带组织中分离培养内皮祖细胞，以期进一步深入理解内皮祖细胞的起源及其生物学特性。

越来越多的证据显示，内皮祖细胞参与生理性及病理性血管形成。临床前研究也证明内皮祖细胞在缺血肢体或心肌中向血管新生部位迁移，并参与肿瘤血管发生^[7-13]。因此，内皮祖细胞可能是一种很有前景的血管性及肿瘤性疾病的治疗靶点。 目前研究认为有数个具有血管新生潜能的细胞群：造血来源的内皮祖细胞，表达造血及内皮细胞抗原，增殖能力有限；循环内皮细胞表达内皮抗原，无造血抗原，低增殖潜能；内皮外向生长细胞，特异表达内皮细胞特异性抗原，保持高增殖潜能。为确定这些祖细胞是否代表一群具有不同增殖潜能的异质性细胞池，或是内皮细胞发育的不同阶段，许多研究小组进行了相关研究。 从骨髓、脐带血、外周血等标本中获得的单个核细胞或CD34阳性选择后的单个核细胞在体外包被有Fn的基底上贴壁培养后所形成的内皮祖细胞为纺锤形、鹅卵石样的单层细胞^[14-15]。为了避免单核细胞、造血祖细胞等的污染，有研究者将细胞预先培养24~48 h以去除所有贴壁的低密度的单个核细胞，然后将非贴壁细胞接种于Fn包被的培养皿。培养7 d后，观察并计数内皮祖细胞克隆(由中心圆形细胞及周围出芽伸出的纺锤形细胞组成)^[16-19]。这种方法是目前许多关于内皮祖细胞研究的基础。结果显示，这种贴壁细胞总数在3~10 d能扩增8~90倍，其克隆有效性仅3%，在体外单细胞水平不能传代^[16-19]。与这些研究结果相似，本实验中外周血及脐带血单个核细胞通过在包被有Fn的基底上贴壁培养后均获得了纺锤形、梭形的贴壁细胞，7 d形成由中心圆形细胞及周围出芽伸出的纺锤形细胞组成集落。这些细胞继续培养增殖率很低，消化传代后不能继续贴壁及增殖。由于其同时表达造血与内皮细胞抗原，增殖能力有限，因此可能就是造血细胞来源的内皮祖细胞。同样，作者应用预贴壁法获得内皮祖细胞的性质与此相似(结果未显示)。这种低克隆率是与培养条件不佳还是与所分离内皮祖细胞固有的低增殖潜能相关还不清楚。 Lin等^[20]培养性别不合异基因骨髓移植后患者的外周血单个核细胞发现，在培养1周内出现一群表达内皮标记的贴壁细胞，称其为循环内皮细胞。这些细胞具有低增殖潜能，体外能扩增近20倍。此外，单个核细胞直接贴壁培养后，在培养的较晚期(14~28 d)可以分离出另一种细胞克隆，具有旺盛的增殖能力，在体外培养2个月能扩增1 000倍，称为内皮外向生长细胞。在这个研究基础上，多个小组已经从脐血及成人外周血中成功地分离出内皮外向生长细胞^{[15, 21]}。其均一表达内皮特异性抗原，而无造血细胞抗原。而且，内皮外向生长细胞培养至少能连续扩增传代30代。本实验应用预贴壁培养法及直接贴壁培养法获得的外周血与脐带血单个核细胞均未获得这类具有高增殖活性的细胞群，可能由于这群细胞含量低，在培养的较晚期才出现，而在多数情况下对外周血及脐带血单个核细胞的培养不超过18 d，此外细胞培养体系的差别也可能是一个重要因素。而骨髓作为一个巨大的干细胞库，其内皮祖细胞的含量远高于外周血^[22]，故从骨髓获取并通过离体扩增培养法培养是一个更加高效的途径。在本实验中，骨髓单个核细胞培养 7 d时集落数、15 d时细胞得率均高于外周血与脐带血内皮祖细胞。根据高密度种植原则和自体血管内皮细胞为1.2×10⁵/cm²密度计算^[23]，每毫升骨髓可铺植1.0~2.0 cm 组织工程血管，完全能够满足组织工程对种子细胞的要求。而脐带来源的内皮祖细胞(尤其是植块培养法)更为组织工程提供了大量的种子细胞。 在最近的一项报告中，Ingram等^[24]假设内皮系存在不同等级的干祖细胞，类似于造血干祖细胞。应用Lin等^[20]报道的方法从健康成人外周血及健康足月脐带血分离培养内皮祖细胞。结果发现，相同体积的脐带血所产生的内皮细胞克隆的数量是成人外周血的15倍，而且脐带血来源的内皮克隆比外周血早1周出现。体外进行连续传代后，脐带血内皮祖细胞至少能够扩增100代而没有明显的衰老迹象；而成人内皮祖细胞不能超过30代。随后他们将1~2代脐带血及成人血内皮祖细胞有限稀释后接种，结果发现：除了许多单个贴壁内皮细胞外，还可以看到许多大小及细胞形态不同的细胞克隆。这些数据提示内皮祖细胞在增殖及克隆形成潜能上有很大的可变性。此后，他们又定量研究了单个内皮祖细胞的增殖潜能。结果显示：成人外周血内皮祖细胞80%以上产生含2~50个细胞的小克隆或细胞簇；少量形成含500个细胞以上的克隆。相反，至少60%脐带血内皮祖细胞形成界限清楚的含2 000~10 000细胞的克隆。消化克隆的子代细胞，成人外周血内皮祖细胞的二次克隆率仅1/1 000；而脐带血内皮祖细胞的二次克隆率接近50%。这些研究证明： 内皮祖细胞具有与造血干祖细胞类似的增殖潜能等级。应用类似于造血干祖细胞的命名方法，根据内皮祖细胞的增殖潜能不同将其分为：高增殖潜能内皮克隆形成细胞(HPP-ECFC)，培养后产生巨大克隆，后者再接种后形成二次及三次克隆；低增殖潜能内皮克隆形成细胞(LPP-ECFC)，形成含有50个以上细胞的克隆，但再接种时不产生二次LPP-ECFC克隆；这些内皮祖细胞阶段代表增殖活性最强的内皮外向生长细胞。它们产生内皮细胞簇，后者由50个以下细胞组成，再接种后不产生克隆或细胞簇。同一个研究小组用单细胞沉积分析发现，与循环内皮祖细胞相似，衬于脐静脉与人动脉的内皮细胞也由不同成熟阶段的内皮祖细胞组成，具有不同的增殖活性^[25]。本实验中，骨髓单个核细胞、脐带植块及酶消化脐静脉内膜所获单个核细胞贴壁培养均获得了高增殖活性的内皮祖细胞，体外培养细胞倍增时间为44.4~63.0 h，细胞周期分析显示大多数细胞均处于G₀/G₁期。这类细胞的增殖活性类似于HPP-ECFC/LPP-ECFC，但其更具体的增殖能力还需要进一步研究。 对于内皮祖细胞表型特征的研究较为广泛^[14]。Asahara等^[1]首次证明内皮祖细胞为CD34⁺细胞。由于造血干细胞及成熟内皮细胞也表达CD34，因此它对于内皮祖细胞没有特异性。而CD133抗原的发现与研究，使人们对内皮祖细胞的认识更进了一步。Peichev等^[26]的研究显示表达VEGFR2及CD133的CD34⁺细胞组成一群表型及功能明确的内皮祖细胞。随着研究的深入，人们认为外周血可能存在两种内皮祖细胞，即早期内皮祖细胞及晚期内皮祖细胞^[18]。如前所述，早期内皮祖细胞出现于单个核细胞贴壁培养的早期，主要表达CD14、CD45以及KDR等，而晚期内皮祖细胞出现于培养2~4周，表达CD133、CD34、VEGFR2，不表达CD14、VE-钙黏素、VWF。而在外周循环中，多数较成熟的内皮祖细胞逐渐丢失CD133，但CD34及VEGFR2阳性，表达多种不同密度的内皮系的标记，包括：CD31、CD144、VE-钙黏素、VWF及内皮一氧化氮合酶，在刺激条件下表达E-选择素^[21]。因此，CD133的丢失可能反映了内皮祖细胞向成熟内皮样细胞的转化，本实验中，外周血来源的内皮祖细胞高表达CD45，部分表达CD95，低表达内皮细胞标记vWF和CD144，但不表达CD31、KDR、CD49e、CD62E，也不表达干细胞标记CD34、CD133以及CD1a、CD105；脐带血来源的内皮祖细胞与外周血内皮祖细胞类似，仅CD144的阳性率较外周血内皮祖细胞高，而且部分表达KDR。此表型与其他研究者预贴壁培养所获CEC或早期内皮祖细胞的表型一致^[21]，可能为造血细胞来源的内皮祖细胞。而骨髓与脐带来源内皮祖细胞均不表达造血细胞标记，但高表达间充质细胞标记CD73、CD105等，内皮系标记KDR的表达量也较高，部分还表达vWF、CD34、 CD106、CD133。以上标记符合文献所报道的内皮外向生长细胞或晚期内皮祖细胞的表型特征^[21]。此外，本实验所培养的四种来源的内皮祖细胞均具有吸收ac-LDL并结合UEA-1的能力，这也符合内皮细胞的功能特征^[19]。 这些数据证实外周血、脐带血、骨髓以及脐带组织中存在处于不同分化发育阶段的内皮祖细胞，同时也进一步证实内皮系存在不同等级的干祖细胞，类似于造血干祖细胞，这些细胞在表型特征、增殖潜能上均存在很大的差异。今后的研究还需进一步研究这些细胞的克隆形成潜能以及体内参与血管新生的潜能，为组织工程提供更好的细胞来源。

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