去铁胺减轻糖皮质激素抑制成骨分化的作用途径

doi:10.12307/2026.525

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (32): 6821-6827.doi: 10.12307/2026.525

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去铁胺减轻糖皮质激素抑制成骨分化的作用途径

唐昊旭1，2，梁英杰1，李策1，丁鹏霖1，钱闵龙1，袁伶俐1

1蚌埠医科大学第二附属医院骨科，安徽省蚌埠市 233002；2组织移植安徽省重点实验室，安徽省蚌埠市 233000

收稿日期:2024-10-08 接受日期:2024-12-12 出版日期:2025-11-18 发布日期:2025-04-25
通讯作者: 袁伶俐，硕士，副教授，主任医师，硕士生导师，蚌埠医科大学第二附属医院骨科，安徽省蚌埠市 233002
作者简介:唐昊旭，男，1998年生，湖南省郴州市人，汉族，蚌埠医科大学在读硕士，主要从事骨相关研究。
基金资助:
安徽省高等学校自然科学研究项目(KJ2021A0756)，项目负责人：袁伶俐；蚌埠医学院2023年度研究生科研创新计划(Byycxz23046)，项目负责人：唐昊旭

Deferoxamine alleviates the inhibitory effect of glucocorticoids on osteogenic differentiation

Tang Haoxu1, 2, Liang Yingjie1, Li Ce1, Ding Penglin1, Qian Minlong1, Yuan Lingli1

1Department of Orthopaedics, The Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, Bengbu 233002, Anhui Province, China; 2Anhui Province key Laboratory of Tissue Transplantation, Bengbu 233000, Anhui Province, China

Received:2024-10-08 Accepted:2024-12-12 Online:2025-11-18 Published:2025-04-25
Contact: Yuan Lingli, Master, Associate professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopaedics, The Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, Bengbu 233002, Anhui Province, China
About author:Tang Haoxu, Master candidate, Department of Orthopaedics, The Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, Bengbu 233002, Anhui Province, China; Anhui Province key Laboratory of Tissue Transplantation, Bengbu 233000, Anhui Province, China
Supported by:
Natural Science Research Project of Higher Education Institutions in Anhui Province, No. KJ2021A0756 (to YLL); Bengbu Medical University 2023 Graduate Student Research and Innovation Program, No. Byycxz23046 (to THX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
低氧诱导因子1α：缺氧诱导因子由低氧诱导因子1α和低氧诱导因子1β 2个亚基组成，与缺氧应答元件相互作用，进而调控靶基因的表达，是细胞对缺氧反应的关键转录调节因子。低氧诱导因子1α作为骨组织工程的有效调节剂，可促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。
去铁胺：是一种铁螯合剂，经美国食品药品监督管理局批准用于临床治疗铁过量。作为低氧诱导因子1α的稳定剂，去铁胺可有效上调低氧诱导因子1α及相关下游血管生成因子，加速血管形成。

背景：去铁胺具有调节干细胞、调节免疫、促进血管形成和成骨等多种功能，但它在地塞米松诱导的成骨细胞成骨抑制中的作用仍不清楚。
目的：探究去铁胺通过低氧诱导因子1α/血管内皮生长因子信号通路对地塞米松处理的成骨细胞的影响及其潜在的作用机制。
方法：采用CCK8法检测不同浓度去铁胺对MC3T3-E1细胞干预24，48，72 h的增殖效果，筛选出最佳干预浓度。实验设置对照组、地塞米松组、地塞米松+去铁胺10 μmol/L组、地塞米松+去铁胺 20 μmol/L组，采用CCK8和流式细胞术检测，评估去铁胺对地塞米松诱导的细胞增殖和凋亡的影响。通过碱性磷酸酶染色和活性测定评估MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶水平，茜素红染色用于比较矿化结节的形成，Western blot用于检测成骨和信号通路蛋白的表达。
结果与结论：①去铁胺在5-20 μmol/L范围内对MC3T3-E1细胞无明显毒性作用，且可改善地塞米松对MC3T3-E1细胞的增殖抑制和细胞凋亡作用；②与地塞米松组相比，去铁胺组可提高碱性磷酸酶活性和细胞矿化度，还能显著增加MC3T3-E1细胞中骨桥蛋白、Runt相关转录因子2和碱性磷酸酶的蛋白表达水平；③去铁胺还能激活地塞米松处理MC3T3-E1细胞的低氧诱导因子1α/血管内皮生长因子通路；④结果表明，去铁胺能够减轻地塞米松处理引起的成骨细胞凋亡，并通过激活低氧诱导因子1α/血管内皮生长因子信号通路来维护成骨细胞的活力，同时促进其增长，这可能有助于延缓激素引起股骨头坏死的发展。
https://orcid.org/0009-0007-2679-8611(唐昊旭)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: MC3T3-E1细胞, 股骨头坏死, 成骨分化, 糖皮质激素, 低氧诱导因子1α, 血管内皮生长因子, 去铁胺

Abstract: BACKGROUND: Deferoxamine exhibits multiple functions such as stem cell modulation, immune regulation, and promotion of angiogenesis and osteogenesis, but its role in the osteoinhibition induced by dexamethasone in osteoblasts remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of deferoxamine on osteoblasts treated with dexamethasone through the hypoxia-inducible factor 1α/vascular endothelial growth factor signaling pathway and to explore its potential mechanisms of action.
METHODS: The proliferation of MC3T3-E1 cells treated with various concentrations of deferoxamine for 24, 48, and 72 hours was assessed using the cell counting kit-8 assay to determine the optimal intervention concentration. There were control, dexamethasone, dexamethasone plus deferoxamine 10 μmol/L, and dexamethasone plus deferoxamine 20 μmol/L groups in the experiment. Cell counting kit-8 assay and flow cytometry were employed to evaluate the effect of deferoxamine on dexamethasone-induced cell proliferation and apoptosis. Alkaline phosphatase staining and activity assays were conducted to assess alkaline phosphatase levels in MC3T3-E1 cells. Alizarin red staining was used to observe the formation of mineralized nodules. Western blot was employed to detect the expression of osteogenic and signaling proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Deferoxamine showed no significant cytotoxicity to MC3T3-E1 cells within the range of 5-20 μmol/L and could ameliorate the inhibitory effects of dexamethasone on MC3T3-E1 cell proliferation and apoptosis. (2) Compared with the dexamethasone group, deferoxamine groups increased alkaline phosphatase activity and cell mineralization, and also significantly increased the protein expression of osteopontin, runt-related transcription factor 2, and alkaline phosphatase in MC3T3-E1 cells. (3) Deferoxamine also activated the hypoxia-inducible factor 1α/vascular endothelial growth factor pathway in dexamethasone-treated MC3T3-E1 cells. To conclude, deferoxamine can alleviate apoptosis in osteoblasts induced by dexamethasone treatment, maintain the vitality of osteoblasts by activating the hypoxia-inducible factor 1α/vascular endothelial growth factor signaling pathway, and promote their proliferation, which may help delay the progression of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head.

Key words: MC3T3-E1 cells, osteonecrosis of the femoral head, osteogenic differentiation, glucocorticoids, hypoxia-inducible factor 1α, vascular endothelial growth factor, deferoxamine

中图分类号:

唐昊旭, 梁英杰, 李策, 丁鹏霖, 钱闵龙, 袁伶俐. 去铁胺减轻糖皮质激素抑制成骨分化的作用途径[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(32): 6821-6827.

Tang Haoxu, Liang Yingjie, Li Ce, Ding Penglin, Qian Minlong, Yuan Lingli. Deferoxamine alleviates the inhibitory effect of glucocorticoids on osteogenic differentiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(32): 6821-6827.

图/表（结果） 6

2.1 不同浓度去铁胺对MC3T3-E1成骨细胞活力的影响为了研究去铁胺对细胞活力的影响，采用CCK-8法进行测定。在以5-75 μmol/L的递增剂量向MC3T3-E1细胞加入去铁胺干预24，48，72 h后，结果显示去铁胺浓度在5-20 μmol/L的范围内对细胞没有毒性作用(图1A)。因此，选择10 μmol/L和20 μmol/L浓度的去铁胺作为后续实验中的处理药物。
2.2 去铁胺改善地塞米松对MC3T3-E1成骨细胞增殖的抑制作用采用CCK-8法观察去铁胺对地塞米松干预的MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响。CCK-8检测结果显示，地塞米松与MC3T3-E1成骨细胞共孵育3 d后，细胞增殖明显受到抑制(P < 0.001)，而联合应用去铁胺组(10 μmol/L和20 μmol/L)改善了地塞米松干预对MC3T3-E1成骨细胞的抑制作用(P < 0.001)(图1B)。
2.3 去铁胺增强地塞米松干预的MC3T3-E1细胞活性采用CalceinAM/PI活死细胞双染法检测不同处理条件的MC3T3-E1细胞活性。其中绿色荧光细胞代表活细胞，红色荧光细胞代表死细胞，结果显示地塞米松干预MC3T3-E1细胞后出现大量的死细胞，而加入了去铁胺后死细胞的数量明显下降(图1C)。
2.4 去铁胺减轻地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡 AnnexinV-FITC细胞凋亡检测结果提示，与对照组相比，地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞发生凋亡的细胞数显著增多(P <

0.001)，而加入去铁胺后细胞凋亡率较地塞米松组显著降低(P < 0.001)，这表明去铁胺能够抑制地塞米松诱导的细胞凋亡，并为MC3T3-E1细胞提供了一定程度的保护作用(图2)。

2.5 去铁胺增加地塞米松处理MC3T3-E1细胞中的碱性磷酸酶活性在细胞成骨诱导1周后，进行碱性磷酸酶碱性染色及活性检测。实验结果显示，地塞米松组中，碱性磷酸酶阳性细胞的数量显著减少，且单个细胞的碱性磷酸酶染色强度比对照组有所降低。相比之下，当添加去铁胺后，紫染色阳性细胞的数量显著增加，且染色强度也更为浓郁。碱性磷酸酶活性检测进一步说明结果地塞米松对细胞碱性磷酸酶活性有抑制作用；相反，去铁胺可显著减轻地塞米松对碱性磷酸酶活性的抑制作用(图3)。

2.6 去铁胺减轻地塞米松对MC3T3-E1细胞矿化的抑制作用将各组MC3T3-E1细胞在成骨诱导培养基中培养3周，进行茜素红染色。结果显示地塞米松组红染的钙结节数量较对照组明显减少，而加入去铁胺组细胞中钙结节的数量较地塞米松组明显增多(图4)。

2.7 去铁胺促进地塞米松干预的MC3T3-E1细胞成骨分化相关蛋白的表达地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞骨桥蛋白、Runt相关转录因子2和碱性磷酸酶的表达水平显著降低；而与地塞米松组相比，10，20 μmol/L去铁胺组降低了地塞米松的抑制作用，并显著增高了骨桥蛋白、Runt相关转录因子2和碱性磷酸酶3种成骨蛋白的表达水平(图5)。

2.8 去铁胺激活地塞米松处理的MC3T3-E1细胞中的HIF-1α信号通路为进一步探究去铁胺对地塞米松处理的MC3T3-E1细胞HIF-1α信号通路的影响，采用Western Blot对HIF‐1α和VEGF蛋白表达量进行检测。结果显示，地塞米松显著降低了HIF‐1α和VEGF蛋白表达的水平。相反，去铁胺组(10，20 μmol/L)降低了地塞米松的抑制作用，并显著升高了HIF‐1α和VEGF蛋白的表达水平(图6)。

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引言

激素性股骨头坏死是一种常见的进行性骨科疾病，最终导致关节软骨塌陷和骨关节炎[1-2]。目前的研究认为激素性股骨头坏死可能与多种因素有关，包括脂质代谢紊乱、骨髓间充质细胞成骨能力下降、炎症和凋亡、血供不足、遗传多态性等[3-8]。成骨细胞是负责骨形成的主要功能细胞，对于维持健康的骨代谢和预防骨坏死至关重要[9-10]。此外，地塞米松可以导致成骨细胞凋亡，引起激素性股骨头坏死的发生[11]。关节置换术现在是激素性股骨头坏死最常见的治疗方法，但其效果有限[12]。因此，迫切需要研究可以有效减轻或延迟激素性股骨头坏死的预防措施和早期干预策略。
缺氧被认为是骨坏死的主要病理生理特征[13]。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)由HIF-1α和HIF-1β 2个亚基组成，与缺氧应答元件相互作用，进而调控靶基因的表达，是细胞对缺氧反应的关键转录调节因子[14]。HIF-1α可被活性氧通过抑制脯氨酰羟化酶激活。脯氨酰羟化酶负责通过蛋白酶体途径降解HIF-1α[15]。HIF-1α通过控制成骨细胞分化在调节骨稳态中发挥重要作用[16]。先前的动物研究报告，通过全身给予脯氨酰羟化酶抑制剂来稳定HIF-1α，可预防年龄相关的骨丢失[17]，研究发现，HIF-1α通过影响骨髓源性巨噬细胞的破骨细胞分化和骨髓间充质干细胞的成骨分化，参与骨关节炎、骨质疏松、骨折和骨坏死等疾病的发生和进展[18]。作为HIF-1α的靶基因，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是骨生成和血管生成过程中的重要成分[19-20]。VEGF可以刺激血管再生长至骨损伤部位[21-22]。
研究显示，激素引发的股骨头坏死的病理过程与HIF-1α/VEGF通路异常紧密相关[23]。结合HIF-1α和VEGF的作用机制，可以看出糖皮质激素降低了HIF-1α的表达，从而降低了VEGF的表达，导致血管生成减少，然后破坏骨微循环，进而导致激素性股骨头坏死[24]。这些研究结果提示，HIF-1α可能为预防激素性股骨头坏死提供了一个潜在的有效靶点。
去铁胺是一种铁螯合剂，经美国食品药品监督管理局批准用于临床治疗铁过量。作为HIF-1α的稳定剂，去铁胺可有效上调HIF-1α及相关下游血管生成因子，从而加速血管形成[25]，这一作用对于促进骨折的愈合过程[26]、增强胫骨的骨质稳定性[27]，以及促进骨修复至关重要。并可通过减少铁过载和增加骨量来改善骨骼健康[28]。最近的研究表明，去铁胺作为HIF-1α的稳定剂可以刺激血管生成和骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化[29-30]。
目前尚不明确去铁胺是否通过HIF-1α/VEGF信号通路发挥作用，以降低地塞米松诱导的成骨细胞凋亡并维持其活性。因而，此次研究旨在应用地塞米松处理成骨细胞，观察去铁胺对HIF-1α/VEGF信号通路的调控效果及其对成骨细胞的影响，以探索去铁胺在预防激素性股骨头坏死中的潜在作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2023年5月至2024年8月在蚌埠医科大学组织移植安徽省重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞与药物此次研究选用的成骨细胞为小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1，购自icell赛百慷生物科技有限公司；地塞米松(货号：D8040，北京索莱宝科技有限公司)；甲硫酸去铁胺(货号：D302525，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。
1.3.2 试剂 MEMα培养基(货号：PM150421)、特级胎牛血清(货号：164210)、PBS(货号：PB180327)、无血清细胞冻存液(PB180438)均为普诺赛生命科技有限公司产品；胰酶细胞消化液(0.25%胰蛋白酶)(货号：BL526A)、青霉素-链霉素溶液(货号：BL505A)、CCK-8试剂(货号：BS350B)均为Biosharp公司产品；Live-Dead Cell Staining Kit I (Calcein AM/PI)(货号：K2247，美国APExBIO公司产品)；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(货号：C3206)、RIPA总蛋白裂解液(货号：P0038)均为上海碧云天生物技术有限公司；碱性磷酸酶测定试剂盒(货号：A059-2，南京建成生物工程研究所有限公司)；茜素红染液(货号：G1450，索莱宝科技有限公司)；AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(货号：BB-4101，贝博生物科技公司)；Trizol试剂盒(货号：15596018CN，美国Invitrogen公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：ZJ102)、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(货号：PG112)均为雅酶生物医药科技有限公司；蛋白上样缓冲液(货号：04934878，上海泰坦科技股份有限公司)；抗体Runt相关转录因子2 (货号：ET1612-47)、碱性磷酸酶(货号：ET1601-21)、VEGF(货号：ET1604-28)均为华安生物技术有限公司；抗体骨桥蛋白(货号：AF0227)、β-actin(货号：AF7018)均为Affinity公司产品；HIF-1α抗体(货号：ab179483，Abcam公司)。
1.3.3 仪器细胞恒温CO2孵育箱(美国Thermo公司)，超净工作台(济南鑫贝西生物有限公司)，高温消毒压力锅(日本HIRAYAMA公司)，恒温干燥箱(上海星苗医疗器械公司)，低速离心机(Eppendorf公司)，-80 ℃超低温冰箱(德国西门子股份公司)，酶标仪(BioTek公司)，高端全电动倒置荧光显微镜(Ziess公司)，倒置显微镜(Olympus公司)，流式细胞仪CytoFLEX(Beckmancoulter公司)，凝胶成像仪(Bio-Rad 公司)，电子天平(飞宏公司)，垂直电泳系统(上海泰坦科技股份有限公司)，移液枪(Eppendorf公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养与传代 MC3T3-E1细胞在与体积分数10%胎牛血清和1%青链霉素混合的MEMα中生长，然后在设定为37 ℃并含有体积分数5%的CO2细胞培养箱内培养。细胞在T25培养瓶中培养，每个培养瓶含有4-6 mL完全培养基，每2 d更换1次新鲜的完全培养基，更换培养基前用无菌PBS冲洗细胞，当细胞融合约90%时进行传代。弃去培养基，PBS洗涤1次，每个T25培养瓶胰酶溶液1 mL消化，离心机离心，1 000 r/min离心5 min，进行传代。为了诱导成骨分化而配制的成骨诱导培养基，则是在上述培养基的基础上额外添加了10 mmol/L的β-甘油磷酸钠和50 mg/L的L-抗坏血酸。

1.4.2 CCK-8 将MC3T3-E1成骨细胞接种于96孔板内，5×103个/孔。将96孔板放置于培养箱中24 h，使细胞完全贴壁。为了评估去铁胺对成骨细胞活力的影响，将细胞分别与5，10，20，50，75 μmol/L去铁胺共培养1，2，3 d。干预相应时间，然后加入10 μL CCK-8和90 μL完全培养基，并将细胞在CO2培养箱中再培养2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度，选择去铁胺的最佳干预浓度。为了评价去铁胺对地塞米松诱导成骨细胞活力的保护作用，此次研究根据前期研究及文献报道进行实验分组及给药[31-32]：空白对照组，完全培养基正常培养；地塞米松组，1 μmol/L地塞米松干预；地塞米松+去铁胺组，1 μmol/L地塞米松+最适浓度的去铁胺组，各组均培养3 d。按照上述方法将细胞接种于96孔板中。

1.4.3 活死细胞染色将MC3T3-E1细胞接种到24孔板中，2×104个/孔，培养细胞直至融合度达到约80%。空白对照组：完全培养基正常培养；地塞米松组：1 μmol/L地塞米松干预；地塞米松+去铁胺10 μmol/L组：1 μmol/L地塞米松+去铁胺10 μmol/L组干预；地塞米松+去铁胺20 μmol/L组：1 μmol/L地塞米松+去铁胺20 μmol/L组干预。按组别加入干预药物，混悬液药物培养24 h。去除培养基，用PBS洗涤后2次，每孔加500 μL染色工作液，室温避光孵育20 min，去除染色工作液，用PBS洗涤后2次，倒置荧光显微镜下观察并采集图片。
1.4.4 流式细胞仪检测细胞凋亡将MC3T3-E1细胞接种在6孔板中，2×105个/孔，细胞培养至融合度达80%左右时，按照“1.4.3”分组加入干预药物，混悬液药物孵育24 h。收集细胞培养液，胰酶消化细胞，离心去上清，用冷PBS洗涤细胞2次，取1×105个/孔，重悬于流式管中，离心。加入400 μL AnnexinV-FITC结合液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后2-8 ℃避光孵育15 min。加10 μL PI染色液，2-8 ℃避光孵育5 min。立即用流式细胞仪检测。
1.4.5 碱性磷酸酶染色 MC3T3-E1细胞被接种于12孔板内，1×105个/孔，进行培养直至细胞覆盖率达到大约80%。按照“1.4.3”分组加入干预药物的成骨诱导培养基，成骨诱导1周后，移除培养基，PBS冲洗细胞2次。然后用40 g/L多聚甲醛处理细胞15 min，加入工作染色液，室温避光孵育过夜。取出工作液，用蒸馏水清洗3次，5 min/次，在显微镜下观察并拍照，并计算碱性磷酸酶染色的染色强度。
1.4.6 碱性磷酸酶活性检测 MC3T3-E1细胞在12孔板内进行培养，1×105个/孔，细胞培养至融合度达80%左右时。按照“1.4.3”分组加入干预药物的成骨诱导培养基，成骨诱导1周后，收集细胞提取蛋白测得各组蛋白浓度，参照碱性磷酸酶比色法检测方法严格操作。最后，使用酶标仪在520 nm波长下测量吸光度值，从而分析每组样品中碱性磷酸酶的活性。
1.4.7 茜素红染色将MC3T3-E1细胞接种到6孔板中，2×105个/孔，待细胞培养至约80%的融合度时。按照“1.4.3”分组加入干预药物的成骨诱导培养基，成骨诱导3周后，吸出孔板培养基，PBS轻柔冲洗2次，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，去除固定液，PBS洗涤2次，茜素红染色30 min，蒸馏水洗涤2次，显微镜下观察拍照。
1.4.8 Western blot 按照“1.4.3”分组加入干预药物成骨诱导1周后，提取细胞蛋白，采用细胞刮勺刮取细胞，1 000 r/min，4 ℃，离心5 min，然后弃上清，加入含1%蛋白酶抑制剂的裂解液，提取各组蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转移到PVDF膜上，并用5%脱脂牛奶密封2 h。加入β-actin(1∶10 000)、Runt相关转录因子2(1∶6 000)、碱性磷酸酶(1∶5 000)、骨桥蛋白(1∶2 000)、VEGF(1∶1 000)、HIF-1α(1∶1 000)在4 ℃下孵育过夜。次日室温下孵育二抗(1∶5 000)2 h，配制显影液对条带进行显影。利用Image J软件对目标条带的灰度值进行处理，通过计算目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值，得出目标蛋白的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①去铁胺干预MC3T3-E1细胞的最佳浓度；②去铁胺对地塞米松干预MC3T3-E1细胞增殖活性的影响；③去铁胺对地塞米松干预MC3T3-E1细胞成骨分化能力及成骨蛋白表达的影响；④去铁胺对地塞米松干预MC3T3-E1细胞HIF-1α/VEGF信号通路的影响。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析和图表制作，实验数据以x±s的形式呈现。两组数据的对比使用t检验；多组数据的对比采用单因素方差分析(ANOVA)。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经蚌埠医科大学统计学专家审核。

讨论

非创伤性股骨头坏死的病因复杂且多因素，主要包括长期激素治疗、过量饮酒、自身免疫性疾病和凝血功能障碍[33-34]。糖皮质激素给药是非创伤性股骨头坏死最常见的风险因素[3，34]。多项研究指出，激素性股骨头坏死的主要发病年龄段集中在中年和壮年，尤其是双侧，这给患者和整个社会带来了沉重的经济和心理负担[35]。不恰当的治疗可能导致患者髋关节功能严重受损；许多此类患者最终需接受髋关节置换手术[23]。但是由于人工关节的松动、聚乙烯衬垫的过度磨损、假体周围感染以及较短的使用寿命等原因，年轻患者的髋关节置换手术效果通常并不理想，且失败率较高[36-38]。因此，早期干预对于预防股骨头塌陷、保留关节功能以及避免进行髋关节置换手术至关重要。尽管存在多种保髋技术，如物理治疗、药物治疗、截骨手术和带血管的骨移植等，但它们的效果仍不尽如人意。遗憾的是，由于激素性股骨头坏死的确切发病机制尚未完全明确，目前的治疗选择仍然受限。
成骨细胞在骨骼发育和重建中发挥核心作用，负责骨基质的合成、分泌以及矿化过程。激素对成骨细胞的生物学效应是激素诱导股骨头坏死的关键病理机制。糖皮质激素可以直接诱导成骨细胞凋亡，增加破骨细胞的活性，抑制成骨细胞的活性，从而导致激素性股骨头坏死的发生[39]，因此，保持成骨细胞的活力和减少成骨细胞的凋亡对于预防和治疗激素性股骨头坏死至关重要，这不仅有助于保护骨细胞免受损害，还对维持骨骼健康和功能发挥着关键作用。此次实验结果表明，在5-20 μmol/L的浓度范围内，去铁胺与MC3T3-E1细胞共培养3 d内并未对其产生毒性，进一步实验中，作者证实了1 μmol/L地塞米松对成骨细胞的增殖及其成骨能力具有抑制作用，这一发现与XU等[40]的研究结果呈现出一定的一致性，此外，作者也观察到去铁胺能够显著降低地塞米松引发的细胞凋亡现象，KHOSHLAHNI等[41]的研究也发现，去铁胺能有效保护骨髓间充质干细胞抵抗氧化应激导致的细胞凋亡。这些发现为去铁胺作为一种潜在的预防剂，用于防止激素引起的股骨头坏死提供了实验依据。此次研究不仅揭示了激素影响成骨细胞功能的机制，还展示了去铁胺在改善由激素引起的成骨细胞功能损伤中的积极作用。
碱性磷酸酶与成骨分化早期细胞外基质的产生关系紧密，是细胞外基质矿化的必要条件之一[42]，而细胞矿化结节是成骨分化后期的最显著的标志之一，钙盐在有机基质中的沉积以及矿化结节的形成标志着成骨细胞的完全分化，并确立了骨形成的关键过程[43-44]。碱性磷酸酶染色和碱性磷酸酶活性检测结果表明，1 μmol/L地塞米松在7 d时可显著抑制MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性；相反，当去铁胺存在时，碱性磷酸酶活性抑制显著减轻。此外，成骨诱导21 d的茜素红染色也观察到了类似的现象。Runt相关转录因子2在成骨细胞中的作用已被许多研究所阐述，Runt相关转录因子2主要表达于成骨祖细胞和成骨细胞，是成骨细胞分化过程中最重要的调控因子，参与骨发育、牙齿发育、软骨形成以及血管生成等[45]。骨桥蛋白是由成骨细胞分泌的一种磷酸化糖蛋白，其表达水平与成骨分化能力呈正相关[46]。进一步使用Western blot 实验检测在地塞米松处理的MC3T3-E1细胞中去铁胺对成骨蛋白表达的影响，结果表明地塞米松下调了骨桥蛋白、碱性磷酸酶和Runt相关转录因子2的表达水平，但去铁胺的加入减轻了地塞米松对成骨蛋白的抑制作用，这与LIU等[47]的研究显示出相应的一致性。这一发现揭示了去铁胺可能通过影响Runt相关转录因子2和骨桥蛋白等关键转录因子，来减轻地塞米松对成骨细胞的抑制作用。
HIF-1α/VEGF信号通路是促进成骨分化的关键通路，通过激活HIF-1α/VEGF信号轴可以调节骨生成和血管生成，以促进骨折愈合，预防病理性骨质流失、骨坏死、骨关节炎和骨转移[48]。在缺氧条件下通过HIF-1α/VEGF途径诱导骨髓间充质干细胞成骨分化并促进H型内皮细胞的增殖、迁移和血管生成[49-50]。ZHANG 等[51]证实 HIF-1α 参与脐带间充质干细胞外泌体诱导的 VEGF表达并促进骨折修复。HAMUSHAN等[52]研究发现高纯度镁钉能够通过激活HIF-1α/VEGF这一关键信号通路，进而在大鼠的牵张成骨实验模型中促进骨骼的整合过程。去铁胺是食品和药物管理局的铁螯合剂，也被称为HIF脯氨酰羟化酶的抑制剂，可稳定HIF-1α并模拟真正的缺氧条件。去铁胺通过稳定和增强HIF-1α来促进骨髓间充质干细胞的矿化、血管生成和成骨分化[53]。在此次研究中，地塞米松下调了HIF-1α和VEGF的表达，而去铁胺显著上调了HIF-1α和VEGF蛋白的表达，增强MC3T3-E1细胞的成骨分化能力，表明去铁胺可能通过HIF‐1α对激素性股骨头坏死发挥保护作用。
综上所述，此次研究表明去铁胺在特定浓度范围内对MC3T3-E1细胞的活力无影响，而且去铁胺可以降低地塞米松对MC3T3-E1成骨细胞的抑制作用，保障成骨细胞活性，促进其增殖，而且可能通过激活HIF-1α/VEGF信号通路减轻地塞米松诱导的成骨分化抑制作用。总体而言，此次研究结果提示，去铁胺有望成为一种新型治疗药物，用于激素性股骨头坏死的临床干预。
尽管此次研究提供了有关体外细胞培养中去铁胺对成骨细胞保护作用的初步证据，但仍存在若干局限性。此次研究重点关注了HIF-1α/VEGF信号通路，而激素性股骨头坏死的发病机制涉及多个信号通路的调节和多个生物学过程的参与，而且体内是一个极其复杂的大环境，因此，去铁胺是否真的能够在体内调节激素性股骨头坏死的进展，还有待后续进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

去铁胺减轻糖皮质激素抑制成骨分化的作用途径

Deferoxamine alleviates the inhibitory effect of glucocorticoids on osteogenic differentiation

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