1.1 设计 材料的合成与表征，体外细胞学实验，体内动物实验。 实验方案设计见图1。
1.2 时间及地点 实验于2023年9月至2025年8月在苏州大学附属第一医院骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂 黑磷(先锋纳米)；Ⅱ型胶原酶、胰酶-EDTA、番红O-固绿、TRIzol、DAPI(Sigma-Aldrich，美国)；胎牛血清、反转录试剂盒(R323-01)、qPCR检测试剂盒(Q312-02)(诺唯赞公司，中国)；DMEM/F12培养基(Keygen BioTECH，中国)；α-MEM培养基(凯基生物，中国)；青霉素-链霉素(GIBCO，美国)；PBS(RG-CE-10，中国Ketu)；苏木精-伊红染液(南京建成生物工程研究所，中国)；FITC Phalloidin、甲苯胺蓝染液、阿利新蓝染色试剂盒(索莱宝公司，中国)；CCK-8试剂盒(C6005)、40 g/L
多聚甲醛(G1101)(赛维尔生物公司，中国)；Fluor488标记羊抗兔IgG抗体(S0018，Affinity，中国)；Fluor594标记羊抗兔IgG抗体(AS039)、CD86兔单克隆抗体(A21198)、CD206兔多克隆抗体(A8301)、基质金属蛋白酶13兔多克隆抗体(A11755)、Ⅰ型胶原蛋白兔单克隆抗体(A21059)(爱博泰克公司，中国)；干扰素γ、脂多糖、白细胞介素4(近岸蛋白，中国)；巨噬细胞集落刺激因子(CB34，Novoprotein，中国)。
1.3.2 主要仪器 脂质体挤出器(Avanti，USA)；透射电子显微镜(Hitachi，日本)；动态光散射仪(DLS，Malvern Zetasizer Nano ZS，德国)；红外热成像系统(FOTRIC 616C，中国)；实时荧光定量PCR系统(CFX96TM Real-Time PCR system，Bio-Rad，美国)；持续吸入式气体麻醉系统(RWD-R500，中国)；光学显微镜(Leica，
德国)；倒置荧光显微镜(Zeiss Axiovert，德国)；NanoDrop
ND-2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国)；全波长酶标仪(BioTek，美国)；CO2细胞培养箱、生物超净台(Thermo Fisher Scienttffc，美国)；切片机(Leica RM2165，德国)。
1.3.3 实验细胞 小鼠胚胎成纤维细胞(原代细胞)，购自上海硕程生物科技有限公司，采用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化
1 min后重悬于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中。计数后，将细胞以每盘5×105的数量铺板，置于在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中。每2 d更换培养基，每三四天传代一次细胞，取P3-P5代成纤维细胞用于实验。
1.3.4 实验动物 8周龄雄性C57BL/6J小鼠34只，1周龄雄性C57BL/6J小鼠8只，均购自杭州启真动物科技有限公司，许可证号：SCXK(浙)2022-0005。所有动物饲喂标准化饲料，置于恒温恒湿、无特定病原体的环境中自由取水，维持12 h明暗交替的昼夜周期。动物实验方案已获苏州大学伦理委员会批准(批准号：SUDA20250320A01。实验过程严格遵循国际兽医学编辑协会《动物伦理与福利作者指南共识》及相关地方和国家法规。在所有手术操作中，实验动物均在麻醉状态下进行，并尽力降低疼痛、应激。
1.4 实验方法
1.4.1 巨噬细胞与软骨细胞的分离培养
巨噬细胞的分离培养：参考文献[26]中的方法分离提取骨髓巨噬细胞。取4只8周龄C57BL/6J小鼠，
经持续吸入式气体麻醉系统麻醉(异氟烷4%，氧浓度30%)后脱颈处死，经体积分数75%乙醇灭菌后转移到无菌玻璃板上，无菌解剖股骨和胫骨，剥去软组织后置于冰冷PBS中，暴露骨髓腔，使用装有生理盐水的20 mL注射器反复冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液。将骨髓冲洗液离心(500×g离心5 min，4 ℃)后弃上清，用ACK缓冲液裂解红细胞；第二次离心(500×g离心
5 min，4 ℃)后弃上清，将有核细胞重悬于α-MEM培养基中，添加体积分数10%胎牛血清和30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子后接种在10 cm培养皿中。16 h后去除非黏附细胞，培养黏附细胞3 d即获得成熟的骨髓巨噬细胞。
软骨细胞的分离培养：参考文献[27]的方法分离提取软骨细胞。取8只1周龄C57BL/6J小鼠，经持续吸入式气体麻醉系统麻醉(异氟烷4%，氧浓度30%)后脱颈处死，经体积分数75%乙醇灭菌后无菌条件下切取关节软骨，切碎后用10%青霉素-链霉素溶液洗涤，无菌PBS冲洗；在37 ℃下加入0.2%Ⅱ型胶原酶消化过夜，通过70 µm细胞过滤器过滤去除未消化组织，离心(500×g离心5 min)后弃上清，将细胞沉淀重悬于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 µg/mL 链霉素的DMEM/F-12培养基中，接种于10 cm培养皿中，置于37 ℃、体积分数5% CO₂恒温培养箱中孵育。选择P1代软骨细胞用于后续实验。
1.4.2 M2型巨噬细胞膜包覆黑磷纳米片的制备 通过改良液相剥离法合成黑磷纳米片(记为BPNs)[28]。将5 mg块体黑磷分散于20 mL去离子水中，并通入氩气以去除溶解氧，随后在冰水浴条件下以探针式超声处理8 h(功率700 W，开/关循环2 s/4 s)，所得分散液经3 000 r/min离心20 min移去沉淀，收集呈棕色的上清液于4 ℃保存。使用前以10 000 r/min离心10 min后弃上清，收集棕色沉淀。
将骨髓巨噬细胞在含体积分数10%胎牛血清、20 ng/mL白细胞介素4的DMEM培养基中培养24 h，诱导细胞向M2型极化[29-30]；用预冷的裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4；150 mmol/L NaCl；1 mmol/L PMSF；1×蛋白酶抑制剂混合物)裂解并于4 ℃孵育2 h，随后进行3次冻融循环(液氮冷冻
10 min，37 ℃水浴解冻≤5 min)；裂解液经500×g离心10 min后收集上清液，12 000×g离心15 min后弃上清，将沉淀重悬于TM缓冲液中作为细胞膜组分，BCA法进行蛋白定量分析(每毫升TM缓冲液中细胞膜蛋白质含量为0.3 mg)。将M2型巨噬细胞细胞膜与BPNs混合(每10 μg BPNs添加0.03 mg M2型巨噬细胞细胞膜)，经浴式超声分散15 min，通过脂质体挤出器依次挤过400 nm与200 nm聚碳酸酯膜(各15次)，得到M2型巨噬细胞膜包覆黑磷纳米片(记为M2M@BPNs)。
1.4.3 M2M@BPNS的表征
形貌表征：将少量BPNs或M2M@BPNS溶液滴加于铜网载玻片上，轻轻吸附并均匀分布于表面后，用高纯氮气吹干以避免污染，置入透射电子显微镜，根据实验需求选择适当的加速电压(80–200 kV)，并在必要时切换至高分辨率模式以观察内部结构与精细形貌。进一步地，将BPNs和M2M@BPNs分别分散于去离子水中，确保体系均匀后置入动态光散射仪，记录颗粒随时间的光散射强度变化，根据结果绘制粒径分布曲线，计算流体动力学粒径。
光热性能评估：将固体BPNs或M2M@BPNS均匀分散于PBS中以避免沉降或团聚，以PBS为对照，使用近红外激光器(808 nm)作为光源，在0.75 W·cm⁻²条件下连续照射3 min，利用红外热成像系统实时监测并记录溶液温度，每30 s获取一次热像图以直观呈现升温过程，绘制温度-时间曲线，分析样品的光热转换效率。
光热循环稳定性：将稳定分散于PBS中的M2M@BPNs置于同一光照条件下(808 nm、0.75 W·cm⁻²)，进行连续的加热-冷却循环测试。每个循环中先照射3 min记录温度上升情况，随后自然冷却至室温，重复上述过程3次。整个循环过程中利用红外热成像仪实时监测温度变化，每30 s获取一次热像图以直观呈现温度变化过程。
1.4.4 M2M@BPNs的体外细胞相容性评价 将骨髓巨噬细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板中，分5组培养：对照组不进行任何处理；脂多糖组加入30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子刺激72 h[22]，然后加入100 ng/mL脂多糖和干20 ng/mL扰素γ共同刺激24 h以诱导细胞向M1型极化[29]，再加入PBS干预24 h；BPNs组和M2M@BPNs组在诱导细胞向M1型极化后分别加入100 µg/mL的BPNs、M2M@BPNs干预24 h[31-32]；M2M@BPNs+红外干预组在诱导细胞向M1型极化后加入100 µg/mL M2M@BPNs干预24 h，期间进行近红外光照射(808 nm，0.75 W/cm²，180 s)，每组6复孔。干预结束后，继续培养0，12，24 h，弃去培养液，每孔加入含10 µL CCK-8试剂的100 µL新鲜培养基继续孵育2 h，加入100 µL终止液于25 ℃避光条件下静置4 h，使用酶标仪在570 nm波长下测定吸光度(A)值，计算细胞存活率。以仅加入培养基的孔为空白孔(无细胞无药物)。
细胞存活率(%) = (实验组A值−空白孔A值) / (对照组A值−空白孔A值) × 100%
1.4.5 M2M@BPNs联合近红外干预在巨噬细胞极化重编程中的作用 将骨髓巨噬细胞以1×10⁶/孔的密度接种于6孔板中，分对照组、脂多糖组、BPNs组、M2M@BPNs组和M2M@BPNs+近红外干预组，干预方式同1.4.4。干预结束后，RT-qPCR检测CD86、诱导型一氧化氮合酶、CD206、精氨酸酶1 mRNA表达，免疫荧光染色检测CD86表达。
1.4.6 M2M@BPNs联合近红外干预对骨关节炎软骨细胞基质稳态的间接调控 干预结束后，取1.4.5中5组骨髓巨噬细胞培养上清，在4 ℃下1 000×g离心5 min后取上清，分别与DMEM/F-12培养基以1∶1体积比混合，随后添加体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，获得巨噬细胞条件培养基。
将软骨细胞以1×10⁶ /孔密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后分组干预，对照组加入2 mL α-MEM培养基，其余4组分别加入上述4组巨噬细胞条件培养基2 mL。培养24 h后，RT-qPCR检测聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、基质金属蛋蛋白酶13和解整合素-金属蛋白酶5 mRNA表达，免疫荧光染色检测基质金属蛋白酶13表达，分析M2M@BPNs联合近红外干预对软骨细胞基质稳态的间接调控作用。
将软骨细胞以2×1010 L-1的浓度悬浮于含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F-12培养基(完全培养基)中。取50 μL软骨细胞悬液滴加于24孔板孔中央，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养2 h，观察细胞贴壁后分组培养，对照组加入1 mL完全培养基，其余4组分别加入4组巨噬细胞条件培养基1 mL，每24 h更换培养基。培养72 h后，将形成的软骨细胞微团球在4 ℃条件下用40 g/L多聚甲醛固定24 h，分别进行阿尔新蓝(pH=0.2)与番红O-固绿染色，观察硫酸化糖胺聚糖沉积情况，使用Image J软件定量分析细胞外基质沉积量。
1.4.7 M2M@BPNs联合近红外干预对骨关节炎成纤维细胞代谢稳态的间接调控 将成纤维细胞以1×10⁶/孔的密度接种于6孔板中，分组干预，对照组加入2 mL常规完全培养基，其余4组分别加入4组巨噬细胞条件培养基2 mL。培养24 h后，RT-qPCR检测Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达，免疫荧光染色检测Ⅰ型胶原蛋白表达。
细胞划痕实验：将成纤维细胞以1×10⁶/孔的密度接种于6孔板中，分组干预，对照组加入2 mL常规完全培养基，其余4组分别加入4组巨噬细胞条件培养基2 mL。观察细胞形成致密单层后，使用无菌200 μL移液枪头垂直于板面轻轻划出标准化线性划痕，操作过程中保持压力和角度一致，以尽量减少实验差异。划痕完成后，每孔用预热PBS清洗2次以去除脱落细胞和碎屑，将原培养基更换为等体积无血清培养基以抑制细胞增殖，从而确保实验结果主要反映细胞定向迁移。划痕后0，6，12 h，使用倒置相差显微镜观察并拍照，采用固定的相机参数记录图像，以保证采集结果的可比性和重复性。采用 Image J 软件分析划痕宽度，在同一区域选取多个测量点(n≥3)，取平均划痕宽度，计算细胞迁移率。
细胞迁移率(%) = (初始划痕宽度–终末点划痕宽度) /初始划痕宽度× 100%
1.4.8 细胞实验相关检测方法
RT-qPCR检测：使用TRIzol试剂提取总RNA，利用NanoDrop ND-2000分光光度计测定RNA浓度和纯度。使用反转录试剂盒合成cDNA，将cDNA与SYBR Green PCR Master Mix、基因特异性引物及DEPC水混合，制备反应体系，在实时荧光定量PCR系统上进行扩增，以GAPDH作为内参基因。目标基因的相对表达量采用 2⁻ΔΔCt 方法进行计算。引物序列见表1。
免疫荧光染色：将细胞在25 ℃用40 g/L多聚甲醛固定
30 min，以保持细胞形态和结构完整；用0.1% TritonX-100处理5 min以增强细胞膜通透性，用封闭液孵育30min以减少非特异性结合；将一抗按1∶200稀释比加入封闭液中，在4 ℃下孵育过夜以充分结合靶蛋白；去除一抗后，PBS洗涤细胞3次，在25 ℃避光条件下与AlexaFluor488或594标记的二抗(1∶500)孵育1 h；用DAPI(1 µg/mL)染色细胞核5 min，在显微镜下采集荧光图像，随机选择至少3个视野进行观察和记录，采用 Image J软件分析荧光强度。
1.4.9 M2M@BPNs联合近红外干预对小鼠骨关节炎退变的干预作用 将30只C57BL/6小鼠随机分为假手术组、骨关节炎组、BPNs组、M2M@BPNs组、M2M@BPNs+近红外干预组，每组6只。切断骨关节炎组、BPNs组、M2M@BPNs组、M2M@BPNs+红外干预组小鼠右膝内侧半月板胫骨韧带建立骨关节炎模型[33]，假手术组进行假手术(仅暴露关节而不切断韧带)。术后碘伏消毒切口，肌肉注射青霉素(5×104 IU/kg)抗感染。术后1周，骨关节炎组膝关节腔注射20 µL PBS，BPNs组和M2M@BPNs组膝关节腔分别注射20µL的BPNs分散液(100 µg/mL)、M2M@BPNs分散液(100 µg/mL)，M2M@BPNs+近红外干预组膝关节腔注射20 µL M2M@BPNs分散液(100 µg/mL)24 h后接受近红外光照射(808 nm，0.75 W/cm²，180 s)3次，每次间隔30 s，每周治疗1次。术后8周，吸入异氟烷麻醉后颈椎脱臼处死小鼠，收集心脏、肝脏、脾脏、肺、肾及膝关节用于后续分析。
体内毒性分析：用冰冷PBS冲洗去除心脏、肝脏、脾脏、肺、肾组织残余血液，在4 ℃条件下用10%中性甲醛固定48 h；依次通过梯度浓度(体积分数70%，80%，95%，100%)乙醇脱水，二甲苯透明处理后包埋于石蜡中，使用旋转切片机切取4 µm连续切片，安装在聚-L-赖氨酸涂层载玻片上并于37 ℃干燥过夜；切片脱蜡复水后，先用苏木精染色5 min，再用伊红染色2 min，
经脱水并用合成树脂封固后，在光学显微镜下进行组织病理学观察与评估，包括炎症、坏死、纤维化及其他组织结构异常。
组织学染色：膝关节标本经梯度浓度乙醇脱水、二甲苯过夜透明、石蜡包埋后，使用切片机沿矢状面切成6 μm厚薄片放于载玻片上，经二甲苯脱石蜡、梯度浓度乙醇复水后，分别进行软骨与滑膜苏木精-伊红染色、软骨番红O-固绿和甲苯胺蓝染色液染色，中性树胶封固，光学显微镜下观察并拍摄图像。
免疫荧光染色：膝关节软骨与滑膜组织切片经二甲苯脱石蜡、梯度浓度乙醇复水后用体积分数3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶活性15 min，在37 ℃条件下用胰酶-EDTA进行抗原修复；经1.5%山羊血清封闭后，在4 ℃下与一抗(滑膜组织：CD206、CD86，软骨组织：Ⅱ型胶原蛋白，基质金属蛋白酶13，稀释比均为1∶200)孵育过夜；去除一抗，与AlexaFluor488/
594结合的二抗(1∶500)在25 ℃避光孵育1 h，用DAPI进行核染色，倒置显微镜下观察并拍摄图像，通过Image J软件分析阳性细胞率。
1.5 主要观察指标 M2M@BPNs联合红外干预在巨噬细胞极化重编程中的作用，M2M@BPNs联合红外干预对骨关节炎软骨细胞基质稳态的间接调控，M2M@BPNs联合红外干预对骨关节炎成纤维细胞代谢稳态的间接调控，M2M@BPNs联合红外干预对小鼠骨关节炎退变的干预作用。
1.6 统计学分析 采用 GraphPad Prism 9.5软件进行统计分析，定量数据均以均值±标准误表示，多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组比较采用 Student’s t 检验。以 P < 0.05 作为差异有显著性意义的判定标准。该文所统计学方法已获得苏州大学生物统计学专家的审核确认。
