健骨方对破骨细胞-成骨细胞的偶联效应及作用机制

doi:10.12307/2025.970

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (32): 6828-6835.doi: 10.12307/2025.970

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

健骨方对破骨细胞-成骨细胞的偶联效应及作用机制

卢秀丽1，许华珍1，陈玉兴2，3，姚楠2，3，胡子旋2，3，黄丹娥2，3

1广州中医药大学第五临床医学院，广东省广州市 510095；2广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)，广东省广州市 510095；3广东省中医药研究开发重点实验室，广东省广州市 510095

收稿日期:2024-06-17 接受日期:2024-08-28 出版日期:2025-11-18 发布日期:2025-04-25
通讯作者: 黄丹娥，副主任药师，广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)，广东省广州市 510095；广东省中医药研究开发重点实验室，广东省广州市 510095
作者简介:卢秀丽，女，2000年生，广州中医药大学第五临床医学院在读硕士，主要从事中药药理学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82104473)，项目负责人：黄丹娥；国家自然科学基金青年科学基金项目(82474347)，项目负责人：黄丹娥；广东省自然科学基金(2023A1515010752)，项目负责人：黄丹娥；广东省第二中医院科研创新基金项目(SEZYY2023A02)，项目负责人：姚楠

Mechanism of Jiangu Formula in treating osteoporosis based on osteoclast-osteoblast coupling

Lu Xiuli1, Xu Huazhen1, Chen Yuxing2, 3, Yao Nan2, 3, Hu Zixuan2, 3, Huang Dane2, 3

1The Fifth Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China; 2Guangdong Provincial Second Hospital of Traditional Chinese Medicine (Guangdong Provincial Engineering Technology Research Institute of Traditional Chinese Medicine), Guangzhou 510095, Guangdong Province, China; 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development in Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China

Received:2024-06-17 Accepted:2024-08-28 Online:2025-11-18 Published:2025-04-25
Contact: Huang Dane, Associate chief pharmacist, Guangdong Provincial Second Hospital of Traditional Chinese Medicine (Guangdong Provincial Engineering Technology Research Institute of Traditional Chinese Medicine), Guangzhou 510095, Guangdong Province, China; 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development in Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China
About author:Lu Xiuli, Master candidate, The Fifth Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510095, Guangdong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82104473 (to HDE); National Natural Science Foundation of China (Youth Program), No. 82474347 (to HDE); Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2023A1515010752 (to HDE); Guangdong Second Hospital of Traditional Chinese Medicine Scientific Research and Innovation Fund Project, No. SEZYY2023A02 (to YN)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
健骨方：参考广东省第二中医临床应用效果较佳的经验方，在中医基础理论的指导下，根据《太平圣惠方》治腰脚疼痛不止方和《医学启源》生脉散方加减化载而成。健骨方处方包含了骨碎补、牛膝、千年健、补骨脂、人参、麦冬、鸡血藤等7味中药。前期研究发现，健骨方可以通过抑制骨吸收促进骨形成起到双效抗骨质疏松治疗作用。
骨吸收-骨形成偶联：破骨细胞在分化、成熟过程中通过释放一些“偶联因子”如鞘氨醇-1-磷酸、Slit同源物3和补体C3a等，这些“偶联因子”的释放会诱导成骨细胞分化、沉积形成新骨，这个现象称为骨吸收-骨形成的“偶联”，是一种破骨细胞与成骨细胞之间的通讯方式。

背景：前期研究发现，健骨方可以通过抑制骨吸收促进骨形成起到双效抗骨质疏松的治疗作用，但其作用机制尚未阐明。
目的：考察健骨方对骨吸收-骨形成的偶联效应和作用机制。
方法：制备健骨方含药血清，通过MTT法测定健骨方含药血清对小鼠骨髓源巨噬细胞的毒性；应用CCK-8法测定健骨方含药血清对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响；采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色法测定健骨方含药血清对破骨细胞分化的抑制作用；制备健骨方条件培养基，通过碱性磷酸酶染色测定条件培养基偶联促进MC3T3-E1细胞成骨分化的作用；RT-qPCR法测定健骨方含药血清对破骨细胞偶联基因鞘氨醇激酶2、含胶原三螺旋重复蛋白1、Slit同源物3 mRNA水平以及条件培养基对骨形成相关基因分泌型磷酸蛋白1、碱性磷酸酶、SP7转录因子、酸性富含半胱氨酸分泌型蛋白 mRNA水平的影响。　
结果与结论：①MTT法和CCK-8法结果显示，健骨方含药血清在低于5%浓度下对细胞无显著毒性作用；②抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示，健骨方含药血清在2.5%、1.25%和0.63%浓度时剂量依赖性抑制破骨细胞的分化；③碱性磷酸酶染色结果显示，健骨方破骨细胞条件培养基呈剂量依赖性地促进成骨细胞分化；④RT-qPCR检测结果显示，0.63%健骨方含药血清可以提高破骨细胞源性偶联因子Slit同源物3和鞘氨醇激酶2的mRNA水平，其条件培养基可以提高骨形成相关基因分泌型磷酸蛋白1、SP7转录因子和酸性富含半胱氨酸分泌型蛋白mRNA表达水平；⑤提示健骨方含药血清能够在抑制骨吸收的情况下促进骨形成，其机制可能与促进骨吸收-骨形成偶联因子Slit同源物3和鞘氨醇激酶2的mRNA表达有关。
https://orcid.org/0009-0002-1160-9834(卢秀丽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 健骨方, 骨吸收, 骨形成, 骨质疏松症, 偶联, 破骨细胞, 成骨细胞, 骨稳态, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have found that Jiangu Formula can play a dual role in anti-osteoporosis therapy by inhibiting bone resorption and promoting bone formation, but its mechanism of action has not been elucidated.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Jiangu Formula on the coupling mechanism between bone resorption and bone formation at the cellular and molecular levels.
METHODS: Serum containing Jiangu Formula was prepared and its toxicity to bone marrow derived macrophages was determined using MTT assay. The cell proliferation ability of MC3T3-E1 cells that treated Jiangu Formula medicated serum was measured by using cell counting kit-8 method. Tartrate resistant acid phosphatase staining was used to determine the bone resorption inhibition effect of serum containing Jiangu Formula on osteoclast differentiation. The Jiangu Fang conditional culture medium was prepared and the promoting effect of the conditional culture medium on bone formation of MC3T3-E1 was determined through alkaline phosphatase staining. The effect of serum containing Jiangu Formula on the mRNA levels of osteoclast associated sphingosine kinase 2, collagen triple helix repeat containing 1, and slit homolog 3 coupled genes, as well as the effect of conditioned culture medium on the mRNA levels of bone formation related secreted phosphoprotein 1, alkaline phosphatase, Sp7 transcription factor, and secreted protein acidic and rich in cysteine genes, were determined by RT-qPCR method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The MTT and cell counting kit-8 methods showed that serum containing Jiangu Formula had no significant cytotoxic effects at a concentration of < 5%. (2) Tartrate resistant acid phosphatase staining results indicated that serum containing Jiangu Formula dose-dependently inhibited osteoclast differentiation at 2.5%, 1.25%, and 0.63% concentrations. (3) The alkaline phosphatase staining results showed that the osteoclast conditioned medium of Jiangu Formula promoted osteoblast differentiation in a dose-dependent manner. (4) In addition, RT-qPCR results showed that serum containing 0.63% Jiangu Formula could increase the mRNA levels of osteoclast derived slit homolog 3 and sphingosine kinase 2 coupling factors, and the conditional culture medium could increase the mRNA expression levels of bone formation related secreted phosphoprotein 1, Sp7 transcription factor, and secreted protein acidic and rich in cysteine. To conclude, the serum containing Jiangu Formula can promote bone formation while inhibiting bone resorption, and its mechanism may be related to the mRNA expression of the coupling factors osteoclast derived slit homolog 3 and sphingosine kinase 2 that promote bone resorption and bone formation.

Key words: Jiangu Formula, bone resorption, bone formation, osteoporosis, coupling, osteoclasts, osteoblasts, bone homeostasis, engineered tissue construction

中图分类号:

卢秀丽, 许华珍, 陈玉兴, 姚楠, 胡子旋, 黄丹娥. 健骨方对破骨细胞-成骨细胞的偶联效应及作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(32): 6828-6835.

Lu Xiuli, Xu Huazhen, Chen Yuxing, Yao Nan, Hu Zixuan, Huang Dane. Mechanism of Jiangu Formula in treating osteoporosis based on osteoclast-osteoblast coupling[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(32): 6828-6835.

图/表（结果） 5

2.1 健骨方含药血清对骨髓源巨噬细胞和MC3T3-E1细胞增殖的影响如图1显示，健骨方干预细胞24 h后，与空白组相比，10%，5%的健骨方含药血清组显著抑制了骨髓源巨噬细胞存活率(P < 0.01)，2.5%，1.25%，0.63%和0.33%的健骨方含药血清组对骨髓源巨噬细胞存活率没有显著性影响，提示2.5%健骨方含药血清及以下浓度对骨髓源巨噬细胞生长没有显著影响。
如图2所示，健骨方干预细胞24 h后，与空白组相比，10%的健骨方含药血清显著抑制了MC3T3-E1细胞存活率(P < 0.01)，其余各浓度的健骨方含药血清对MC3T3-E1细胞存活率没有影响，提示在5%及以下浓度健骨方含药血清对MC3T3-E1细胞生长没有影响。因此，后续实验选用2.5%、1.25%以及0.63%的健骨方含药血清浓度作为高、中、低剂量组。
2.2 健骨方含药血清对破骨细胞分化的影响 RANKL诱导骨髓源巨噬细胞破骨细胞分化模型的抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果如图3所示，与空白组相比，模型组的骨髓源巨噬细胞分化成不规则形状的细胞核数目≥3个的破骨细胞。与模型组相比，阿仑膦酸钠组和健骨方高(2.5%含药血清)、中(1.25%含药血清)、低(0.63%含药血清)剂量组的破骨细胞分化面积明显得到抑制(P < 0.01)，提示阿仑膦酸钠和健骨方能显著抑制破骨细胞生成，并且健骨方高、中、低剂量组呈现剂量依赖性地抑制破骨细胞生成。
2.3 健骨方条件培养基对成骨细胞分化的影响条件培养基是指健骨方含药血清干预破骨细胞成熟后收集的上清液，超滤去无机盐和健骨方化学成分，仅保留有破骨细胞分泌的活性因子的浓缩液。如图4破骨细胞染色所示，给予1 μmol/L阿仑膦酸钠和健骨方2.5%、1.25%和0.63%含药血清干预后，RANKL诱导的骨髓源巨噬细胞分化形成破骨细胞的数量明显减少。使用各组条件培养基干预MC3T3-E1细胞后，其ALP染色结果显示，与空白组相比，模型组成骨细胞分化增加(蓝色染色面积更多)，说明破骨细胞分化后的条件培养基里含有的活性因子有促进成骨细胞分化的作用；与模型组对比，健骨方各剂量组的条件培养基也具有明显促进成骨细胞分化的作用；而阿仑膦酸组的条件培养基则明显抑制成骨细胞分化。这些结果表明，健骨方不仅能够抑制破骨细胞分化，还能够保留破骨细胞偶联成骨细胞分化的能力。
2.4 健骨方含药血清对骨吸收-骨形成相关mRNA的影响为了进一步考察健骨方对骨吸收-骨形成偶联影响的机制，此次研究采用RT-qPCR法测定健骨方含药血清干预破骨细胞分化后破骨细胞源性偶联因子CTHRC1、SLIT3和SPHK2 mRNA表达水平，同时考察健骨方干预破骨细胞分化的条件培养基对成骨细胞分化关键基因ALP、SPP1、SP7和SPARC的mRNA表达情况。结合图3健骨方含药血清对破骨细胞分化抑制结果对偶联因子基因表达结果进行分析。如图5所示，与空白组相比，模型组破骨细胞分化形成，CTHRC1和SPHK2的mRNA表达水平显著上升(P < 0.01，P < 0.05)，且SLIT3表达水平也有上升的趋势，说明经过RANKL诱导的破骨细胞可以表达促进骨形成的偶联基因；与模型组相比，健骨方各剂量组在破骨细胞分化抑制情况下，显著抑制CTHCR1 mRNA表达水平(P < 0.01)，但其高、中剂量组在破骨细胞分化显著抑制的情况下对SLIT3 mRNA水平仍然没有显著影响，且低剂量组对SLIT3 mRNA表达水平有显著提高作用(P < 0.01)；同时中、低剂量组对SPHK2 mRNA表达水平也表现出显著上调的作用(P < 0.01)；而阿仑膦酸钠干预破骨细胞分化后，CTHRC1和SLIT3 mRNA水平显著降低(P < 0.01，P < 0.05)，且SPHK2 mRNA水平有下降的趋势。
破骨细胞分化条件培养基对成骨细胞分化关键基因表达的影响如图6所示，与空白组相比，模型组可显著提高成骨细胞分化关键基因ALP、SPP1和SPARC mRNA表达水平(P < 0.05-0.01)。与模型组比较，阿仑膦酸钠组成骨细胞中的ALP和SPARC的mRNA表达水平显著下调(P < 0.01)，而健骨方高剂量组显著提高SPP1 mRNA表达水平(P < 0.05)，且对ALP、SP7和SPARC mRNA表达水平没有显著影响；中剂量组能够显著提高ALP、SPP1、SP7和SPARC mRNA表达水平(P < 0.01)；低剂量组显著提升SPP1、SP7和SPARC mRNA表达水平(P < 0.01)，且对ALP没有显著影响。这些结果表明，健骨方在抑制破骨细胞分化的情况下，可能通过上调SLIT3、SPHK2的mRNA表达发挥偶联促进成骨细胞分化的作用，而阿仑膦酸钠对骨吸收-骨形成偶联的抑制效应与其抑制相关偶联因子的表达水平有关。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞干预实验。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2023年5月在广东省第二中医院中药药理(毒理)研究室完成。
1.3 材料
1.3.1 动物雌性SD大鼠10只，3月龄，体质量(280.65±20.32) g，实验动物合格证号：44007200089088；雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，体质量18-20 g，实验动物合格证号：44007200088576。实验动物均购自广东省实验动物中心，生产许可证号：SCXK (粤) 2018-0002。动物实验环境：广东省中医药工程技术研究院SPF级动物实验室[设施使用许可证号 SYXK(粤)2020-0059]。实验方案经广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)动物实验伦理委员会批准，批准号为048880。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 细胞 MC3T3-E1 细胞，购自上海中乔新舟生物科技公司。
1.3.3 药品健骨方(批号：20200615)：骨碎补购自广东天泰药业有限公司(批号：210901)、牛膝购自广东省药材公司中药饮片厂(批号：N1421514)、千年健购自岭南中药饮片有限公司(批号：2104001)、补骨脂购自哈尔滨普方药业饮片有限公司(批号：200401)、人参购自岭南中药饮片有限公司(批号：2107003)、麦冬购自岭南中药饮片有限公司(批号： 2109004)、鸡血藤购自广东源生泰药业有限公司(批号：21100103)，每克浸膏所含生药量为5.63 g；阿仑膦酸钠购自上海懋康生物有限公司(纯度≥98%，批号：2006S18175)。
1.3.4 主要试剂 Penicillin-Streptomycin双抗购自Corning(批号：30002321)；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及相关目的基因，购自生工生物工程股份有限公司；胎牛血清购自美国Gibco(批号：2254367R)；α-MEM培养基购自美国Gibco(批号：8121307)；巨噬细胞集落刺激因子购自美国Sigma(批号：315-02)；MTT 检测试剂购自索莱宝(批号：M1020)；总RNA提取试剂 Trigol购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司(批号：NEP019-2)；SYBR GREEN PRO TAQ HS预混合qPCR试剂盒购自艾科瑞生物(批号：AG11701)；成骨诱导培养基购自美国PYTHONBIO公司(批号：20220104)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒购自SIGMA-ALORICH公司(批号：SLBZ5562)；BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自碧云天公司(批号：121820210304)；茜素红S染料购自SIGMA-ALORICH 公司(批号：MKCC2711)。
1.3.5 主要仪器 DMI8倒置荧光显微镜购自德国Leica公司；Varioskan Flash型全波长多功能酶标仪购自美国Thermo公司；C1000型荧光定量PCR仪器购自美国Bio-Rad公司；StepOnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo公司；Class Ⅱ Type B2型生物安全柜购自新加坡Esco公司；HH-6数显恒温水浴锅购自金坛市富华仪器有限公司；RWD510小动物麻醉机购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。
1.4 方法
1.4.1 健骨方提取物的制备健骨方提取物按照课题组已报道的方法制备[24]：首先根据处方用药量将药材混合后加水浸泡；浸泡30 min后，将中药和浸泡液至于砂锅中大火煮至沸腾，随后开中火微沸2 h，用纱布将药液过滤出来，剩余药渣复煎30 min后，再次过滤收集药液；最后将2次煎煮所得药液浓缩至含生药量为5.63 g/g的浸膏，置于-20 ℃冷冻备用。
1.4.2 健骨方含药血清的制备含药血清制备参考已报道的实验方法[25]：①取SD大鼠10只，编号，采用完全随机分组的方法，将编号后的大鼠随机分为2组，每组5只，空白组给予10 mL/(kg·d)生理盐水灌胃，健骨方含药血清组给予健骨方生药10.8 g/(kg·d)灌胃(临床剂量是根据《中国药典》规定的单一中药最大临床剂量确定的，根据《中药药理研究方法学》中的“体表面积比”法换算，得到大鼠临床等效剂量为生药5.4 g/kg，此次实验选用了生药10.8 g/kg是2倍临床等效剂量，可参考文献[23])；②适应性喂养1周后，连续灌胃7 d；③在第7天灌胃1 h后，使用RWD510小动物麻醉机，以3%异氟烷麻醉大鼠，待大鼠麻醉后以腹主动脉采血的方法获取含药全血；④3 000 r/min离心10 min，取血清；⑤在56 ℃水浴灭活含药血清 30 min后，过滤除菌，放在-20 ℃冷冻备用。

1.4.3 骨髓源巨噬细胞培养及鉴定参考文献报道的方法[26]，取C57BL/6小鼠，使用RWD510小动物麻醉机，以3%异氟烷麻醉小鼠，待小鼠麻醉后断颈处死，置于体积分数75%乙醇中消毒，并分离出股骨。取小鼠股骨骨髓细胞，用含30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的完全培养基(含体积分数10%无菌胎牛血清、1%双抗的α-MEM-基础培养基)于CO2培养箱培养。在巨噬细胞集落刺激因子的作用下，骨髓细胞悬液中的骨髓源巨噬细胞能够存活下来并贴壁、增殖。取巨噬细胞集落刺激因子刺激24 h后产生的贴壁细胞开展细胞毒性实验和破骨细胞分化实验。

1.4.4 MTT法测定健骨方对骨髓源巨噬细胞的毒性取1.4.3培养得到的骨髓源巨噬细胞，以1×104个/孔密度接种于96孔板中，细胞放置CO2培养箱中培养24 h后，以每组3个复孔为单位，根据96孔板的排布，随机分组。除空白对照组外，给药组分别加入不同浓度健骨方含药血清(10%，5%，2.5%，1.25%，0.63%，0.33%)[24]，继续培养24 h。随后，采用MTT法检测细胞存活率：弃细胞上清，每孔加入20 μL(5 mg/mL)MTT溶液，置于37 ℃培养箱中孵育4 h。待细胞与MTT全部结合形成紫色结晶后，每孔加入150 μL DMSO振摇15 min，使底部结晶充分溶解。最后于490 nm波长读取吸光度值，计算细胞存活率。
1.4.5 CCK-8法测定健骨方对成骨细胞增殖的影响 MC3T3-E1细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，培养24 h后，以每组3个复孔为单位，根据96孔板的排布，随机分组。除空白对照组外，加入不同浓度的健骨方含药血清(10%，5%，2.5%，1.25%，0.63%，0.33%)[24]，继续培养24 h。按照CCK-8试剂使用说明书提供的方法，分别向每孔加入10 μL CCK-8工作液，细胞培养箱中继续培养 1 h，最后于450 nm波长测定吸光度值。
1.4.6 健骨方抑制破骨细胞分化活性测定和条件培养基制备骨髓源巨噬细胞用含20 ng/mL 巨噬细胞集落刺激因子的α-MEM完全培养基制备成混悬液，并以1×104个/孔密度接种于96孔板中。培养24 h后，以每组3个复孔为单位，根据96孔板的排布随机分组，分别为空白对照组、模型组、阿仑膦酸钠组(1 μmol/L)、健骨方高、中、低剂量组(分别含有2.5%、1.25%和0.63%含药血清)。除空白对照组外，每组加入100 ng/mL核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)进行破骨细胞分化诱导，同时加入相应的药物进行干预。隔天换液，连续培养5 d后，破骨细胞分化完成。收集各组破骨细胞分化过程的上清液，使用Amicon超滤管将上清液浓缩至原有体积的1/10，并以PBS进行溶液置换。之后，用40 g/L多聚甲醛固定细胞，并按抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒说明书进行染色，随后用显微镜观察≥3个核的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞。计算每孔所产生的破骨细胞所占的面积，记录数值。
1.4.7 破骨-成骨细胞偶联功能测定 MC3T3-E1细胞以3×104个/孔密度接种于24孔板中，培养24 h后随机分组，分别为空白对照组、模型组、阿仑膦酸钠组(1 μmol/L)、健骨方高、中、低剂量组(分别含有2.5%、1.25%和0.63%含药血清)。空白对照组更换完全培养基，除空白对照组外其余各组换成骨诱导分化培养基，每组加入相应的10%条件培养基，每个浓度设置3个复孔。隔天更换1次培养液，连续培养7 d后，按照BCIP/NBT 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)显色试剂盒说明书的方法对细胞内的ALP进行染色，染色结束后置于显微镜下观察并记录染色结果。
1.4.8 偶联因子和成骨细胞分化基因表达水平测定按照1.4.6和1.4.7描述的方法，破骨细胞分化成熟或条件培养基干预MC3T3-E1成骨细胞分化7 d后，采用PBS将细胞清洗1次，每孔加入1 mL Trizol 提取细胞总RNA；随后，参考PCR试剂盒操作说明书的方法，将mRNA反转录为cDNA；最后，取0.5 μg cDNA，根据(5×)PrimeScript RT Master Mix反转录试剂盒说明书加入规定量的反应试剂，并放入RT-qPCR仪中对目的基因进行扩增。检测的目的基因包括破骨细胞分泌的促进骨形成的偶联基因鞘氨醇激酶2(Sphingosine kinase 2，SPHK2)、CTHRC1和SLIT3，以及促进成骨细胞分化的ALP、分泌型磷酸蛋白1(secreted phosphoprotein 1，SPP1)、SP7转录因子(Sp7 transcription factor，SP7也称osterix)和酸性富含半胱氨酸分泌型蛋白(secreted protein acidic and cysteine rich，SPARC)。结果运用2-ΔΔCt法计算各组目的基因与内参基因GADPH的相对表达量。目的基因引物序列如表1所示。

1.5 主要观察指标考察健骨方干预后：①骨髓源巨噬细胞和MC3T3-E1细胞的增殖能力；②破骨细胞分化的抑制作用；③破骨细胞偶联成骨细胞分化的效应；④破骨细胞源性偶联因子和成骨细胞分化相关基因的表达水平。
1.6 统计学分析首先使用SPSS 26.0软件对数据进行分析统计，所用正态计量资料以x±s表示，多组间均值比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间均值两两比较使用SNK检验；P < 0.05表示组间差异有显著性意义。使用GraphPad Prism 9完成统计可视化图片处理。文章统计学方法已经广州中医药大学第五临床医学院生物统计学专家审核。

讨论

骨骼的健康主要依赖于骨重塑过程中破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成对骨骼的持续更新以维持正常的机械力和钙稳态。衰老或雌激素缺乏等病理状态下，骨吸收功能大于骨形成功能，骨流失加剧，导致骨量减少、骨组织微结构退化，引发骨质疏松症[1-2]。据统计，全球每年因骨质疏松而发生的脆性骨折患者约有900万[3]，预计到2050年国内骨质疏松症或骨密度低的患者将达到2.12亿[4-5]。随着老龄化社会的加剧，骨质疏松症已经成为严重危害人类健康和社会经济发展的重大老年性慢性疾病[6]。
破骨细胞是目前发现的唯一具有骨吸收功能的细胞，它的过度活跃也被认为是骨质疏松症发生的核心因素[7-8]。
因此，抑制破骨细胞过度活跃所致的骨吸收是临床上治疗骨质疏松的核心疗法[9-11]。然而越来越多的研究表明，在骨重塑过程中，破骨细胞除了负责吸收衰老或受损的骨质之外，还能够在细胞分化、成熟和吸收骨基质的过程中分泌含胶原三螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1)、Slit同源物3(slit homolog 3，SLIT3)、磷脂酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)等“偶联因子”，促进成骨细胞前体细胞的招募并分化形成新生骨质[12-14]。这种由破骨细胞介导骨吸收随后通过偶联因子传递信号诱导成骨细胞分化促进骨形成的过程，也被称之为“破骨细胞-成骨细胞偶联”[15-16]。由此可见，在骨质疏松治疗中，抑制破骨细胞介导的骨吸收需要同时保留其偶联成骨细胞分化的功能[17-18]。然而，多项临床研究发现以双膦酸盐类药物为代表的临床一线骨吸收抑制剂，虽然在使用的早期阶段(通常是5年以内)具有良好的治疗效果，但更长时间的使用会产生骨痛、下颌骨坏死、骨脆、不规则骨折发生率增加等严重的不良反应[19-21]，其原因与现有抗骨吸收药物抑制破骨细胞介导的骨吸收同时也抑制了破骨细胞偶联促进成骨细胞分化的功能有关[22-23]。因此，寻找能够不影响骨形成的抗骨吸收药物是当前抗骨质疏松治疗领域的主要目标。
课题组前期研究发现，补肾中药方剂——健骨方在抗骨质疏松治疗中具有骨吸收抑制和骨形成促进的双重效应[23-24]，但其作用机制尚未阐明。此次研究拟采用体外破骨细胞分化模型和破骨-成骨细胞间接共培养模型，研究健骨方对破骨细胞分化的抑制作用及其对破骨细胞偶联成骨细胞分化的影响，同时从破骨细胞源性偶联因子分泌的角度探讨健骨方对破骨细胞-成骨细胞偶联的调控机制，为健骨方抗骨质疏松治疗提供理论依据。
近年来越来越多的研究表明，破骨细胞在分化和成熟的过程中，可以通过分泌偶联相关活性因子与成骨细胞前体细胞发生相互作用，进而促进成骨细胞分化和矿化，进而维持骨重塑过程中骨吸收与骨形成之间的平衡[33]。目前，已有CTHRC1、SLIT3、S1P和补体C3a、核因子κB 受体激活因子囊泡、WNT家族成员10B和骨形态发生蛋白6等多个破骨细胞来源的偶联因子被鉴定出具有促进成骨细胞分化的能力[34-36]。在机体骨骼新陈代谢过程中，破骨细胞介导的旧骨或受损骨质的吸收和成骨细胞介导的新骨形成之间的相对平衡对维持骨机械力和钙稳态起着至关重要的作用，当骨吸收的速度大于骨生成速度时，即破坏骨稳态，引起骨质疏松[37]。然而，因破骨细胞同时促进骨吸收和骨形成的双重效应，临床常用的抗骨吸收抑制剂，尤其是双膦酸盐类这一类的强效破骨细胞抑制剂，长期使用将会有一定的骨形成减少相关不良反应，其原因可能与破骨细胞源性偶联因子的分泌抑制有关，从而从另一层面上抑制了成骨细胞分化，导致新骨形成障碍[23，34]。
健骨方具有补肾强骨、健脾益气、活血止痛的作用，是临床治疗骨质疏松的常用方。此次研究测定了健骨方含药血清对破骨细胞分化的抑制作用，结果显示在无细胞毒性浓度下，健骨方呈现剂量依赖性地抑制RANKL诱导的破骨细胞分化，在考察浓度范围2.5%-0.63%内均对破骨细胞有显著的抑制作用。破骨-成骨细胞间接共培养模型实验表明，2.5%-0.63%健骨方含药血清破骨细胞条件培养基能够维持正常的偶联促进成骨细胞分化的功能并显著提高成骨分化关键基因SPP1 mRNA的表达水平。此外，健骨方含药血清浓度为1.25%时，对成骨分化关键基因ALP、SPP1、SP7和SPARC都表现出显著的促进作用，进一步表明健骨方不会抑制骨吸收-骨形成偶联功能。在健骨方含药血清浓度为2.5%情况下，破骨细胞分化受到极大抑制，但破骨细胞源性偶联因子相关基因表达检测结果显示，促进骨形成的偶联因子相关基因如SLIT3、SPHK2的mRNA表达仍然不影响；当健骨方含药血清浓度降低至0.63%时，破骨细胞抑制降低，同时也能够观察到SLIT3、SPHK2表达水平的升高。临床数据也显示，血浆中破骨细胞源性偶联因子SLIT3水平与骨密度水平呈正相关[13]；SPHK2是鞘氨醇激酶的其中一种亚型，是调控破骨细胞源性偶联因子S1P合成的一种关键酶[38]。由此推测，健骨方抑制骨吸收促进骨形成的双效抗骨质疏松作用可能与增加破骨细胞源性偶联因子SLIT3和SPHK2的表达水平有关。
此次研究发现健骨方治疗骨质疏松具有同时抑制骨吸收又促进骨形成的双重效应的潜在作用机制，提示破骨细胞源性偶联因子分泌这一视角有望为骨质疏松治疗中维持正常骨吸收-骨形成偶联提供新的解决思路。后续将进一步研究健骨方调控破骨细胞源性偶联因子表达的作用靶点，为开发不影响正常骨吸收-骨形成偶联的抗骨质疏松药物提供理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

健骨方对破骨细胞-成骨细胞的偶联效应及作用机制

Mechanism of Jiangu Formula in treating osteoporosis based on osteoclast-osteoblast coupling

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