六味地黄丸干预绝经后骨质疏松症模型大鼠的作用机制

doi:10.12307/2026.867

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (36): 9402-9412.doi: 10.12307/2026.867

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六味地黄丸干预绝经后骨质疏松症模型大鼠的作用机制

许鹏超1，2，谢丽华3，4，黄景文3，4，陈娟3，4，陈玄3，4，李生强3，4，葛继荣3，4

1福建中医药大学，福建省福州市 350003；2福建省中医药科学院博士后创新实践基地，福建省福州市 350003；3福建省中医药科学院基础研究所，福建省福州市 350003；4福建省中西医结合防治骨质疏松重点实验室(福建省中医药科学院，福建中医药大学附属康复医院)，福建省福州市 350003

收稿日期:2025-10-15 修回日期:2026-01-23 出版日期:2026-12-28 发布日期:2026-05-20
通讯作者: 葛继荣，博士，研究员，福建省中医药科学院基础研究所，福建省福州市 350003；福建省中西医结合防治骨质疏松重点实验室(福建省中医药科学院，福建中医药大学附属康复医院)，福建省福州市 350003
作者简介:许鹏超，男，1993年生，江西省安福县人，汉族，福建中医药大学博士，主要从事中医药防止骨与关节疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82274563)，项目负责人：葛继荣；国家自然科学基金项目(82374483)，项目负责人：谢丽华

Mechanisms of Liuwei Dihuang Pills in a rat model of postmenopausal osteoporosis

Xu Pengchao1, 2, Xie Lihua3, 4, Huang Jingwen3, 4, Chen Juan3, 4, Chen Xuan3, 4, Li Shengqiang3, 4, Ge Jirong3, 4

1Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; 2Fujian Academy of Chinese Medicine Postdoctoral Innovation Practice Base, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; 3Institute of Basic Research, Fujian Academy of Chinese Medical Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; 4Fujian Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for the prevention and treatment of osteoporosis (Fujian Academy of Chinese Medical Sciences, Fujian University of Traditional Chinese Medicine Subsidiary Rehabilitation Hospital), Fuzhou 350003, Fujian Province, China

Received:2025-10-15 Revised:2026-01-23 Online:2026-12-28 Published:2026-05-20
Contact: Ge Jirong, PhD, Researcher, Institute of Basic Research, Fujian Academy of Chinese Medical Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; Fujian Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for the prevention and treatment of osteoporosis (Fujian Academy of Chinese Medical Sciences, Fujian University of Traditional Chinese Medicine Subsidiary Rehabilitation Hospital), Fuzhou 350003, Fujian Province, China
About author:Xu Pengchao, PhD, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, Fujian Province, China; Fujian Academy of Chinese Medicine Postdoctoral Innovation Practice Base, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82274563 (to GJR); National Natural Science Foundation of China, No. 82374483 (to XLH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
网络药理学：基于系统生物学理论，通过分析生物系统网络并选取特定节点，结合药物间结构、功效相似性以及机体内靶标分子与生物效应分子的多重相互作用，构建药物-药物和药物-靶标网络，从而预测药物功效及其对应药物。
单细胞测序：以单个细胞作为基本分析单位，通过在单个细胞水平上解码基因组、转录组或表观基因组信息，揭示生物组织中细胞组成的复杂性、异质性和动态变化，为基于个体细胞组成和状态的精准诊断、分型和治疗提供基础。

摘要
背景：六味地黄丸已被广泛应用于骨质疏松症肝肾阴虚证的治疗，但其治疗靶点与机制仍不够明确。
目的：利用网络药理学和单细胞测序分析六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症的机制。
方法：①通过TCMSP和ETCM数据库分析六味地黄丸各中药组分的有效成分及靶点，从GeneCards、OMIM、Disgenet、PharmGkb和TTD数据库中检索骨质疏松症相关基因，利用Cytoscape、STRING等分析工具构建药物-疾病-靶点网络并筛选核心基因，进行GO、KEGG富集分析。②将9只SD大鼠随机分为假手术组(n=3)、模型组(n=3)和六味地黄丸组(n=3)，假手术组不造模，模型组与六味地黄丸组通过切除双侧卵巢建立绝经后骨质疏松症模型。造模4周后，假手术组与模型组大鼠灌胃给予生理盐水，六味地黄丸组大鼠灌胃给予六味地黄丸，每天2次，连续给药12周。末次给药结束后取外周血，分别进行单细胞测序分析与网络药理学-单细胞测序联合分析。
结果与结论：①六味地黄丸与骨质疏松症的交集靶点共116个，“药物-疾病-靶点”网络图及蛋白质互作网络分析表明，B淋巴细胞瘤2、Fos原癌基因、雌激素受体1、白细胞介素10等15个基因可能是核心靶点；GO、KEGG富集分析显示，六味地黄丸的治疗机制可能与破骨细胞分化、细胞衰老与凋亡、类固醇激素调控和炎症反应相关。②单细胞测序结果显示，单核巨噬细胞可能是六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症的关键细胞群；GO、KEGG富集分析显示，单核巨噬细胞群与免疫、凋亡、活性氧代谢等关系密切；网络药理学-单细胞测序联合分析显示，六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症主要通过破骨细胞和凋亡相关通路实现。③结果表明，六味地黄丸通过多靶点多效应多机制治疗绝经后骨质疏松症，主要机制与破骨细胞的分化和凋亡相关，CD16+单核巨噬细胞亚群是这一作用实现的关键细胞亚群。

https://orcid.org/0000-0002-0328-4446(许鹏超)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 绝经后骨质疏松症, 网络药理学, 单细胞测序, 六味地黄丸, CD16+单核巨噬细胞

Abstract: BACKGROUND: Liuwei Dihuang Pill has been widely used in the treatment of osteoporosis with liver and kidney yin deficiency syndrome, but its therapeutic targets are still unclear and need further research.
OBJECTIVE: To analyze the mechanism of Liuwei Dihuang Pills in the treatment of postmenopausal osteoporosis using network pharmacology and single-cell sequencing.
METHODS: (1) The active ingredients and targets of each traditional Chinese medicine component of Liuwei Dihuang Pills were analyzed using the TCMSP and ETCM databases. The genes related to osteoporosis were retrieved from the GeneCards, OMIM, Disgenet, PharmGkb, and TTD databases. The drug-disease-target network was constructed and the core genes were screened by using analytical tools such as Cytoscape and STRING. Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analyses were performed by core genes. (2) Nine Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group (n=3), model group (n=3) and Liuwei Dihuang Pill group (n=3). Sham group did not undergo modeling, while the model and Liuwei Dihuang Pill group were modeled by bilateral oophorectomy. Four weeks after modeling, the Liuwei Dihuang Pill group was administered by gavage with a suspension prepared by Liuwei Dihuang Pills, while the sham group and the model group were administered by gavage with the same amount of normal saline. Administration in each group was given twice daily, for 12 consecutive weeks. After the final administration, peripheral blood was collected for single-cell sequencing and network pharmacology analyses.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) There were a total of 116 intersection targets between Liuwei Dihuang Pills and osteoporosis. The "drug-disease-target" network diagram and protein-protein interaction analysis indicated that 15 genes such as B-cell lymphoma 2, Fos proto-oncogene 1, estrogen receptor 1, and interleukin-10 might be its core targets. Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analyses indicated that the therapeutic mechanism of Liuwei Dihuang Pills might be related to osteoclast differentiation, cell senescence and apoptosis, steroid hormone regulation and inflammatory response. (2) Single-cell sequencing indicated that monocytes might be the key cell population in the treatment of postmenopausal osteoporosis with Liuwei Dihuang Pills. Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analyses indicated that mononuclear macrophage populations were closely related to immunity, apoptosis, reactive oxygen species metabolism, etc. The combined analysis of single-cell sequencing and network pharmacology indicated that Liuwei Dihuang Pills for postmenopausal osteoporosis was mainly achieved through osteoclast and apoptosis-related pathways. To conclude, Liuwei Dihuang Pills treat postmenopausal osteoporosis through multiple targets, multiple effects and multiple mechanisms, and its main mechanism is related to the differentiation and apoptosis of osteoclasts. The CD16+ monocyte subset is the key cell subset responsible for this effect.

Key words: postmenopausal osteoporosis, network pharmacology, single-cell sequencing, Liuwei Dihuang Pill, CD16+ monocyte

中图分类号:

许鹏超, 谢丽华, 黄景文, 陈娟, 陈玄, 李生强, 葛继荣, . 六味地黄丸干预绝经后骨质疏松症模型大鼠的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(36): 9402-9412.

Xu Pengchao, Xie Lihua, Huang Jingwen, Chen Juan, Chen Xuan, Li Shengqiang, Ge Jirong. Mechanisms of Liuwei Dihuang Pills in a rat model of postmenopausal osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(36): 9402-9412.

图/表（结果） 12

2.1 网络药理学分析结果 2.1.1 六味地黄丸的活性成分及靶点根据TCMSP、ETCM数据库检索、去重，获取六味地黄丸各中药有效成分及作用靶点如下：熟地黄有效成分2个，作用靶点30个；山药有效成分16个，作用靶点125个；吴茱萸有效成分28个，作用靶点460个；泽泻有效成分8个，作用靶点66个；茯苓有效成分6个，作用靶点24个；牡丹皮有效成分7个，作用靶点213个。六味地黄丸的有效成分及对应ID见表1。 2.1.2 疾病靶点汇总确定主题词后进行疾病靶点的检索，从GeneCards数据库获得2 189个靶点，OMIM数据库获得11个靶点，TTD数据库获得34个靶点，Disgenet、PharmGkb数据库未能检索到靶点。对各数据库所获取靶点取并集后共得到2 210个疾病靶点(图1)。

2.1.3 “药物-疾病-靶点”网络图构建与蛋白质互作网络分析使用Venn包获得交集靶点116个(图2)，将其通过STRING数据库进行蛋白质互作网络分析，构建蛋白质互作网络图(图3)，并导出靶点互作文件。将数据导入Cytoscape构建“药物-疾病-靶点”网络图(图4)，不同颜色和形状的节点有不同信息，绿色六边形为中药，橙色椭圆表示药物有效成分，紫色椭圆代表疾病靶点，各色椭圆的大小根据该靶点的度值确定，浅灰色连线表明各节点间相互作用关系。使用Cytoscape的CytoNCA插件计算靶点网络相关性指标中间中心性、接近中心性、度中心性、特征向量中心性、局部平均连通性、网络中心性以鉴定核心基因。通过计算上述指标，取其中位数进行2轮筛选后确定15个核心基因(表2，图5)。
2.1.4 交集靶点的GO与KEGG富集分析使用ClusterProfiler包对交集基因进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析获得生物过程数据2 329条，细胞组分数据48条，分子功能数据134条，KEGG富集到174条相关通路(P < 0.1)。基于P值、Count数等信息筛选富集信息，使用R软件中的ggplot2包对富集分析结果进行可视化，各富集分析结果见图6。GO_生物过程分析表明，交集靶点与细胞对营养水平、氧化应激、激素、凋亡、炎症反应等生物过程关系密切；GO_细胞组分分析表明，交集靶点与线粒体、内质网、RNA聚合酶、肽酶抑制剂等细胞成分有关；GO_分子功能分析表明，交集靶点与核受体、转录因子、类固醇受体、细胞因子等功能相关。KEGG富集分析显示，交集基因主要富集到激素、炎症、氧化应激、破骨细胞分化、细胞衰老与凋亡等多条相关通路。
2.2 动物实验结果
2.2.1 实验动物数量分析 9只大鼠全部进入结果分析。
2.2.2 各组大鼠骨密度情况末次给药结束后，假手术组、模型组、六味地黄丸组大鼠骨密度分别为0.279，0.247，0.268 g/cm2，3组间整体比较差异有显著性意义(F=14.217，P=0.005)，假手术组、六味地黄丸组大鼠骨密度高于模型组(P < 0.05)，说明六味地黄丸可改善绝经后骨质疏松症大鼠的骨密度。
2.2.3 单细胞测序数据的降维聚类基于单细胞测序数据高维度且复杂的特性，使用Seurat包中的LogNormalize标准化方法进

行主成分分析，将细胞初步降维成34个群(图7)。在去除批次效应后使用t-分布邻域嵌入算法(t-SNE) 和统一流形逼近与投影(UMAP) 将34群细胞进行聚类分析[20-21]，各细胞群的细胞数与占比见表3。
2.2.4 细胞类群鉴定与亚群细分基于Seurat包计算每群细胞的差异高表达基因，进一步筛选marker。过SingleR包对细胞类型进行初步注释，结合CellMarker数据库及文献报道等方式对注释结果进行细胞类型调整，确定各细胞类群(表4)。共鉴定出10群B细胞、8群T细胞、8群NK细胞、4群单核巨噬细胞、3群粒细胞、1群红细胞。基于细胞类型的tSNE、UMAP图见图8。
鉴于单核巨噬细胞与破骨细胞前体细胞的关系较为密切，此次研究对2，7，28，31共4群单核巨噬细胞进行进一步的亚群细分，t-分布随机邻域嵌入、统一流形近似与投影降维聚类结果如图9所示，各细胞亚群的差异基因气泡图如图10所示。根据降维聚类及基因表达情况，可以近似地将单核巨噬细胞看成CD16(FCGR3A)阳性和阴性两大亚群。

2.2.5 单核巨噬细胞富集分析为进一步分析单核巨噬细胞的功能情况，对单核巨噬细胞群进行了GO、KEGG富集分析(图11)。GO富集分析结果表明，单核巨噬细胞群主要富集到细胞凋亡相关功能(淋巴细胞凋亡过程、外源性凋亡信号通路的正调控和活性氧代谢过程的正调控)、淋巴细胞分化功能(α-β T细胞活化、分化的正调控、T细胞分化的正调控)等功能，此外与免疫系统功能也关系密切。KEGG富集分析表明，与单核巨噬细胞群关系密切的有凋亡与免疫相关功能，值得注意的是，单核巨噬细胞群与破骨细胞分化也有密切联系(Rich number=43，Rich Factor=0.506，P < 0.000 1)。针对富集分析结果，进一步使用富集弦图的方式观察每个富集功能对应到哪些基因与这些基因的上调、下调情况(图12)。KEGG富集弦图表明，CD16表达上调、Fos基因表达下调等与破骨细胞分化关系密切。
2.3 网络药理学-单细胞测序联合分析结果
2.3.1 单核巨噬细胞的核心基因表达量分析此次测序鉴定为单核巨噬细胞的细胞总数为12 702个，CD16+ 细胞总计4 463个，CD16+ 细胞占单核巨噬细胞比例为35.14%(表5)。为进一步探索六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症的机制，基于网络药理学分析所获得的核心基因，提取了此次测序单核巨噬细胞的相关基因表达量进行进一步分析(表6)。结果表明，核心基因中仅有MYC、MMP9、IL6组间比较差异无显著性意义，其余基因的表达均发生了明显变化。在组间有差异的核心基因中，ESR1、IL10、TNF、PTGS2、EGFR等核心基因的本底表达较低，而BCL2本底表达高且组间变化明显。作为单核巨噬细胞亚群Marker的CD16表达在模型组最高，在六味地黄丸组、假手术组中下降。
2.3.2 核心基因与单核巨噬细胞的联合富集分析见图13。

基于网络药理学和单核巨噬细胞的富集分析，对以上两部分的GO、KEGG富集分析结果取交集，两部分GO分析交集条目共1 149条，KEGG分析交集条目173条(图13)。基于网络药理学和单细胞测序的联合富集分析，六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症的机制主要在破骨细胞的分化、细胞凋亡、细胞衰老、多种激素、细胞因子相关通路等方面。

参考文献

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引言

绝经后骨质疏松症是因女性雌激素显著下降导致的代谢性骨病[1]，以骨量降低、骨微结构破坏及脆性增加为特征，已成为全世界中老年女性共同的健康问题[2-5]。约1/3的绝经后女性受绝经后骨质疏松症困扰[5]，严重者可导致骨折，严重影响患者的生活质量并加重社会经济负担[6]，因此在老龄化的社会背景下，绝经后骨质疏松症的有效防治是亟待解决的问题。
六味地黄丸组方源自《小儿药证直诀》，是治疗肝肾阴虚证的经典名方，广泛应用于多种疾病的治疗[7-10]。中医理论强调“肝肾同源”，其内涵主要体现于精血同源、藏泄互用和阴阳互滋互制三方面。六味地黄丸以“三补三泻”配伍，契合滋肝肾阴、填精壮骨之法，助肝肾相生，可改善中老年妇女常出现的阴虚证候，缓解绝经后骨质疏松症常出现的腰背酸痛、口干舌燥、心烦失眠等症状。大量临床实践表明，六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症具有良好的疗效[11]，但因中药复方配伍多样性、煎煮成分相互作用的复杂性，其治疗机制尚待深入阐明。
课题组前期基于免疫调节[12]、氧化应激[13]、细胞自噬等角度揭示了六味地黄丸对成骨细胞的影响[14]。另有研究指出，六味地黄丸不仅可在分子层面干预破骨细胞的分化与凋亡，还参与骨免疫微环境调控[15-16]。阐明六味地黄丸作用于破骨细胞的作用机制及精确靶点，不仅有助于推进该经方的现代化应用，还可为中医药现代化研究提供新视角。为进一步探讨六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症的机制，此次研究整合网络药理学与单细胞测序技术，初步筛选出六味地黄丸通过破骨细胞调控的关键靶点，以期为该药在骨免疫微环境调控及组织工程领域中的多方向应用提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计网络药理学与单细胞测序，随机分组动物实验。
1.2 时间及地点实验于2022年10月至2023年10月在福建省中医药科学院比较医学中心和基础研究所中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 3月龄雌性SD大鼠9只，SPF级，体质量(220±30) g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0008，合格证编号：110322220103875058。大鼠饲养于福建省中医药科学院比较医学中心，饲养温度(20±2) ℃，相对湿度(60±10)%，光照周期12 h/12 h，所有动物均给予正常饲料、自由活动和饮水。动物实验已通过福建省中医药科学院动物伦理委员会批准(批准文号FJATCM-IAEC2022005)。
1.3.2 药物、试剂与仪器六味地黄丸(浓缩丸)由熟地黄、山药等组成，国药准字：Z19993068；Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 (德国，SigmaAldrich)；96-Well Thermal Cycler深孔PCR仪(美国，Thermo)；10× Genomics Chromium系统(美国，10× Genomics)。
1.4 实验方法
1.4.1 网络药理学分析
药物活性成分及靶点筛选：使用TCMSP数据库 (https://www.tcmsp-e.com/)和ETCM数据库(http://www.tcmip.cn/ETCM/)筛选六味地黄丸所含中药活性成分和靶点。TCMSP数据库筛选标准是口服生物利用度≥30%且药物相似度≥0.18[17]；ETCM数据库的筛选标准是定量评估类药性> 0.67且置信度> 0.8[18]。通过UniProtKB将药物活性成分靶点转化为人类基因靶点。
疾病靶点获取：使用MeSH数据库(https://meshb.nlm.nih.gov/)确定主题词，因使用“Postmenopausal Osteoporosis”检索所获得的疾病靶点过少(多个数据库无该疾病靶点)，故使用“Osteoporosis”为关键词进行疾病靶点检索。通过GeneCards (https://www.genecards.org/)、OMIM (https://www.omim.org/)、Disgenet (https://disgenet.com/)、TTD (https://db.idrblab.net/ttd/)、PharmGkb (https://www.pharmgkb.org/)数据库获取靶点，将以上靶点取并集获得疾病靶点。
构建“药物-疾病-靶点”网络图：使用R(v4.4.2)中的Venn包获取药物靶点交集，建立药物成分与疾病靶点网络节点表，将其导入Cytoscape(v3.9.1)对数据进行筛选美化，构建“药物-疾病-靶点”网络图。
蛋白质互作网络分析：通过R获取药物-疾病交集靶点，使用STRING数据库(https://cn.string-db.org/)对交集靶点进行蛋白质互作网络分析。调整置信度为高，并隐藏无相互作用节点，导出蛋白质互作网络图及互作文件。将文件导入Cytoscape，使用CytoNCA插件计算互作网络指标，包括中间中心性、接近中心性、度中心性、特征向量中心性、局部平均连通性和网络中心性。通过2次筛选鉴定核心基因。
GO和KEGG富集分析：使用R软件对基因集进行因本体论(Gene Ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，基于P值、Count数等信息筛选富集信息并对富集结果可视化。
1.4.2 动物实验
实验分组与造模：采用随机数字表法将9只大鼠随机分为假手术组、模型组与六味地黄丸组，每组3只。大鼠适应性喂养1周后禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，模型组与六味地黄丸组切除双侧卵巢建立绝经后骨质疏松症模型，假手术组切除卵巢附近同等大小的脂肪组织。术后3 d连续注射青霉素8×104 IU预防感染。造模4周后，通过小动物全身骨密度检测验证造模成功。
分组干预：参照课题组前期确定的六味地黄丸干预浓度和体表面积法(等效剂量比0.018)计算大鼠的等效剂量为0.388 8 g/(kg·d)[19]。造模4周后，六味地黄丸组大鼠灌胃给予六味地黄丸混悬液0.388 8 g/(kg·d)，假手术组与模型组大鼠灌胃给予等量生理盐水，每天2次，每次5 mL/kg，连续灌胃12周。
单细胞测序检测：末次给药结束后，腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，检测全身骨密度；随后腹主动脉取血10-15 mL；吸取2 mL抗凝血用PBS 按体积比1∶1稀释，轻柔吹打混匀并加入4 mL淋巴细胞分离液于混匀液体上，2 300 r/min离心25 min，小心吸取淋巴细胞层液体(从上至下分别为血浆层、淋巴细胞层、分离液层、红细胞层)加入新的15 mL离心管，加入10 mL PBS清洗细胞2次，获得单个核细胞悬液，用以进行单细胞测序。单细胞测序检测委托上海美吉生物医药科技有限公司完成，通过10×Genomics Chromium 系统获取测序原始数据，使用Cell Ranger软件进行质控与过滤。

测序数据分析：使用美吉科服网生信云平台(https://www.majorbio.com/)进行测序数据分析，依次进行数据的降维聚类、细胞类群鉴定、亚群细分、GO富集分析、KEGG富集分析与各细胞相关基因表达量提取。

1.4.3 网络药理学-单细胞测序联合分析基于网络药理学筛选的核心基因列表，提取测序数据中的对应基因表达量进行统计分析；整合分析网络药理学和单细胞测序的富集分析交集情况。
1.5 主要观察指标网络药理学和单细胞测序分析六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症的机制。
1.6 统计学分析数据采用SPSS 26.0和R软件进行分析。正态分布的计量资料采用x±s表示，非正态分布的计量资料数据采用M(P25，P75)表示；多组间总体比较，若数据呈正态分布且方差齐，采用单因素方差分析进行统计，组间多重比较采用LSD检验；多组间整体比较时，计量资料不符合正态分布时采用Kruskal-Wallis H非参数检验，组间比较通过Bonferroni校正法校正P值。正态分布数据采用Pearson相关分析，不符合正态分布或等级资料采用Spearman相关分析。取α=0.05为差异有显著性意义的界限。该文统计学方法已经由福建省中医药科学院统计学专家审核。

讨论

六味地黄丸是治疗绝经后骨质疏松症的经典方，在学术界与临床实践均获广泛认可，然而，由于中医证候的多样性和中药成分的复杂性，六味地黄丸确切的分子机制及关键靶点仍未完全阐明。当前研究致力于深入解析绝经后骨质疏松症的发病机制，以期精准识别药物靶点，减少不良反应并提高疗效。在此背景下，网络药理学为探索中药复方治疗疾病的潜在靶点提供了一种高效便捷的研究策略。为阐明六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松的分子机制，此次研究采用网络药理学分析来筛选可能的治疗靶点和途径，通过对六味地黄丸组成中药67种有效成分918个作用靶点的网络分析，结合GeneCards、OMIM、TTD等在线数据库鉴定出的2 210个不同的疾病靶点，综合分析得到了六味地黄丸在骨质疏松症治疗中的潜在靶基因116个。蛋白质互作网络分析凸显了潜在靶基因中的关键枢纽基因，通过进一步分析确定了15个核心基因靶点，这些核心靶点也与富集分析结果中强调六味地黄丸从氧化应激、激素、炎症、细胞衰老与凋亡等相关通路作用相一致，如ESR1、凋亡相关基因BCL2、促炎基因IL1β、IL6和抗炎基因IL10；除此之外，核心靶点中还包括了与氧化应激密切相关的靶点HIF1α，细胞衰老相关的经典靶点TP53等。GO富集分析中的生物过程术语条目包含了如“对类固醇激素的反应”“对氧化应激的反应”“炎症反应的调节” “对凋亡信号通路的调节”；GO富集分析中的分子功能术语条目包含了如“单加氧酶活性” “核类固醇受体活性”等大量相互印证的分子功能条目。
课题组前期已在成骨细胞及骨代谢领域开展了深入研究，而破骨细胞相关研究亦具有重要的探索价值。目前，学界普遍认为破骨细胞前体细胞主要来源于单核巨噬细胞[22]，通过对外周血检测可对破骨细胞前体向成熟破骨细胞转化的早期过程进行动态观察。基于对单细胞测序数据的分析，此次研究在外周血单核巨噬细胞群中识别出CD16表达差异显著的2个亚群。CD14和CD16作为公认的单核细胞分类标志物[23]，可将其分为三类：经典型(CD14++，CD16-)、中间型(CD14++，CD16+)和非经典型单核细胞(CD14+，CD16++)。CD14不仅是单核细胞的标志物，还具有信号传导功能，可调控骨髓细胞的存活与分化[24-25]。CD16作为Fcγ受体，在介导炎症反应及细胞毒性作用中发挥关键功能[26-28]。不同单核细胞亚群因CD14和CD16的表达差异而具有不同的生物学特性：经典型单核细胞主要参与免疫防御、抗凋亡等功能[29-31]；中间型单核细胞可能与血管生成、细胞凋亡、炎症反应及氧化应激等过程密切相关[32-34]；非经典型单核细胞则具有沿血管壁迁移的能力[35-36]。结合单细胞测序数据中的单核巨噬细胞富集分析，作者推测CD16+细胞亚群可能通过调控细胞凋亡、炎症反应及氧化应激等途径，影响破骨细胞的分化与凋亡，进而参与绝经后骨质疏松的发生发展。
通过对网络药理学和单细胞测序联合分析后进一步验证了这一推测，两部分富集分析的结果共同表明，破骨细胞的分化、细胞凋亡、炎症与免疫等是其中最主要的作用通路。在单核巨噬细胞中，各核心靶点的基因表达分析显示，细胞亚群标志物CD16组间比较差异明显，15个核心基因中有12个具有组间差异，其中BCL2基因不仅本底表达最高，其相对表达量也差异显著。BCL2基因是一个关键的抗凋亡基因，其核心功能是抑制细胞凋亡，主要通过维持线粒体外膜完整性、结合促凋亡蛋白(BAX、BID等)及参与内质网中的钙离子调控等机制实现[37-38]。综上所述，六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症的作用机制与破骨细胞的分化与凋亡密切相关，尤其涉及BCL2的表达调控。基于单细胞测序数据的预测显示，CD16+单核巨噬细胞亚群可能是这一作用实现的关键细胞亚群，后续研究应以明确CD16+单核巨噬细胞亚群的具体作用机制为方向，并确定该细胞亚群BCL2变化对破骨细胞凋亡与分化的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

六味地黄丸干预绝经后骨质疏松症模型大鼠的作用机制

Mechanisms of Liuwei Dihuang Pills in a rat model of postmenopausal osteoporosis

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