趋化因子受体7-骨髓间充质干细胞复合猪小肠黏膜下层促进大鼠皮肤损伤修复

doi:10.12307/2026.058

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (13): 3242-3249.doi: 10.12307/2026.058

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趋化因子受体7-骨髓间充质干细胞复合猪小肠黏膜下层促进大鼠皮肤损伤修复

范美荣，李光琪，宋旭梅，闫昕，随瑞枝

宁夏医科大学总医院医学实验中心，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2025-03-06 修回日期:2025-05-07 接受日期:2025-05-29 出版日期:2026-05-08 发布日期:2025-12-24
通讯作者: 范美荣，硕士，主管技师，宁夏医科大学总医院医学实验中心，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:范美荣，女，1987年生，宁夏回族自治区银川市人，汉族，2013年四川大学华西医院毕业，硕士，主要从事组织工程相关研究。
基金资助:
宁夏回族自治区自然科学基金项目(2023AAC03616)，项目负责人：范美荣；宁夏回族自治区干细胞与再生医学重点实验室开放课题(KF202409)，项目负责人：范美荣

Chemokine receptor 7-bone marrow mesenchymal stem cells combined with porcine small intestinal submucosa promote skin repair in rats

Fan Meirong, Li Guangqi, Song Xumei, Yan Xin, Sui Ruizhi

Medical Experimental Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2025-03-06 Revised:2025-05-07 Accepted:2025-05-29 Online:2026-05-08 Published:2025-12-24
Contact: Fan Meirong, MS, Chief technician, Medical Experimental Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Fan Meirong, MS, Medical Experimental Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region, No. 2023AAC03616 (to FMR); Open Research Fund of Ningxia Key Laboratory of Stem Cells and Regenerative Medicine, No. KF202409 (to FMR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

猪小肠黏膜下层：通过去除猪小肠的浆膜层、肌层、黏膜层，以及经过一系列加工和消毒等处理后获得的天然细胞外基质类生物材料，其主要组成成分包括胶原、纤维粘连蛋白、黏多糖及蛋白多糖等物质，具有良好的细胞相容性、抗微生物活性、促进组织特异性诱导再生等特点。
趋化因子受体7：是趋化因子受体家族的成员之一，近年来的研究证实在多种肿瘤细胞中过表达，趋化因子受体7通过与相应趋化因子结合后可以促进细胞增殖及新生血管生成。

摘要
背景：临床上对于皮肤损伤修复常用的自体及异体皮肤移植效果都不甚理想。近年来组织工程的发展为皮肤修复带来了新的希望，然而在皮肤组织工程中血管的再生一直是一个难题。猪小肠黏膜下层和骨髓间充质干细胞是当前广泛用于组织工程研究的天然细胞外基质类支架材料和种子细胞，趋化因子受体7是一种可以促发新生血管生成的细胞因子。
目的：观察趋化因子受体7-骨髓间充质干细胞-猪小肠黏膜下层膜对大鼠背部皮肤损伤的修复效果及血管再生能力。
方法：①过表达趋化因子受体7腺病毒载体转染骨髓间充质干细胞，Western blot及RT-qPCR方法评价转染效果；②将过表达趋化因子受体7的骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合培养，通过扫描电镜观察及活死细胞染色验证细胞相容性；③12只SD大鼠构建皮肤缺损动物模型，分别将趋化因子受体7-骨髓间充质干细胞-猪小肠黏膜下层(实验组)和猪小肠黏膜下层(对照组)置于大鼠皮肤缺损处，造模后1，3，7，14 d观察创面愈合情况，造模后7，14 d采用Western blot检测创面愈合组织中血管内皮生长因子蛋白表达，免疫组化染色检测创面组织CD31及增殖细胞核抗原蛋白表达。
结果与结论：①通过腺病毒介导成功构建过表达趋化因子受体7的骨髓间充质干细胞，趋化因子受体7转染组细胞内趋化因子受体7的蛋白、mRNA表达均较对照组和空载组明显上调(P < 0.001)；②扫描电镜观察及活死细胞染色实验结果显示过表达趋化因子受体7的骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层膜表面生长良好，二者具有良好的相容性；③与对照组相比，实验组创面面积明显缩小(P < 0.05)，实验组创面愈合组织中血管内皮生长因子、CD31、增殖细胞核抗原的蛋白表达高于对照组(P < 0.05)，表明趋化因子受体7-骨髓间充质干细胞-猪小肠黏膜下层膜的促创面血管生成能力较强。

https://orcid.org/0000-0002-9646-2570 (范美荣)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 趋化因子受体7, 骨髓间充质干细胞, 腺病毒, 猪小肠黏膜下层, 皮肤修复, 血管生成

Abstract: BACKGROUND: The clinical outcomes of autologous and allogeneic skin transplants, which are commonly used for repairing skin lesions, are often suboptimal. In recent years, advancements in tissue engineering have provided new hope for skin repair. Nevertheless, the regeneration of blood vessels within skin tissue engineering remains a significant challenge. Porcine small intestinal submucosa and bone marrow-derived mesenchymal stem cells are widely utilized natural extracellular matrix biomaterials and seed cells in current tissue engineering research. Chemokine receptor 7 is a cytokine that can promote angiogenesis.
OBJECTIVE: To observe the repair effect and angiogenesis ability of chemokine receptor 7-bone marrow mesenchymal stem cells-porcine small intestinal submucosa membrane on rat back skin damage.
METHODS: (1) The adenovirus vector overexpressing chemokine receptor 7 was used to transfect bone marrow mesenchymal stem cells. The transfection efficiency was evaluated using western blot assay and RT-qPCR. (2) The bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing chemokine receptor 7 were co-cultured with porcine small intestinal submucosa. Cytocompatibility was assessed through scanning electron microscopy and live/dead cell staining. (3) 12 SD rats were utilized to establish a skin defect animal experimental model, and chemokine receptor 7-bone marrow mesenchymal stem cells-porcine small intestinal submucosa (experimental group) and porcine small intestinal submucosa (control group) were placed in the rat skin defect, and the wound healing was observed 1, 3, 7, and 14 days after modeling. The expression of vascular endothelial growth factor protein in the wound healing tissue was detected by western blot assay at 7 and 14 days after modeling, and the expression of CD31 and proliferating cell nuclear antigen protein in the wound tissue was detected by immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing chemokine receptor 7 were successfully constructed by adenovirus-mediated transfection. The protein and mRNA expressions of chemokine receptor 7 in the chemokine receptor 7 transfected group were significantly upregulated compared with those in the control group and the empty vector group (P < 0.001). (2) Scanning electron microscopy observation and live-dead cell staining results showed that bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing chemokine receptor 7 grew well on the surface of the submucosal membrane of the porcine small intestine, and the two had good compatibility. (3) Compared with the control group, the wound area of the experimental group was significantly reduced (P < 0.05). The protein expression levels of vascular endothelial growth factor, CD31, and proliferating cell nuclear antigen in the wound healing tissue of the experimental group were higher than those in the control group (P < 0.05), indicating that the ability of chemokine receptor 7-bone marrow mesenchymal stem cells-porcine small intestinal submucosal membrane to promote wound angiogenesis was strong.

Key words: chemokine receptor 7, bone marrow derived mesenchymal stem cell, adenovirus, porcine small intestinal submucosa, skin repair, angiogenesis

中图分类号:

范美荣, 李光琪, 宋旭梅, 闫昕, 随瑞枝. 趋化因子受体7-骨髓间充质干细胞复合猪小肠黏膜下层促进大鼠皮肤损伤修复[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(13): 3242-3249.

Fan Meirong, Li Guangqi, Song Xumei, Yan Xin, Sui Ruizhi. Chemokine receptor 7-bone marrow mesenchymal stem cells combined with porcine small intestinal submucosa promote skin repair in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(13): 3242-3249.

图/表（结果） 6

2.1 腺病毒转染BMSCs效率 原代培养BMSCs呈长梭形，细胞间连接紧密，传代后细胞纯度增高，细胞排列呈流线型、旋涡状。过表达CCR7的腺病毒转染BMSCs后通过荧光显微镜观察绿色荧光表达，结果显示空载组和CCR7组均可见明显的绿色荧光表达，对照组未见绿色荧光表达，各组细胞形态均未见明显改变，说明腺病毒成功转染BMSCs，且细胞生长受腺病毒和CCR7的影响较小(图1)。Western blot及RT-qPCR检测结果显示，与对照组和空载组相比，CCR7组CCR7蛋白及mRNA表达均明显升高，差异有显著性意义(图2)。以上结果表明，经过腺病毒转染，已成功构建过表达CCR7的BMSCs。

2.2 SIS膜性状及与CCR7-BMSCs的细胞相容性 干燥SIS膜呈不均匀白色片状，通过扫描电镜观察SIS膜表面胶原交错排列成三维多孔结构，孔隙结构利于细胞黏附、增殖，表面部分覆盖白色膜状胶原物质(图3A，B)。CCR7-BMSCs与SIS膜复合培养2 d后，扫描电镜观察可见SIS膜表面附着的BMSCs生长状况良好，细胞呈典型长梭形、纺锤形或多角形；细胞数量随着培养时间的延长而逐渐增多，培养4 d时可见细胞排列紧密，相互交联成片状(图3C，D)。活死细胞染色结果显示CCR7-BMSCs与SIS膜复合培养2，4 d后，BMSCs在SIS膜表面生长状态良好，细胞伸出突起呈典型长梭形或不规则形状，随着培养时间延长细胞排列为放射状或束状。贴附在SIS膜表面生长的BMSCs大多为有活力的细胞，只有零星死细胞。图中绿色荧光为钙黄绿素标记的有活性的细胞，红色荧光为碘化丙啶标记的死亡的细胞(图3E，F)。

2.3 大鼠皮肤损伤创面愈合情况 12只大鼠术后全部存活，进食、活动等情况均正常。术后第1，3天，两组创面缺损面积无明显差异；术后第7天，可见两组创面缺损面积逐级缩小，其中实验组效果较为明显，两组创面面积比较有统计学差异(P < 0.01)；术后第14天，实验组创面基本愈合，对照组创面仍可见小溃疡存在，两组创面面积比较有统计学差异(P < 0.05)。结果提示：与SIS膜比较，CCR7-BMSCs-SIS膜可以更快地促进皮肤损伤愈合，见图4。

2.4 Western blot实验检测皮肤创面修复组织中VEGF蛋白表达术后第7，14天时实验组VEGF蛋白表达均高于对照组，两组差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.5 免疫组化实验检测皮肤创面修复组织中CD31及PCNA蛋白表达 随着时间延长，CD31及PCNA蛋白阳性表达率逐渐上升，术后第7，14天时实验组CD31及PCNA蛋白阳性表达率均高于对照组，两组差异有显著性意义(P < 0.05)，术后第7，14天时CCR7-BMSCs优化了SIS膜的促血管生成能力，见图6，7。

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引言

皮肤是人体防御外界损伤的重要器官之一，目前糖尿病性、放射性溃疡等各类皮肤病以及烧创伤、瘢痕、肿物等体表病变切除造成的皮肤损伤患者对皮肤修复的需求日益增大[1-2]。在临床治疗中，皮肤移植技术是应用最为广泛的方法，其中自体皮肤移植具有组织相容性较好、免疫排斥反应较低的优势，然而对于大面积皮肤损伤患者常面临自身可供移植皮肤面积有限的困境，而且可能导致供皮区域瘢痕形成并出现继发感染，影响患者的美观和生活质量。异体皮肤移植虽然在一定程度上可以解决自体移植皮肤来源不足的问题，但患者却可能面临严重的免疫排斥反应，以及因免疫排斥而增加感染其他疾病的风险，给患者的身体健康带来潜在威胁[3-4]。
组织工程的发展为皮肤修复和移植带来了新的希望，皮肤组织工程是一门将细胞生物学、工程学和材料学等多领域研究相结合的前沿交叉学科，主要内容是将体外培养的具有特定分化功能的种子细胞接种至具有良好细胞相容性的生物支架材料上，种子细胞能够在支架上黏附生长并增殖分化，最终形成具有类似天然皮肤结构和功能的组织工程化皮肤，移植替代病损组织，从而实现皮肤功能的全面重建[5-6]。
猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，SIS)是一种富含胶原、纤维粘连蛋白、黏多糖及蛋白多糖等物质的天然细胞外基质材料，做为生物支架材料在组织工程中被广泛应用[7]。SIS富含多种细胞生长因子，植入体内后这些物质在特定的活性状态下能充分发挥各自作用，迅速特异性诱导组织再生，另外SIS也具有良好的细胞相容性、抗微生物活性、降解产物无毒性等特点，是比较理想的组织工程皮肤替代材料[8-9]。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是常见的组织工程种子细胞，具有高度自我增殖能力、多向分化潜能及低免疫原性的特性，在创伤微环境中可分泌多种细胞因子促进损伤修复[10-11]。趋化因子受体7(chemokine receptor，CCR7)是趋化因子受体家族成员之一，近年来研究证实在多种肿瘤细胞中CCR7过表达[12-13]，CCR7通过与相应趋化因子结合后可以促进细胞增殖、新生血管生成[14]。
该研究通过腺病毒转染使外源性CCR7在BMSCs中过表达，与SIS共同培养后构建CCR7-BMSCs-SIS组织工程皮肤生物补片，探讨该补片在大鼠背部皮肤损伤中的修复效果及促血管再生能力，以期为皮肤修复提供新的可行性思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞实验，随机对照动物实验，两组间数据比较采用独立样本t 检验。
1.2 时间及地点 实验于2024年1-10月在宁夏医科大学基础医学院实验平台完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 出生3-5 d的SPF级SD大鼠乳鼠，雌雄不限，用于BMSCs的原代培养。SPF级成年雄性SD大鼠12只，体质量180-200 g，用以制作大鼠皮肤损伤模型。所有大鼠购自宁夏医科大学动物实验中心，动物许可证号：SYXK(宁)2020-0001。动物饲养设定温度为23-26 ℃，相对湿度为40%-50%，12 h明暗交替，正常喂养并保持笼内清洁干燥。动物实验方案通过宁夏医科大学总医院医学科研伦理审查委员会批准(批准号：KYLL-2022-0742)。
1.3.2 主要试剂和仪器 SIS(北京大清生物公司)；腺病毒[汉恒生物科技(上海)有限公司]；L-DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA(美国Gibco公司)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)；兔抗鼠CCR7、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、CD31、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、β-actin一抗(美国Abcam公司)；山羊抗兔辣根过氧化物酶偶联二抗(北京索莱宝科技有限公司)；Western blot体系(美国BIO-RAD公司)；活死细胞双染试剂盒(上海翌圣生物科技有限公司)；生物安全柜(中国苏净安泰公司)；荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯)；实时荧光定量PCR仪、恒温CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 BMSCs的分离及培养 将出生3-5 d的SD大鼠乳鼠颈椎脱臼处死后，以体积分数75%乙醇浸泡5 min，无菌分离股骨和肱骨，剪除骨两端并用5 mL含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基冲出骨髓到培养瓶中，采用贴壁法分离筛选BMSCs，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中常规培养。细胞长满后进行传代，按1∶2比例将细胞悬液接种至细胞培养瓶中继续培养。倒置相差显微镜观察细胞的生长情况，选取生长良好的第3代细胞进行后续实验。
1.4.2 过表达CCR7的腺病毒转染BMSCs 通过前期预实验确定最适感染复数为80，选取生长良好的的第3代BMSCs，用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基制成细胞悬液，以5×105个/孔密度接种至6孔板内，当细胞融合率达60%-70%时弃去上清培养基。以含目的基因CCR7的腺病毒转染BMSCs为CCR7组，以不含目的基因的空载体转染BMSCs为空载组，只加入培养基的BMSCs为对照组。培养72 h后荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白表达。
1.4.3 BMSCs转染效果评价
(1) Western blot实验检测BMSCs内CCR7的蛋白表达水平：收集各组BMSCs后加入RIPA裂解和提取缓冲液，用BCA方法测定蛋白浓度。取等量蛋白质通过SDS-PAGE电泳分离后转移到PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的封闭液进行封闭，加入兔抗鼠CCR7单克隆一抗(1∶1 000)及β-actin一抗(1∶20 000)，4 ℃孵育过夜，用0.05% TBST洗膜3次，每次10 min，加入山羊抗兔辣根过氧化物酶偶联二抗稀释液室温孵育2 h，用0.05%TBST洗膜3次，每次10 min，将ECL混合液滴至膜上于暗室中曝光显影。用Image J软件对蛋白条带进行半定量分析，最终结果以目的蛋白与内参的灰度值比值表示。

(2) RT-qPCR实验检测BMSCs内CCR7的mRNA表达水平：采用Trizol法提取各组BMSCs RNA并用紫外分光光度计测定RNA的含量。使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，反应条件：95 ℃预变性60 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，进行40个循环。选用β-actin作为内参，通过2-ΔΔCt计算目标基因的相对表达倍数。基因引物序列见表1。

1.4.4 CCR7-BMSCs与SIS膜的复合培养 取冻干、无菌处理的SIS膜以合适大小置于6孔板中，加入L-DMEM培养液浸润过夜后吸出培养基。取生长状态良好的第3代CCR7-BMSCs，用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基制成细胞悬液，以5×105个/孔密度接种至6孔板内，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，每2 d换液1次。
1.4.5 CCR7-BMSCs与SIS膜的细胞相容性研究
(1)扫描电镜观察：将冻干、无菌处理的SIS膜用梯度乙醇依次脱水后喷金处理，扫描电镜观察SIS膜表面孔径结构。分别取1.4.4中培养2，4 d的CCR7-BMSCs-SIS复合培养物，吸出培养基后从边缘滴加PBS清洗细胞3次，用2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定复合培养物，然后依次用体积分数75%，80%，95%乙醇进行梯度脱水，喷金处理后扫描电镜观察CCR7-BMSCs在SIS膜上的生长情况。
(2)活死细胞染色表征细胞活力：选用活死细胞染色试剂钙黄绿素和碘化丙啶检测细胞活性，取1.4.4中培养2，4 d的CCR7-BMSCs-SIS复合培养物，吸出培养基后从边缘滴加PBS清洗细胞3次。钙黄绿素和碘化丙啶分别用PBS稀释1 000倍后等体积混合配置活死细胞染色工作液，加入到孔板中覆盖细胞表面，37 ℃避光放置30 min后PBS清洗2次，荧光显微镜观察活细胞与死细胞染色情况。
1.4.6 大鼠创面模型的建立及治疗 将成年SD大鼠仰卧固定于手术台上，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉 (25-30 mg/kg)，背部皮肤去毛，使用0.5%碘伏消毒，无菌条件下手术器械于背部脊柱两侧切取2个直径均为2 cm的圆形全层皮肤缺损创面，6只实验组大鼠共12个创面用CCR7-BMSCs-SIS膜进行修复，6只对照组大鼠共12个创面用SIS膜进行修复，修复膜用缝线固定两端后缝合皮肤。术后观察大鼠饮食、活动、切口反应，大体观察有无材料外露，术区有无渗液、流脓及红肿等。
1.4.7 创面形态学观察及取材 追踪观察造模后1，3，7，14 d实验组及对照组创面愈合情况、有无感染、移植物与自体皮肤融合情况并拍照，通过Image J软件计算大鼠的创面面积。术后7，14 d各随机处死3只实验组大鼠及3只对照组大鼠，取移植材料及周边0.5-1.0 cm皮肤组织。
1.4.8 Western blot实验检测创面愈合组织中VEGF的蛋白表达水平 用全蛋白提取试剂盒提取样本总蛋白，BCA法进行蛋白浓度测定。等量蛋白质通过SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的封闭液进行封闭，加入兔抗鼠VEGF单克隆一抗(1∶1 000)及β-actin一抗(1∶40 000)，4 ℃孵育过夜，用0.05%TBST洗膜3次，每次10 min，加入山羊抗兔辣根过氧化物酶偶联二抗稀释液室温孵育2 h，用0.05%TBST洗膜3次，每次10 min，将ECL混合液滴至膜上于暗室中曝光显影。用Image J对蛋白条带进行半定量分析，最终结果以目的蛋白与内参的灰度值比值表示。
1.4.9 免疫组化染色检测创面愈合组织CD31及PCNA蛋白表达 皮肤组织块经甲醛固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋等步骤制作石蜡切片，切片厚3-5 μm。切片脱蜡后PBS冲洗3次，用5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，分别加入兔抗鼠CD31及PCNA一抗(1∶100)，湿盒中4 ℃孵育过夜，PBS冲洗后二抗孵育，倒置相差显微镜下观察组织切片中CD31及PCNA蛋白阳性表达。应用Image J软件处理免疫组化图片，每张切片随机选取5个不同视野计算阳性表达率。
1.5 主要观察指标 ①CCR7过表达腺病毒转染BMSCs的转染效果；②CCR7-BMSCs与SIS膜的细胞相容性研究；③大鼠皮肤缺损修复效果评价；④Western blot实验观察大鼠皮肤缺损修复组织中VEGF的蛋白表达；⑤免疫组化实验观察大鼠皮肤缺损修复组织中CD31和PCNA的蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过宁夏医科大学总医院统计学专家李锋教授审核。

讨论

组织工程皮肤是通过在体外培养扩增大量的功能细胞，复合到支架材料后通过细胞与支架相互作用，诱导、生长形成三维的有活性的皮肤替代物[15]。支架材料的选择是影响组织工程构建质量和移植效果的重要因素，目前SIS已经通过美国FDA批准广泛应用到临床各类皮肤损伤治疗中[16]。ZANG等[17]回顾性研究比较了使用SIS贴片及自体皮肤移植两种治疗方法修复80例手部软组织缺损的效果，通过对皮肤缺损面积、瘢痕美容评定、创面感觉恢复等指标进行评价，结果表明SIS贴片是一种适用于手部皮肤缺损治疗的生物材料，能使皮肤组织恢复更好的美容外观。JEFFERY等[18]通过大量的临床证据证明了在难以愈合的伤口和复杂的急性伤口中使用SIS来源的细胞基质材料会取得良好的临床效应。在一些基础性研究中，选择将干细胞与SIS膜复合培养运用于皮肤修复，GUO等[19]用热水在大鼠背部建立皮肤烧伤模型，分别用SIS膜和BMSCs-SIS培养物治疗，结果表明负载BMSCs的SIS具有更加积极的疗效；LEE等[20]将合适剂量的人脐血间充质干细胞与SIS凝胶混合物注射于大鼠背部，用以修复全层皮肤缺损，修复后3周，干细胞与SIS混合凝胶修复组伤口明显愈合，而单独干细胞修复组或单独SIS凝胶修复组伤口均未愈合。以上研究均表明SIS和BMSCs做为基质材料和种子细胞对人和动物皮肤损伤修复均具有良好的效果。在课题组前期的研究中，用SIS膜结合高分子材料获得了具有适当力学性能、降解性能的食管组织工程复合材料，同时也验证了含SIS的复合材料具有良好的细胞相容性、血液相容性和组织相容性[21]。
皮肤创面愈合是一个复杂的生物学过程，其中肉芽组织增生对于创面的修复及愈合发挥至关重要的作用，当皮肤损伤后，创面周围的血管启动了毛细血管的形成环节，血管内皮细胞开始分裂增生，毛细血管芽由此逐渐生成[22-23]。正常的血管生成是伤口愈合所必需的，而它的缺失也是人类慢性伤口的特征之一[24-25]。血管形成是一个相对复杂的过程，涉及细胞分子之间的复杂相互作用。CCR7是一种介导趋化因子行使功能的跨膜受体，在多种组织和细胞类型中表达，为7次跨膜的G-蛋白偶联受体，是由于B细胞感染EB病毒而被发现的[26]。近年来的研究证实，CCR7可通过多种细胞信号通路发挥作用促进VEGF的表达[27-29]，VEGF在血管新生过程中具有至关重要的作用，主要调节血管内皮细胞的存活、迁移、增殖等，同时也具有增加微血管通透性、维持血管完整性等功能，可支持新生血管和基质细胞的生成[30-31]。VEGF发挥促血管生成作用的机制之一是通过激活Ras/Raf/MEK/ERK级联信号通路来实现的，当VEGF与相应受体特异性结合后，激活关键蛋白RAS使之转化为活化态，进而激活细胞外信号调节激酶，活化的细胞外信号调节激酶通过调控一系列转录因子的表达来促进内皮细胞的增殖和迁移，推动血管生成的进程[32]。另外VEGF也可以通过激活Jak/STAT信号通路，调节细胞因子的表达，从而影响细胞的增殖与存活[33]；通过激活Notch信号通路，调控血管的形态发生及内皮细胞的分化[34]。这些信号通路之间相互作用、相互协调，共同构成了一个复杂而精细的网络，精确调控VEGF诱导的血管生成过程。
该研究通过腺病毒介导成功构建过表达CCR7的BMSCs，转染细胞内CCR7的mRNA、蛋白表达水平均较对照组和空载组明显上调。过表达CCR7的BMSCs与SIS膜复合培养后，扫描电镜观察及活死细胞染色实验结果均显示CCR7-BMSCs在SIS膜表面生长状况良好，二者具有良好的相容性，说明CCR7对细胞的生长并未产生不良的影响。选用SD大鼠成功建立了背部皮肤损伤模型，相较于SIS修复组，CCR7-BMSCs-SIS修复组大鼠创面愈合更快。CD31是血管内皮细胞的标志物，可将新生成的血管特异性着色[35]，PCNA在启动细胞增殖方面发挥着重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标[36]。CD31和PCNA两个指标均增高即可提示有新生的血管内皮细胞，间接反映了血管生成水平，也就是形成新生肉芽和伤口愈合的关键一步。术后7 d和14 d通过Western blot实验和免疫组化实验检测创面新生组织中血管生成相关标志物VEGF、CD31及PCNA的表达水平，结果均表明过表达CCR7的BMSCs提高了SIS的促创面修复及血管生成能力。
此研究存在一定的局限性：针对CCR7对BMSCs功能的影响未做相关研究。结合相关文献报道，CCR7激活后可通过一系列信号通路发挥促血管生成的功能[27-29]，作者猜测CCR7可能增强了BMSCs的促修复及血管生成能力，在接下来的研究中将进一步增加实验分组来验证这一猜想。同时该研究未进一步探究CCR7-BMSCs-SIS组织工程皮肤促血管生成的具体信号通路及详细机制，这也将在今后的实验中进一步探索。
综上所述，通过腺病毒转染法构建了能够稳定过表达CCR7的BMSCs，与SIS膜复合培养后修复大鼠背部皮肤缺损，结果显示过表达CCR7的BMSCs优化了SIS膜的促进皮肤修复与血管形成的能力，为组织工程学在皮肤创面修复中的研究和应用提供了新的可行性探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

趋化因子受体7-骨髓间充质干细胞复合猪小肠黏膜下层促进大鼠皮肤损伤修复

Chemokine receptor 7-bone marrow mesenchymal stem cells combined with porcine small intestinal submucosa promote skin repair in rats

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