苦参总黄酮改善非酒精性脂肪肝的作用机制及斑马鱼实验验证

doi:10.12307/2025.612

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (14): 2969-2978.doi: 10.12307/2025.612

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苦参总黄酮改善非酒精性脂肪肝的作用机制及斑马鱼实验验证

古玉凤1，邓丙英1，李倪仁1，曾译萱1，鲁思凡1，朱晨2，陈磊3，刘怡1，4，5

1南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510510；2广州中医药大学第二附属医院药学部，广东省广州市 510120；3广东药科大学中药学院，广东省广州市 510006；4广东省中药制剂重点实验室，广东省广州市 510515；5广东省中西医结合防治情志病基础研究卓越中心，广东省广州市 510515

收稿日期:2024-05-06 接受日期:2024-07-05 出版日期:2025-05-18 发布日期:2024-09-28
通讯作者: 刘怡，博士，副教授，南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510510；广东省中药制剂重点实验室，广东省广州市 510515；广东省中西医结合防治情志病基础研究卓越中心，广东省广州市 510515
作者简介:古玉凤，女，2001年生，广东省五华县人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事中药药理研究。
基金资助:
广州市科技计划项目(202201011445)，项目负责人：朱晨

Mechanisms of total flavonoids from Sophora flavescens for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease and experimental validation in zebrafish

Gu Yufeng1, Deng Bingying1, Li Niren1, Zeng Yixuan1, Lu Sifan1, Zhu Chen2, Chen Lei3, Liu Yi1, 4, 5

1School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510510, Guangdong Province, China; 2Department of Pharmacy, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China; 3School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Pharmaceutics, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; 5Guangdong Basic Research Center of Excellence for Integrated Traditional and Western Medicine for Qingzhi Diseases, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Received:2024-05-06 Accepted:2024-07-05 Online:2025-05-18 Published:2024-09-28
Contact: Liu Yi, PhD, Associate professor, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510510, Guangdong Province, China; Guangdong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Pharmaceutics, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; Guangdong Basic Research Center of Excellence for Integrated Traditional and Western Medicine for Qingzhi Diseases, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Gu Yufeng, Master candidate, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510510, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangzhou Science and Technology Program Project, No. 202201011445 (to ZC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
网络药理学：是基于系统生物学的原理阐释疾病发展的过程，研究药物、疾病和靶点之间的协同关系，预测疾病治疗作用靶点和信号通路。
斑马鱼非酒精性脂肪肝模型：斑马鱼具有体型小、养殖成本低、发育迅速、产卵量大、基因组与人类同源性高等特点，受精后5 d斑马鱼的消化系统发育成熟，且幼鱼胚胎透明，可直接观察内脏，可以克服哺乳动物耗时长、用药量大、实验强度大以及细胞模型条件要求严苛、作用环节单一等缺陷。应用蛋黄粉溶液浸泡诱导非酒精性脂肪肝斑马鱼模型，能使幼鱼肝脏出现明显病理损伤。

背景：苦参总黄酮具有抗炎、调节免疫、抗氧化、抗肝损伤等多种药理作用，其对非酒精性脂肪肝的治疗效果和作用机制尚不明确。
目的：利用生物信息学、网络药理学方法及斑马鱼实验验证苦参总黄酮治疗非酒精性脂肪肝的作用机制。
方法：构建非酒精性脂肪肝斑马鱼模型，观察苦参总黄酮治疗后斑马鱼肝脏脂质累积情况、病理形态改变，以及脂质累积、炎症基因的表达变化。通过TCMSP、Swiss Target Prediction、Bat-man数据库获取苦参总黄酮活性成分与非酒精性脂肪肝相关靶点；利用STRING数据库进行蛋白互作网络分析，GO功能富集和KEGG通路富集分析。基于GSE33814数据集，筛选出“苦参总黄酮-非酒精性脂肪肝”交集靶点的差异表达基因并运用R4.3.2软件进行相关性分析、受试者操作特征曲线分析，通过验证集GSE89632验证核心基因；RT-qPCR和Western blot实验验证核心通路相关基因和蛋白表达。
结果与结论：①苦参总黄酮能够改善非酒精性脂肪肝斑马鱼肝脏脂质累积，显著抑制斑马鱼脂质和转氨酶水平的升高(P < 0.05)；调节炎症和脂代谢相关基因的表达；②网络药理学中获得168个共同靶点，cytoscape拓扑分析综合筛选出排名前10的核心基因分别为HSP90AA1、STAT3、PIK3R1、MAPK1、AKT1、RXRA、PIK3CA、EGFR、JAK2、ESR1；GO和KEGG分析通路主要集中在胰岛素抵抗、脂质与动脉粥样硬化方面；生物信息分析共获得59个“苦参总黄酮-非酒精性脂肪肝” 差异表达基因，受试者操作特征曲线分析及验证集验证得到6个核心靶点在健康人与非酒精性脂肪肝患者间有显著差异(P < 0.01)；③RT-qPCR和Western blot实验结果表明苦参总黄酮能够抑制非酒精性脂肪肝斑马鱼JAK2/STAT3信号通路的激活。以上结果表明，苦参总黄酮通过调节JAK2/STAT3信号通路减轻炎性反应，抑制脂质累积从而改善非酒精性脂肪肝。
https://orcid.org/0000-0003-1635-4105(刘怡)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 苦参总黄酮, 非酒精性脂肪肝, 斑马鱼, 网络药理学, 生物信息学, JAK2, STAT3

Abstract: BACKGROUND: Total flavonoids from Sophora flavescens have a variety of pharmacological effects, including anti-inflammatory, immunomodulatory, antioxidant, and anti-hepatic injury, but the therapeutic effects and mechanisms in non-alcoholic fatty liver disease are not clear.
OBJECTIVE: To reveal the mechanism of total flavonoids from Sophora flavescens in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease using bioinformatics, network pharmacology and zebrafish experimental validation.
METHODS: A zebrafish model of non-alcoholic fatty liver disease was constructed to observe lipid accumulation, pathomorphologic changes, and expression of inflammatory genes in the liver of zebrafish after treatment with total flavonoids from Sophora flavescens. The active ingredients of total flavonoids from Sophora flavescens and non-alcoholic fatty liver disease-related targets were obtained from TCMSP, Swiss Target Prediction, and Bat-man databases. STRING was used to perform protein-protein interaction network analysis, GO functional enrichment and KEGG pathway enrichment analysis. Based on the GSE33814 dataset, the differentially expressed genes of total flavonoids from Sophora flavescens and non-alcoholic fatty liver disease intersection targets were screened out. Correlation analysis and receiver operating characteristic curve were performed using R4.3.2 software. Core genes were verified by the validation set GSE89632. RT-qPCR and western blot assays were performed to verify the expression of core pathway-related genes and proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Total flavonoids from Sophora flavescens could improve lipid accumulation in the liver of zebrafish with non-alcoholic fatty liver disease, significantly inhibited the elevation of lipid and aminotransferase levels in zebrafish (P < 0.05), and regulated the expression of genes related to inflammation and lipid metabolism. (2) A total of 168 common targets were obtained using the network pharmacology, and top 10 core genes, identified by cytoscape topology analysis, were HSP90AA1, STAT3, PIK3R1, MAPK1, AKT1, RXRA, PIK3CA, EGFR, JAK2, and ESR1. GO and KEGG analysis pathways mainly included insulin resistance, lipids, and atherosclerosis. There were a total of 59 differentially expressed genes after intersection of total flavonoids from Sophora flavescens and non-alcoholic fatty liver disease targets. The receiver operating characteristic curve and validation set analyses yielded six core targets that were significantly different between healthy individuals and patients with non-alcoholic fatty liver disease (P < 0.01). (3) RT-PCR and western blot results verified that total flavonoids from Sophora flavescens inhibited the activation of the JAK2/STAT3 signaling pathway in zebrafish. To conclude, total flavonoids from Sophora flavescens may alleviate the inflammatory response through the JAK2/STAT3 signaling pathway, thus inhibiting lipid accumulation and improving non-alcoholic fatty liver disease.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: flavonoids from Sophora flavescens, non-alcoholic fatty liver disease, zebrafish, network pharmacology, bioinformatics, JAK2, STAT3

中图分类号:

古玉凤, 邓丙英, 李倪仁, 曾译萱, 鲁思凡, 朱晨, 陈磊, 刘怡. 苦参总黄酮改善非酒精性脂肪肝的作用机制及斑马鱼实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(14): 2969-2978.

Gu Yufeng, Deng Bingying, Li Niren, Zeng Yixuan, Lu Sifan, Zhu Chen, Chen Lei, Liu Yi. Mechanisms of total flavonoids from Sophora flavescens for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease and experimental validation in zebrafish [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(14): 2969-2978.

图/表（结果） 12

2.1 苦参总黄酮用药质量浓度筛选如图1所示，在一定范围内随着苦参总黄酮暴露质量浓度的升高斑马鱼死亡率呈剂量依赖性升高。斑马鱼在药物质量浓度为12 μg/mL 时，死亡率为100%，在质量浓度不高于6 μg/mL时，斑马鱼状态良好，无异常情况，根据CNAS-15088体系标准，未超过10%的斑马鱼出现死亡、畸形等毒性表型，确定高剂量为6 μg/mL，低剂量为3 μg/mL。
2.2 各组斑马鱼表观形态及病理形态比较给药72 h后，与模型组相比，苦参总黄酮组体长均有所下降，这表明苦参总黄酮可以抑制斑马鱼肥胖，见图2A。与空白组相比，模型组幼鱼肝脏组织质地无定形，结构紊乱，透明度降低，面积变大，表示肝脏退化，苦参总黄酮组则明显改善，见图2B。在Tg(fabp10:eGFP)品系斑马鱼中，模型组肝组织绿色荧光面积明显增大，说明其肝脏肿胀，给药后荧光强度减弱，见图2C。
如图3所示，空白组斑马鱼肝细胞排列紧密，肝组织形态正常；模型组斑马鱼肝脏有大量的空泡，肝细胞不规则排列，肝组织中脂滴沉积；苦参总黄酮组肝细胞间隙的脂滴和空泡减少，排列趋于规律。苦参总黄酮组治疗效果佳，病理切片与空白组相似。
油红O染色结果显示，模型组斑马鱼幼鱼肝组织染色呈深红色，轮廓不清晰，说明模型组斑马鱼中的脂质蓄积水平较高；苦参总黄酮组肝脏部位红染程度减轻，见图4A。尼罗红染色结果显示，空白组肝脏中几乎无红色荧光，模型组有红色强烈荧光，提示模型组脂肪沉积，苦参总黄酮组荧光强度减弱，提示苦参总黄酮能够缓解斑马鱼脂质代谢紊乱水平，见图4B。
2.3 各组斑马鱼脂质、转氨酶含量比较与空白组相比，模型组三酰甘油和总胆固醇含量显著增加(P < 0.01)；与模型组相比，苦参总黄酮低、高剂量组三酰甘油和总胆固醇含量显著降低(P < 0.01)。与空白组相比，模型组谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量均显著升高(P < 0.01)；与模型组相比，苦参总黄酮低、高剂量组谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量显著降低，见图5，以上结果说明苦参总黄酮对非酒精性脂肪肝具有一定的治疗作用。
2.4 各组斑马鱼脂代谢、炎症相关基因表达比较与空白组相比，模型组斑马鱼脂代谢相关基因apoa1a mRNA表达显著下降(P < 0.01)，fasn、srebf1 mRNA表达显著升高(P < 0.01)；与模型组相比，苦参总黄酮低、高剂量组apoa1a mRNA表达显著下降(P < 0.01)，fasn、srebf1 mRNA表达显著升高(P < 0.01)。与空白组相比，模型组斑马鱼炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1b、转化生长因子β1 mRNA表达显著升高(P < 0.01)；与模型组相比，苦参总黄酮低、高剂量组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1b、转化生长因子β1基因mRNA表达显著下降(P < 0.01)，见图6。
2.5 苦参总黄酮成分与非酒精性脂肪肝疾病靶点获取根据数据库以及文献整理，在Swiss ADME平台中进行类药性筛选，结合文献中明确的有效成分作为补充，共从苦参中获得76个黄酮活性成分，对应的作用靶点有624个。通过Gene Cards数据库、OMIM数据库、DIsGe Net数据库综合检索获取非酒精性脂肪肝相关靶点，化合物靶点与疾病相关靶标蛋白取交集，绘制韦恩图，获得168个共同靶点，见图7。
2.6 有效成分-疾病靶点蛋白互作网络构建利用STRING和Cytoscape 3.9.1两个平台对苦参黄酮成分-非酒精性脂肪肝病的168个共同作用靶点进行蛋白互作网络分析，网络中共有143个节点，866条边，见图8。图中节点大小和颜色与度的大小呈正相关，节点越大表示度越大，节点的颜色越深表示度越大。利用Cytoscape 3.9.1中插件CytoNCA对靶标进行网络拓扑分析，综合筛选出排名前10的核心基因，分别为HSP90AA1、STAT3、PIK3R1、MAPK1、AKT1、RXRA、PIK3CA、EGFR、JAK2、ESR1，见图9，表2，提示这些基因在蛋白互作网络中发挥了关键作用。
2.7 潜在靶点基因的GO 功能注释及 KEGG 通路富集分析由图10所示，GO分析共取得732个GO条目(P < 0.05)，按P值由小到大的顺序排序，将各组分排名前10的条目

绘制成可视化条形图。生物学过程主要包括对外源性刺激的反应、对脂多糖的反应、蛋白质磷酸化、细胞凋亡过程的负调控等，主要与蛋白磷酸化以及细胞凋亡过程有关；细胞组分相关性大的主要包括细胞质膜、膜阀区、大分子复合物、细胞外泌体等；分子功能主要包括酶结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、配体激活的序列特异性DNA结合、胰岛素受体底物结合等。苦参总黄酮治疗非酒精性脂肪肝的通路主要集中在胰岛素抵抗、脂质与动脉粥样硬化、糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路和化学致癌-受体激活等通路。
2.8 差异分析检索GEO数据库获得数据集GSE89632，包括健康对照组样本13例，非酒精性脂肪肝样本12例。将168个共同靶点根据|log2FC| > 1和FDR < 0.05对基因进行差异化筛选，筛选得到差异基因59个，其中上调基因28个，下调基因41个，见图11。
2.9 受试者工作特征曲线分析受试者工作特征曲线下面积用来量化分类，曲线下面积 > 0.6的基因被认为具有诊断性能，曲线下面积 > 0.8的基因被认为具有良好的诊断性能，受试者工作特征曲线分析发现，10个核心基因HSP90AA1、STAT3、PIK3R1、MAPK1、AKT1、RXRA、PIK3CA、EGFR、JAK2、ESR1的曲线下面积分别为0.760，0.724，0.904，0.635，0.590，0.788，0.808，0.962，0.740，0.923，除AKT1基因外，其余基因曲线下面积均大于0.6，在非酒精性脂肪肝诊断方面具有出色诊断性能，见图12。
2.10 核心基因二次验证使用验证集对10个核心基因进行验证，观察其在健康人和非酒精性脂肪肝患者中的表达，结果表明，HSP90AA1、STAT3、PIK3R1、RXRA、JAK2、ESR1基因在健康人和非酒精性脂肪肝患者之间出现差异表达，见图13，其余的MAPK1、AKT1、PIK3CA、EGFR基因在健康人和非酒精性脂肪肝患者之间表达无明显差异。经二次验证后发现6个基因HSP90AA1、STAT3、PIK3R1、RXRA、JAK2、ESR1在健康人和非酒精性脂肪肝患者之间出现差异表达，提示其可能发挥作用。

2.11 qPCR法检测斑马鱼肝脏组织核心通路基因表达与空白组相比，模型组斑马鱼jak2a、stat3 mRNA表达升高，苦参总黄酮干预后呈剂量依赖性降低(P < 0.01)，见图14。
2.12 Western blot法检测斑马鱼肝脏组织核心通路蛋白表达与空白组相比，模型组斑马鱼p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达升高，给予苦参总黄酮治疗后，斑马鱼肝脏组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达显著降低(P < 0.01)，见图15。

以上结果表明，苦参总黄酮通过调节 JAK2/STAT3 信号通路对非酒精性脂肪肝斑马鱼肝组织具有保护作用。

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引言

材料方法

.1 设计网络药理学、生物信息学分析和斑马鱼实验。
1.2 时间及地点实验于2023年6-9月在南方医科大学中医药学院完成。
1.3 斑马鱼药效实验
1.3.1 实验动物野生型AB品系斑马鱼(由国家斑马鱼资源中心提供)和Tg(fabp10:eGFP)品系斑马鱼，于南方医科大学中药药理实验室斑马鱼实验平台饲养繁殖，饲养条件参照《zebrafish book》。实验用斑马鱼幼鱼为雌雄鱼交配后受精卵养至受精后5 dpf(day post fertilization)，挑选孵化出的健康幼鱼进行后续实验。实验动物伦理审查已通过广东芯选检验检测有限公司实验动物管理与使用伦理委员会审核(编号：IACUC LS 0227-01-2023)。
1.3.2 药物苦参(Sophora flavescens Ait.)，经体积分数90%乙醇加热回流提取4次，每次3 h，过滤合并提取液，回收溶剂得苦参浓缩液。取苦参浓缩液加等量水使之分散，水溶液用乙酸乙酯(1∶1)进一步萃取4次，静置后收集上层乙酸乙酯萃取液。使用旋转蒸发器除去乙酸乙酯后，经冻干得到苦参总黄酮。称取苦参总黄酮冷冻干燥品，以40% 15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯(kolliphor HS15)去离子水溶液溶解苦参总黄酮，用美蓝培养液稀释至相应药物浓度。
1.3.3 试剂蛋黄粉(索莱宝，E8200-250)；油红O粉末(Sigma，O9755-25G)；BCA蛋白测定试剂盒(碧云天，货号：P0012S)；总胆固醇、三酰甘油、谷草转氨酶、谷丙转氨酶测试盒(南京建成生物工程研究所，货号：A111-1-1，A110-1-1，C010-2-1，C009-2-1)；反转录试剂盒Ⅱ(艾科瑞生物，货号：AG11711)；qPCR试剂盒(艾科瑞生物，货号：AG11701)；p-JAK2抗体(赛默飞公司，货号44-426G)；JAK2抗体(Proteintech公司，货号：17670-1-AP)；p-STAT3抗体(赛默飞公司，货号 PA5-85445)；STAT3抗体(华安生物公司，货号：ET1607-38)；β-actin抗体(赛维尔有限公司)。
1.3.4 仪器体式荧光显微镜(奥林巴斯，型号：MVX10)；斑马鱼养殖系统(海圣生物，型号：Z-A-D5-PC)；生化培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司，型号：AXSD-A1090)；罗氏实时荧光定量PCR仪(型号：Light Cycler96)；梯度PCR仪(ABI Veriti96)；超微量分光光度计(De Novix DS)。

1.3.5 分组与给药将5 dpf的AB品系和Tg(fabp10:eGFP)品系斑马鱼分别随机分为4组，分别为空白组、模型组、苦参总黄酮低剂量(3 μg/mL)组、苦参总黄酮高剂量(6 μg/mL)组，每组200条斑马鱼。空白组加入10 mL系统水，模型组加入2 mg/mL蛋黄粉溶液诱导非酒精性脂肪肝斑马鱼模型，苦参总黄酮低、高剂量给药组给予2 mg/mL蛋黄粉的同时加入3，6 μg/mL苦参总黄酮。每天换水，共处理72 h。实验结束后，Tg(fabp10:eGFP)品系斑马鱼置于体式荧光显微镜观察肝脏绿色荧光强度。AB品系活体斑马鱼用于尼罗红荧光染色，麻醉处死后一部分斑马鱼固定在40 g/L多聚甲醛中用于后续全鱼油红染色、苏木精-伊红染色，一部分斑马鱼冻存在-80 ℃冰箱以进一步生化指标检测。全鱼油红染色图中肝脏红染严重表明造模成功。

1.3.6 体长和肝脏荧光观察用游标卡尺测量幼鱼头部最前端到鱼尾最末端距离，此段长度即为幼鱼体长。将斑马鱼经三卡因麻醉后放置在培养皿中，使用体式荧光显微镜观察肝脏绿色荧光强度。

1.3.7 脂质染色
(1)全鱼油红染色：将固定好的斑马鱼从40 g/L多聚甲醛中取出，PBS洗2次，依次经25%，50%，75%，100%丙二醇梯度脱水，用0.5%油红O染料避光孵育过夜，再依次经100%，75%，50%，25%丙二醇复水，于75%甘油中4 ℃保存，油红O染料可特异性与组织内的三酰甘油等中性脂肪染为鲜红色，可用于观察斑马鱼肝脏脂质分布。
(2)尼罗红荧光染色：以丙酮为溶剂配制1 mg/mL尼罗红母液，避光保存在-20 ℃，使用前用蒸馏水稀释成0.5 μg/mL尼罗红工作液，放入斑马鱼，避光孵育60 min；蒸馏水清洗3 min；用0.02%三卡因麻醉斑马鱼，在奥林巴斯MVX10体视显微镜下拍照，尼罗红荧光染料与脂类物质结合发出橙红色荧光，可在活体条件下标记和成像斑马鱼幼鱼体内脂肪组织和肝内脂滴。
1.3.8 肝组织病理切片苏木精-伊红染色固定好的斑马鱼经常规脱水、透明、石蜡包埋后切成4 μm薄片，进行苏木精-伊红染色，中性树胶封固。切片扫描获取全鱼侧面切片，定位到肝组织，观察各组斑马鱼肝脏病理变化。
1.3.9 斑马鱼体脂和转氨酶含量测定将斑马鱼幼鱼按体质量(g)∶体积(mL)为1∶9加入磷酸盐缓冲液匀浆，于4 ℃、3 000 r/min离心10 min，吸出上清液，按照试剂盒说明书检测幼鱼体内三酰甘油、总胆固醇、谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平。

1.3.10 RT-qPCR法检测斑马鱼炎症、脂代谢相关基因表达取各组斑马鱼30尾，加入Trizol试剂提取RNA，用微量分光光度计检测RNA纯度，重复3次取平均值。将所提取的RNA按照说明书操作反转录合成cDNA，建立20 μL反应体系进行qPCR反应。运行条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s；60 ℃ 40 s，退火和延长；扩增40个循环。qRT-PCR引物见表1。扩增结束后，用内参基因β-actin进行校正，以相对定量法2-ΔΔCt计算各组基因的相对表达量。

1.4 网络药理学与生物信息学研究
1.4.1 活性成分相关靶点与非酒精性脂肪肝疾病靶点获取通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)获取苦参总黄酮成分及对应的靶点，根据药物动力学参数，以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18进行初筛；将获取的活性成分导入TCMSP、Swiss Target Prediction、Bat-man数据库，其中Swiss Target Prediction筛选出Probability > 0.1的靶点，Bat-man筛选出Z-scroe > 20的靶点，综合获取苦参黄酮活性成分的作用靶点。通过GeneCards数据库、OMIM数据库、DIsGeNet数据库综合检索获取疾病相关靶点。
1.4.2 苦参黄酮成分-非酒精性脂肪肝病共同靶点蛋白互作网络构建将共有靶点导入到功能蛋白联合网络数据库(STRING)，Cytoscape3.9.1软件构建蛋白互作关系网络，并获得节点数、边数，利用插件“CytoNCA”对蛋白互作网络进行拓扑分析，以紧密度(Closeness)值、介度(Betweenness)值以及连接度(Degree)值作为筛选条件，靶点数等差递减筛选3次，将每一次筛选出排列在前的靶点视为苦参黄酮治疗非酒精性脂肪肝病的关键靶点。根据Cytoscape 3.9.1软件构建“有效成分-靶点-核心通路”网络图，进行网络可视化分析，根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的关键活性成分。
1.4.3 GO 功能注释及 KEGG 通路富集分析将共有靶点导入David数据库，选择“OFFICIAL GENESYMBOL”作为鉴定物，物种选择“Homo sapiens”进行GO生物过程、细胞组分、分子功能和KEGG富集分析，并设置P < 0.05筛选具有显著性差异的通路。利用微生信平台绘制富集图，GO富集分析根据P值显著性以条形图形式展示前10个条目。KEGG富集分析根据P值显著性以气泡图形式展示前20条通路，并将这20条通路作为核心通路。
1.4.4 基因表达矩阵获取所用数据来自GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，以“non-alcholic fatty liver disease”和“Homo sapiens”为关键词检索，获取非酒精性脂肪肝基因表达数据集，获得所需芯片GSE33814作为训练集，GSE89632作为验证集。GSE33814数据集包含32个人肝脏组织样本，其中13个源自健康人群，19个源自非酒精性脂肪肝患者。GSE89632数据集包含健康对照组样本24例，非酒精性脂肪肝样本39例。
1.4.5 “苦参总黄酮-非酒精性脂肪肝”交集靶点差异基因分析注释数据后通过“limma”包从GSE33814中提取“苦参总黄酮-非酒精性脂肪肝”交集靶点的表达量，运用wilcox 函数进行秩和检验，以P < 0.05为条件获取差异基因，运用“pheatmap”R包进行可视化。
1.4.6 受试者操作特征曲线分析及二次验证利用“limma”包与“ggpubr”包对非酒精性脂肪肝相关验证集GSE89632中基因表达谱进行差异化分析，并对预测诊断效果较好的特征基因进行二次验证。
1.5 核心通路验证
1.5.1 qPCR法检测斑马鱼肝脏组织核心通路基因表达采用1.3.10方法检测斑马鱼肝脏组织核心通路基因stat3、jak2a的表达，引物序列见表1。
1.5.2 Western blot法检测斑马鱼肝脏组织核心通路蛋白表达取各组斑马鱼30尾，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，匀浆后离心，吸取上清液进行BCA蛋白浓度测定，蛋白定量后进行变性。取蛋白样品加样电泳，然后转移至PVDF膜，用5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，加一抗(JAK2抗体、STAT3抗体、β-actin抗体，稀释比例1∶3 000)置于摇床上孵育1 h，于4 ℃孵育过夜，次日用PBST洗膜，加入稀释好的二抗孵育2 h，PBST洗膜，用滤纸吸干PVDF膜的液体，将膜放在曝光机显影板上曝光，Image J软件分析条带灰度值。
1.6 统计学分析运用Graphpad Prism 8.0.1统计软件处理数据及作图，结果用平均值±标准误表示。多组之间比较采用单因素方差分析(one way-ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有极显著性意义。文章统计学方法已经通过南方医科大学生物统计学专家审核。

讨论

非酒精性脂肪肝病现已成为最常见的慢性肝病之一，通常与肥胖、2型糖尿病、高脂血症及其相关的肝脏和心脑血管疾病的发病密切相关。随着经济社会的发展，中国乃至全球慢性代谢性疾病患者的比例日趋增长，非酒精性脂肪肝已成为中国继病毒性肝炎之后第二大慢性肝病，严重危害国民的健康[13]。
目前认为，非酒精性脂肪肝的发病机制与脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗、炎症、氧化应激和肠道菌群等息息相关[14]。近年来，大量文献报道黄酮类成分可显著改善非酒精性脂肪肝，且不良反应小，充分展示了中药的潜在优势和客观的发展前景[13]。其中，许多黄酮类成分具有抗炎、抗氧化作用，在治疗非酒精性脂肪肝方面显示出强大的药理活性，如槲皮素通过促进AMPK介导的肝细胞线粒体自噬改善非酒精性脂肪肝[15]，芹菜素通过抑制小鼠NLRP3炎症小体减轻非酒精性脂肪肝等[16]，水飞蓟素作为抗氧化剂在慢性肝病临床治疗中应用[17]。该研究显示苦参总黄酮可能作用于JAK2/STAT3信号通路，对炎症因子、脂质合成因子的基因表达具有抑制作用。
该研究结合生物信息学和网络药理学技术，通过对苦参总黄酮中所含化学成分与疾病的相关靶点进行生物信息学分析，建立苦参总黄酮治疗非酒精性脂肪肝的“有效成分-靶点-核心通路”网络模型，对苦参总黄酮治疗非酒精性脂肪肝的潜在机制进行探究，随后建立了蛋黄粉诱导的非酒精性脂肪肝斑马鱼模型，探索苦参总黄酮对非酒精性脂肪肝的治疗作用。
斑马鱼实验结果表明，与空白组比较，模型组斑马鱼体长明显增加，肝脏组织质地无定形，结构紊乱，透明度降低，肝绿色荧光面积变大。苏木精-伊红染色可见模型组斑马鱼表现出明显的肝脏退化，全鱼油红染色和尼罗红染色可见模型组斑马鱼肝脏部位脂质累积严重，模型组全鱼匀浆中总胆固醇、三酰甘油、谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量显著升高，说明蛋黄粉浸泡成功诱导非酒精性脂肪肝斑马鱼模型。经苦参总黄酮治疗后能缩短非酒精性脂肪肝斑马鱼体长，同时减轻肝脏脂肪变性和脂质沉积，苦参总黄酮组全鱼匀浆中总胆固醇、三酰甘油、谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量显著降低。
生物信息学与网络药理学分析苦参总黄酮治疗非酒精性脂肪肝的潜在靶点，发现苦参总黄酮对应的作用靶点有168个；蛋白互作网络分析合并结构拓扑分析以及验证集GSE89632二次验证后，认为HSP90AA1、STAT3、PIK3R1、RXRA、JAK2、ESR1 6个靶点可能发挥作用。
在哺乳动物中，STAT3通常受JAK2介导的磷酸化激活，jak2a是模式生物斑马鱼里jak2的旁系同源基因[18]，WU等[19]在对黄颡鱼脂类代谢的研究中发现了jak2a/b-stat通路介导了瘦素(leptin)的脂解作用；马春松等[20]发现JAK-STAT信号通路激活下游基因，从而抑制NF-κB等炎症通路调控黄颡鱼的免疫应答。
JAK/STAT信号通路广泛参与炎症、调节代谢[21]，白细胞介素6可以通过激活JAK2/STAT3信号通路，促进炎症细胞的增殖和活化，增强炎症反应。此外，活化的STAT3还可以调控一些炎症相关基因的表达，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6等，进一步加剧炎症反应[22]。NF-κB可以直接上调多种细胞因子如白细胞介素6的表达，这些细胞因子随后激活JAK2/STAT3通路，形成一种正反馈循环[23]。作为细胞转导子和转录活化子家族(STATs)的一员，STAT3与肝脏关系最密切，在被激活后可转位进入细胞核内，并与脱氧核糖核酸结合，启动下游基因表达，促进脂质蓄积，并产生局灶性炎性微环境，维持细胞功能，调控细胞生长[24]。同时STAT3作为形成肝脏炎性微环境的重要炎症递质，其调控炎性反应的机制日益受到医学研究的重视[25]。通过RT-qPCR对核心靶点JAK2、STAT3进行验证，结果显示，模型组斑马鱼JAK2、STAT3基因和蛋白表达升高，苦参总黄酮组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达显著降低，提示苦参总黄酮可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路来抑制炎症反应，减轻非酒精性脂肪肝。
综上所述，该研究结合生物信息学及网络药理学方法，搜集苦参总黄酮中的主要活性成分，探讨其治疗非酒精性脂肪肝的靶点与信号通路，预测其核心靶点，从中发现可能作用的通路为JAK2/STAT3；结果表明苦参总黄酮可通过JAK2/STAT3信号通路干预非酒精性脂肪肝，为后续非酒精性脂肪肝的相关病理或药理研究提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

苦参总黄酮改善非酒精性脂肪肝的作用机制及斑马鱼实验验证

Mechanisms of total flavonoids from Sophora flavescens for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease and experimental validation in zebrafish

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