大麻二酚干预下力竭运动大鼠骨骼肌炎症相关基因的挖掘与验证

doi:10.12307/2025.338

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (11): 2347-2356.doi: 10.12307/2025.338

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大麻二酚干预下力竭运动大鼠骨骼肌炎症相关基因的挖掘与验证

朱文宁1，孙莉莉2，彭丽娜2，司俊成1，臧万里1，殷伟东1，李孟琪1

哈尔滨体育学院，1研究生院，2运动人体科学学院，黑龙江省哈尔滨市 150008

收稿日期:2024-03-11 接受日期:2024-04-28 出版日期:2025-04-18 发布日期:2024-08-12
通讯作者: 孙莉莉，博士，副教授，硕士生导师，哈尔滨体育学院运动人体科学学院，黑龙江省哈尔滨市 150008
作者简介:朱文宁，男，1996年生，汉族，山东省临沂市人，哈尔滨体育学院在读硕士，主要从事运动康复学的研究。
基金资助:
黑龙江省省属本科高校基本科研业务费优秀青年创新团队项目(2023KYYWF-TD04)，项目负责人：孙莉莉；哈尔滨体育学院引进人才科研启动费(RC20-202107)，项目负责人：彭丽娜

Mining and verification of inflammation-related genes in skeletal muscle of exhaustive exercise rats undergoing cannabidiol intervention

Zhu Wenning1, Sun Lili2, Peng Lina2, Si Juncheng1, Zang Wanli1, Yin Weidong1, Li Mengqi1

1Graduate School, 2School of Human Sports Science, Harbin Sport University, Harbin 150008, Heilongjiang Province, China

Received:2024-03-11 Accepted:2024-04-28 Online:2025-04-18 Published:2024-08-12
Contact: Sun Lili, PhD, Associate professor, Master’s supervisor, School of Human Sports Science, Harbin Sport University, Harbin 150008, Heilongjiang Province, China
About author:Zhu Wenning, Master candidate, Graduate School, Harbin Sport University, Harbin 150008, Heilongjiang Province, China
Supported by:
Heilongjiang Provincial Undergraduate Colleges and Universities Basic Research Operating Expenses for Outstanding Youth Innovation Team Project, No. 2023KYYWF-TD04 (to SLL); Introduced Talents Scientific Research Initiation Fee of Harbin Sport University, No. RC20-202107 (to PLN)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
大麻二酚(cannabidiol，CBD)：是从大麻植物中提取的纯天然成分，大麻二酚可产生消炎镇痛作用，消炎镇痛的药理机制主要与CB1受体和CB2受体有关。CB1受体通过直接抑制中脑导水管周围灰质和RVM内的γ-氨基丁酸(GABA)以及脊髓内谷氨酸的释放来达到镇痛效果。
炎症基因：是参与炎症反应的各种细胞因子，主要有肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、转化生长因子β等。

背景：大麻二酚能够有效改善机体的炎症反应，但在改善力竭运动引起的骨骼肌炎症方面，并未有明确的机制研究。
目的：利用转录组学测序技术探究大麻二酚在力竭运动过程中对大鼠骨骼肌炎症的影响机制。
方法：随机将36只SD大鼠分为6组：空白对照组、运动椰子油组、运动对照组、50 mg/kg大麻二酚组、60 mg/kg大麻二酚组、70 mg/kg大麻二酚组，每组6只。除空白对照组大鼠外，其余各组大鼠进行为期9 d的游泳运动制作力竭运动模型。每次游泳运动结束后，大麻二酚组大鼠给予不同浓度(50，60，70 mg/kg)脂溶性大麻二酚2 mL灌胃；运动椰子油组大鼠给予同等体积椰子油灌胃，直至第9天运动结束；空白对照组和运动对照组大鼠不做特殊处理。使用ELISA及转录组测序技术测定不同组大鼠骨骼肌中炎症因子的水平及差异基因，将得到的差异基因进行KEGG分析，并通过荧光定量PCR验证测序数据的准确性。
结果与结论：①ELISA检测结果显示，相比于空白对照组和运动椰子油组，运动对照组中白细胞介素6(P < 0.05)、肿瘤坏死因子α(P < 0.01)、白细胞介素10等质量浓度均增加；经大麻二酚干预后，白细胞介素6、肿瘤坏死因子α质量浓度随大麻二酚浓度的加大而呈现依次递减的趋势；②通过GO和KEGG数据库的比较，对差异基因的功能特性进行分析，结果表明差异基因主要参与肿瘤坏死因子信号通路和Toll样受体信号通路；③RT-qPCR验证结果显示，随机选择5个差异基因的变化趋势与转录组测序结果相一致。结论：大麻二酚能够改善力竭运动引起的骨骼肌炎症反应。
https://orcid.org/0009-0000-7902-4408(朱文宁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 转录组, 大麻二酚, 力竭运动, 骨骼肌炎症, 差异基因, 炎症因子, KEGG分析, 炎症通路

Abstract: BACKGROUND: Cannabidiol is effective in ameliorating the body’s inflammatory response, but no clear mechanistic studies have been conducted to ameliorate skeletal muscle inflammation induced by exhaustive exercise.
OBJECTIVE: To explore the mechanism by which cannabidiol improves skeletal muscle inflammation during exhaustive exercise by using transcriptome sequencing technology.
METHODS: Thirty-six Sprague-Dawley rats were randomly divided into six groups: blank control group, exercise coconut oil group, exercise control group, 50 mg/kg cannabidiol group, 60 mg/kg cannabidiol group, and 70 mg/kg cannabidiol group, with six rats in each group. Except for rats in the blank control group, rats in each group were subjected to swimming exercise for 9 days to produce the exhaustive exercise model. At the end of each swimming exercise, rats in the cannabidiol groups were given 2 mL of fat-soluble cannabidiol at different concentrations (50, 60, and 70 mg/kg) by gavage; rats in the exercise coconut oil group were given the same volume of coconut oil by gavage until the end of the exercise on the 9th day; and rats in the blank control group and the exercise control group were not given any special treatment. The levels of inflammatory factors and differentially expressed genes in the skeletal muscle of rats in each group were determined using ELISA and transcriptome sequencing techniques. Differentially expressed genes obtained were subjected to KEGG analysis, and the accuracy of the sequencing data was verified by fluorescence quantitative PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The results of ELISA showed that the contents of interleukin-6 (P < 0.05), tumor necrosis factor-α (P < 0.01), interleukin-10 and other inflammatory factors in the exercise group increased significantly compared with the blank control group and the coconut oil group. After cannabidiol intervention, the mass concentrations of interleukin-6 and tumor necrosis factor-α showed a sequential decrease with increasing cannabidiol concentration. By comparing GO and KEGG databases, the functional properties of differentially expressed genes were analyzed, and the results showed that the differentially expressed genes were mainly involved in the tumor necrosis factor signaling pathway and the Toll-like receptor signaling pathway. RT-qPCR results showed that the trends of five randomly selected differentially expressed genes were in agreement with the transcriptome sequencing results. To conclude, cannabidiol can improve skeletal muscle inflammation caused by exhaustive exercise.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: transcriptome, cannabidiol, exhaustive exercise, skeletal muscle inflammation, differentially expressed gene, inflammatory factor, KEGG analysis, inflammatory pathway

中图分类号:

朱文宁, 孙莉莉, 彭丽娜, 司俊成, 臧万里, 殷伟东, 李孟琪. 大麻二酚干预下力竭运动大鼠骨骼肌炎症相关基因的挖掘与验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(11): 2347-2356.

Zhu Wenning, Sun Lili, Peng Lina, Si Juncheng, Zang Wanli, Yin Weidong, Li Mengqi . Mining and verification of inflammation-related genes in skeletal muscle of exhaustive exercise rats undergoing cannabidiol intervention[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(11): 2347-2356.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析实验过程中大鼠均无死亡，36只大鼠全部进入结果分析。
2.2 大麻二酚对力竭运动大鼠炎症相关因子的影响见图1。
2.2.1 肿瘤坏死因子α 相比于空白对照组，运动椰子油组中的肿瘤坏死因子α质量浓度无显著变化，运动对照组显著升高(P < 0.05)；大麻二酚干预的各组肿瘤坏死因子α质量浓度低于运动对照组，并随浓度增加呈现依次递减趋势，70 mg/kg大麻二酚组中肿瘤坏死因子α质量浓度最低，与运动对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，说明70 mg/kg大麻二酚药物的灌胃效果最好。
2.2.2 白细胞介素6 与空白对照组相比，运动椰子油组和运动对照组中白细胞介素6的质量浓度呈现升高趋势；大麻二酚干预的各组白细胞介素6质量浓度随大麻二酚

的浓度增加呈现依次递减趋势，70 mg/kg大麻二酚组中白细胞介素6质量浓度最低，其中60 mg/kg大麻二酚组和70 mg/kg大麻二酚组显著低于运动对照组(P < 0.05)。
2.2.3 白细胞介素10因子与空白对照组相比，运动椰子油组中白细胞介素10质量浓度降低，运动对照组中白细胞介素10质量浓度升高，大麻二酚干预的各组白细胞介素10呈现下降趋势，70 mg/kg大麻二酚组白细胞介素10质量浓度接近空白对照组，各组之间比较差异无显著性意义。
综合以上ELISA结果可知，70 mg/kg大麻二酚药物灌胃后抗炎效果最好，因此，后续实验选取空白对照组、运动对照组、70 mg/kg大麻二酚组大鼠骨骼肌进行转录组学测序分析。
2.3 差异表达基因的火山图分析为了能够更加直观地展示3组之间差异基因的表达水平，绘制了火山图，见图2。比较空白对照组和运动对照组，有588个基因上调，487个基因下调；比较空白对照组和大麻二酚组，有626个基因上调，747个基因下调；比较运动对照组和大麻二酚组，有522个基因上调，758个基因下调。
2.4 差异表达基因的KEGG富集分析 KEGG数据库整合了基因组化学和系统功能信息，为了鉴定差异表达基因所涉及的通路，将3组差异表达基因映射到KEGG数据库所记录的通路中进行绘图。在图3-5中显示了3组KEGG气泡图的类别。
2.4.1 空白对照组与运动对照组KEGG通路如图3所示，空白对照组与运动对照组的KEGG通路主要涉及人瘤病毒感染、ECM-受体相互作用、肥厚性心肌病、扩张型心肌病、丙型肝炎、NOD样受体信号通路、甲型流感、癌症通路、病毒性致癌、P13-Akt等信号通路。根据显著性水平对比，

推测力竭运动大鼠可能与扩张型心肌病、丙型肝炎、NOD样受体信号通路、癌症通路等相关。
2.4.2 空白对照组与大麻二酚组KEGG通路如图4所示，空白对照组与大麻二酚组KEGG通路主要涉及癌症通路、TRP通道的炎症递质调节、肿瘤坏死因子(TNF)通路、乳腺癌、基底细胞癌、cGMP-PKG通路、胰岛素分泌等通路。
2.4.3 运动对照组与大麻二酚组KEGG通路如图5所示，运动对照组与大麻二酚组KEGG通路主要涉及甲型流感、丙型肝炎、NOD样受体信号通路、PPAR信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、肥厚性心肌病、RIG-I样受体信号通路、ECM-受体相互作用等通路。根据显著性水平对比，推测大麻二酚干预后骨骼肌疲劳状态得到缓解的作用机制可能与NOD样受体信号通路、PPAR信号通路、丙型肝炎、肿瘤坏死因子信号通路等有关。

2.5 肿瘤坏死因子信号通路的KEGG富集分析肿瘤坏死因子信号通路上的基因调控机体的炎症反应与免疫应答，使用KEGG的富集通路进行分析，发现该通路上的基因表达变化情况。
2.5.1 空白对照组和运动对照组比较如图6所示。在肿瘤坏死因子信号通路中，共测得8个上调基因，包括AP-1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Il1b、IL15、Fos、Socs3；3个下调基因，包括Ccl5、Cxcl10、Ifi47。相比于空白对照组，运动对照组炎症因子上调数量更高，这在一定程度说明了剧烈运动后机体产生了免疫炎症反应。
2.5.2 运动对照组和大麻二酚组比较如图7所示，在肿瘤坏死因子信号通路中共测得4个上调基因，包括Cxcl10、Ifi47、P13K、IRF1；13个下调基因，包括IkBα、P38、MSK1/2、Ccl2、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Jag1、IL1b、Nfkbia、JunB、Sele、Ptgs2。相比于运动对照组，大麻二酚组炎症因子下调数量更多，这从侧面证明，大麻二酚能够改善力竭运动大鼠自身的炎症状态。
2.6 TLR信号通路的KEGG富集分析 TLR信号通路上的基因参与机体的炎症反应与免疫应答，使用KEGG的富集通路进行分析，发现该通路上的基因表达变化情况。
2.6.1 空白对照组与运动对照组比较如图8所示，在TLR信号通路中共测得4个上调基因，包括TLR5、白细胞介素1β、AP-1、TLR7/8，4个下调基因，包括IRF7、RANTES、IP-10、MIG。
2.6.2 运动对照组和大麻二酚组比较如图9所示，在TLR信号通路中测得2个上调基因，包括PI3K、MIG，4个下调基因，包括TLR2、P38、IkBα、白细胞介素1β。相比于运动对照组，大麻二酚组炎症因子下调数量更多，这从侧面证明大麻二酚能够改善力竭运动大鼠自身的炎症状态。
2.7 RT-qPCR验证结果如图10所示，5个基因的变化趋势与转录组测序结果相一致，进一步证实了转录组数据具有较高的可信度。

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引言

短时间力竭运动和恢复不足的失衡会诱发肌肉骨骼创伤，增加促炎细胞因子的产生和释放，主要是白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β与不同的有机系统相互作用，使机体出现疲劳、乏力等现象[1]。力竭运动通常会导致更高水平的炎症递质，从而可能增加受伤和慢性炎症的风险[2]。力竭运动引发的运动疲劳是运动员常见的现象，持续的运动疲劳会增加运动损伤的风险，因此及时缓解运动疲劳是十分有必要的。
大麻二酚(cannabidiol，CBD)是从大麻植株中提取的一种非成瘾性大麻素。大麻(Cannabis sativa L.)是桑科大麻亚科大麻属(Cannabis L.)植物，药用价值较高，其主要成分是四氢大麻酚和大麻二酚。研究发现，大麻二酚作为非成瘾性大麻素，能够阻碍四氢大麻酚对人体神经系统产生的致幻作用。此外，越来越多证据表明大麻二酚对人体是安全的，因此，大麻二酚不再被世界反兴奋剂机构禁止[3]。随着20世纪80年代后大麻二酚研究的活跃，揭示了大麻二酚的众多作用，如抗炎[4]、缓解精神紊乱[5-6]、抗癫痫[7]、治疗失眠焦虑[8]。在急性炎症的临床前模型中，发现大麻二酚通过刺激抗炎细胞因子(如白细胞介素4、白细胞介素10)的产生[9-10]，抑制促炎细胞因子(如白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α)发挥抗炎作用[11-13]。因此，基于其安全性和有效性，大麻二酚被认为是一种潜在的改善骨骼肌炎症的方法。
转录组测序(RNA Sequencing，RNA-seq)技术日趋成熟，目前已广泛应用在改善机体炎症的研究中，解释了改善炎症的内在机制。如DOPKINS等[14]利用RNA-seq技术分析大麻二酚对实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠模型所产生的差异基因，描绘出大麻二酚干预实验性自身免疫性脑脊髓炎肠内膜过度炎症的机制。对中枢神经系统组织进行深入scRNA序列分析结果表明，大麻二酚干预导致中枢神经系统内CXCL9、CXCL10和白细胞介素1β的表达显著降低，从而抑制炎性巨噬细胞的浸润。大麻二酚可独立于经典大麻素受体CB1和CB2，并抑制白细胞介素1β的产生。大麻二酚治疗还可以诱导中枢和外周神经系统中髓源性抑制细胞的产生。这些发现证明了大麻二酚对自身免疫性神经炎的有益作用，其方法是阻断促炎性化学引诱剂的表达，调节炎性巨噬细胞活性，促进髓源性抑制细胞扩张，限制胃肠道的全身低度炎症，最终导致实验性自身免疫性脑脊髓炎的减弱。
以上结果阐明了大麻二酚改善中枢神经炎症的机制，然而，利用RNA-Seq转录组学技术探究大麻二酚改善骨骼肌炎症的报道仍然有限。此次研究利用ELISA技术检测不同组大鼠骨骼肌中的炎症因子，利用RNA-Seq鉴定力竭运动大鼠和大麻二酚处理后的差异表达基因，并了解这些差异表达基因的不同功能。基于RNA-Seq测序和验证结果，重点探讨了大麻二酚对力竭运动大鼠骨骼肌炎症相关基因变化的调控机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2023年3-9月在哈尔滨体育学院运动人体科学学院分子实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康SPF级7周龄雄性SD大鼠共36只，体质量为250-300 g，由哈尔滨医科大学提供，生产许可证号：SCXK(黑)2019-001。实验动物饲养在黑龙江中医药大学方剂学实验室。室温维持在(22±4) ℃，动物分笼饲养。在饲养期间，所有大鼠自由活动，自由摄入食物和水。该研究方案经过哈尔滨体育学院伦理委员会审核批准，伦理批号：2022002。
1.3.2 主要药品和试剂大麻二酚(黑龙江省展棋生物科技有限公司)；RNA提取试剂盒(EasyPure miRNA Kit，中国)；反转录试剂盒(HiScript® IIIRT Super Mix for qPCR(+gDNA wiper；R323-00，诺唯赞生物科技，中国)；荧光定量PCR试剂盒(trans start Top Green qPCR super mix；AQ 131-04，全式金生物科技，中国)；大鼠白细胞介素6 ELISA Kit、大鼠白细胞介素10 ELISA Kit、大鼠肿瘤坏死因子α ELISA Kit(碧云天生物科技，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组待大鼠适应性喂养1周后，随机分成6组：空白对照组，运动椰子油灌胃组(运动椰子油组)、运动对照组，运动+50 mg/kg大麻二酚灌胃组(50 mg/kg大麻二酚组)、运动+60 mg/kg大麻二酚灌胃组(60 mg/kg大麻二酚组)、运动+70 mg/kg大麻二酚灌胃组(70 mg/kg大麻二酚组)，每组6只。
1.4.2 制作力竭运动模型除空白对照组外，其余各组大鼠进行为期9 d的游泳运动(运动方案见表1)，第1天游泳30 min，每天逐渐加量，第9天游泳时间为200 min到力竭。当大鼠失去协调动作，在10 s内不能回到水面，捞出后置于平面不能完成翻正反射，即建模成功。

1.4.3 各组大鼠处理方法每次游泳运动结束后，对大鼠按组别进行处理，大麻二酚组大鼠给予不同浓度(50，60，70 mg/kg)脂溶性大麻二酚2 mL灌胃(大麻二酚溶于椰子油中)[15]；运动椰子油组大鼠给予同等体积椰子油(食用)灌胃，在第9天运动结束后进行最后一次灌胃[16]。灌胃结束后6 h，按照体质量基数的不同，抽取不同剂量的2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)注射至大鼠腹腔，使大鼠处于深度麻醉状态，固定大鼠四肢，取骨骼肌，一部分置于-80 ℃冰箱，进行ELISA实验，另一部分送至青岛百迈客生物科技有限公司进行cDNA文库构建和Illumina测序。
1.4.4 ELISA检测大鼠骨骼肌中炎症因子水平设置标准品和样本孔：在酶标板上标准品孔依次加入不同浓度标准品，各50 μL，质量浓度从低到高依次为：0，20，40，80，160，320 ng/μL。待测样品孔中，加入40 μL样品稀释液，再加入待测样品10 μL，使样品为5倍稀释浓度。将样品加于酶标板孔底部，不触及孔壁，轻轻晃动混匀。除空白孔外，其余孔加入酶标试剂100 μL。用封板膜封板，置于保温箱中，37 ℃温育1 h。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满20倍浓缩洗涤液，静置30 s后弃去，相同动作重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应(此时蓝色转变为黄色)。空白孔调零，全自动酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度(A值)，根据吸光度值计算待测样本的白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平。
1.4.5 总RNA提取、cDNA文库构建及测序
(1)总RNA提取：取大鼠腓肠肌组织，加入Trizol1 mL充分研磨，冰上静置10 min，4 ℃、14 000 r/min离心5 min，取上清液，加入200 μL氯仿，振荡20 s，冰上静置10 min，4 ℃、14 000 r/min离心5 min，吸取上清液至新EP管中，加入等体积预冷异丙醇，摇匀后冰上静置10 min，离心，沉淀加1 mL体积分数75%乙醇洗涤，室温静置5 min，离心，沉淀加适量DEPC水溶解，提取出RNA。
(2)cDNA文库构建及测序：①用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；②加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断；③以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，利用AMPureXPbeads纯化cDNA；④纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXPbeads进行片段大小选择；⑤最后通过PCR富集得到cDNA文库。
1.4.6 差异表达基因分析对于有生物学重复的样本，DESeq适用于进行样品组间的差异表达分析，获得两个生物学条件之间的差异表达基因集，在差异表达基因检测过程中，将差异倍数(Fold Change)≥1.5且FDR < 0.05作为筛选标准。
1.4.7 KEGG分析使用百迈客云平台BMKCloud(www.biocloud.net)提供的生物信息学分析平台。KEGG(Kyoto EncycloPediaof Genesand Genomes)是系统分析基因功能、基因组信息的数据库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。
1.4.8 RT-qPCR验证与检测随机选择5个上、下调差异基因验证RNA-seq结果的准确性，GAPDH作为内参进行RT-qPCR验证。采用2-ΔΔCt法测定实验组基因表达相对于对照组的倍数变化，引物序列见表2。RT-qPCR反应体系为20 μL，各试剂反应量为：2xTransStart® Top Green qPCR SuperMix 10 μL，Nuclease-free Water 7 μL，cDNA 2 μL，PCR正反向引物各0.5 μL。反应进行条件为：94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃15 s，72 ℃10 s；40个循环。

1.5 主要观察指标 ①大麻二酚对力竭运动大鼠炎症相关因子的影响；②差异表达基因的火山图分析；③差异基因的KEGG富集分析；④肿瘤坏死因子信号通路及Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路的KEGG富集分析；⑤RT-qPCR验证结果。
1.6 统计学分析通过SPSS 27.0统计软件对结果进行分析，采用独立样本t检验，结果以x±s表示。P < 0.05表示差异有显著性意义。该文的统计学方法经哈尔滨体育学院统计学专家审核。

讨论

此次实验结果表明，大强度运动导致大鼠体内肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等炎症因子水平上升，使机体免疫水平失衡，代谢紊乱；在运动疲劳状态下，机体又能够发挥自我调节能力，增加白细胞介素10等抗炎因子的水平，以便于减缓体内炎症因子的表达水平，起到保护机体的作用。在进行大麻二酚干预后，大鼠体内肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等炎症因子的上升趋势受到抑制，水平恢复至正常状态，大麻二酚还能够提高白细胞介素10等抗炎因子的水平，减缓机体炎症反应，帮助机体提升抗炎能力，完善机体的免疫水平，使受损伤的组织尽快恢复。
基于RNA-seq数据的分析结果，将空白对照组、运动对照组、大麻二酚组大鼠的基因进行对比，结果发现大鼠骨骼肌中多个基因发生了显著差异表达变化，其中参与免疫炎症反应过程且表达量较高的基因主要有Cxcl1、Cxcl10、白细胞介素1β、CCL2等炎症因子。研究表明，CXCL10拮抗剂可以限制炎症免疫反应，促进脊髓损伤神经元再生和功能恢复[17]。大麻二酚可减少CXCL1等炎性细胞因子和趋化因子的产生，对HIV-感染和神经炎症具有显著治疗潜力[18]。KURET等[19]证明大麻二酚处理尿路上皮细胞能够降低CXCL1和CXCL10的蛋白表达，减弱NFκB磷酸化，缓解间质性膀胱炎。在此次研究中，这些基因在大麻二酚组中检测到显著上调，在给予大麻二酚药物后其表达水平显著降低，推测可能为大麻二酚发挥抗大鼠骨骼肌炎症的靶点。
白细胞介素1β是一种重要的促炎细胞因子，具有强大的促炎活性，并且可以促进多种促炎递质的分泌[20]。研究证实，大麻二酚通过抑制白细胞介素1 β /白细胞介素1RI / β-连环蛋白途径中的关键效应子蛋白激酶B (AKT)的活化，进而抑制该信号通路的迁移和进展[21]。CC趋化因子受体1 (CCR1)作为一种炎症因子，控制中性粒细胞向炎症部位的运输[22]。趋化因子配体2(CCL2)是单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的主要趋化因子和激活剂。CCL2在放大和加速炎症级联反应中起关键作用，与慢性不可控炎症(肝硬化、神经性疼痛、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、变形性关节炎、缺血性损伤、癌症等)密切相关[23]。此次研究转录组结果显示，在运动疲劳造模后，大鼠骨骼肌中上述基因均上调，在大麻二酚干预下，CCL2等炎症因子下调，这一结果与其他学者研究结果相一致，提示大麻二酚可能通过抑制上述炎症因子的表达改善机体骨骼肌损伤情况。
研究表明，肿瘤坏死因子信号通路、TLR信号通路以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)等通路被确定为介导大麻二酚抗炎活性的关键调节通路[24]。此次研究中，KEGG富集通路分析结果显示，肿瘤坏死因子信号通路和TLR信号通路是大麻二酚干预后运动疲劳大鼠体内起主要反应的两条信号通路。众所周知，肿瘤坏死因子α在炎症过程中起着重要作用。肿瘤坏死因子诱导的炎症主要通过核因子κB和MAPK信号通路发生，然而肿瘤坏死因子α可以通过几种替代途径引发炎症反应，其中包括鞘磷脂酶途径的诱导，其导致二酰基甘油和蛋白激酶C的产生，并最终通过替代途径导致核因子κB的活化[25]。肿瘤坏死因子α信号的不适当或过度激活与慢性炎症有关，因此，肿瘤坏死因子α抑制剂在多种自身免疫性疾病中显示出明显的效力[26]。TLR信号传导对于防御致病性感染以及调节组织发育至关重要[27]。TLR是先天免疫应答的关键组成部分，已知其信号通路可激活靶基因，如核因子κB和参与炎症和免疫反应的细胞因子，因此，该受体通路能够显著降低机体受病原体侵袭的概率，从而达到保护机体的作用[28]。在此次研究中，运动对照组与空白对照组相比，处于TLR信号通路和肿瘤坏死因子信号通路上的促炎因子的表达显著上调，如AP-1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Il1b、IL15、Fos、Socs3(TNF)；TLR5、白细胞介素1β(Toll)等。分析运动对照组和大麻二酚组差异基因的KEGG富集图后发现，处于TLR信号通路和TNF信号通路上的促炎因子的表达显著下调，例如IkBα、P38、MSK1/2、Ccl2、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Jag1、白细胞介素1β、Nfkbia、JunB、Sele、Ptgs2(TNF)；TLR2、P38、IkBα、白细胞介素1β(Toll)，其中，CXCL1、p38、CCL2、TLR2、P38等因子是常见的与骨骼肌相关的炎症标志物，在大麻二酚组表达量下降表明大麻二酚干预对力竭运动大鼠腓肠肌炎症反应的改善作用。
MASUDA等[29]发现，CXCL1具有促进卫星细胞肌生成、维持骨骼肌稳态的作用。CXCL1 触发了强大且特异性的中性粒细胞/M2巨噬细胞反应，这可能使肌肉炎症损伤的修复变得困难[30]。缺血会导致骨骼肌炎症，而近红外光能够显著降低骨骼肌中炎症标志物CXCL1的表达[31]。p38家族是一组高度进化保守的MAPK，参与并帮助协调细胞对几乎所有压力刺激的反应，它在调节白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α等促炎细胞因子的生物合成中起关键作用[32]。研究表明，炎症通过p38 MAPK磷酸化诱导的蛋白质降解导致骨骼肌萎缩，脉冲超声照射通过抑制p38 MAPK磷酸化对炎症诱导的肌肉萎缩具有预防作用[33]。剧烈的急性运动可能带来大的全身炎症反应，其特征是炎症细胞因子和趋化因子的显著增加。CCL2是参与运动炎症反应的关键因素[34]。外源性硫化氢治疗减少了骨骼肌中干扰素γ、CCL2等炎症趋化因子的表达水平，并部分改善了骨骼肌损伤[35]。骨骼肌炎症损伤上调TLR2，进而激活TLR信号通路，导致组织中更多促炎细胞因子的分泌[36]。研究表明，木犀草素(LU)通过抑制肌肉中Tlr2等炎症因子的mRNA表达发挥抗骨骼肌炎症的作用[37]。除此之外，此次实验结果显示，与运动对照组相比，大麻二酚组中TLR信号通路上CXCL1、CCL2和肿瘤坏死因子信号通路上p38、TLR2等与骨骼肌炎症密切相关的基因表达量下调，这些结果表明大麻二酚可能通过下调这些炎症因子的表达量来抑制TLR通路和肿瘤坏死因子信号通路，进而发挥其改善运动疲劳骨骼肌炎症的作用。
综上所述，从转录组的分析结果来看，剧烈运动可能是通过上调骨骼肌中Cxcl1、白细胞介素1β、白细胞介素15等炎症因子，引起机体运动疲劳状态；与此同时，大麻二酚组中炎症因子的下调表明大麻二酚可能是通过抑制Ccl2、Cxcl1、TLR2、P38、白细胞介素1β等炎症因子，调节TLR通路和肿瘤坏死因子信号通路来改善运动疲劳大鼠的骨骼肌炎症，缓解机体运动疲劳状态。
此次研究通过对空白对照组、运动对照组和大麻二酚组大鼠骨骼肌组织进行RNA-seq分析，并进行两两比较，检测到大量参与炎症反应的差异表达基因，KEGG气泡图中，多个炎症相关通路显著富集。此次研究结果结合其他文献报道表明，免疫炎症损伤反应参与机体力竭运动，并且在大麻二酚干预下炎症反应受到抑制，大麻二酚组中白细胞介素1b、Ccr1、白细胞介素16、Cxcl1等促炎因子数量的下调以及Cxcl9、Ldlr等抗炎因子的上调支持了以上推断；KEGG富集分析图的结果显示，相比于空白对照组，运动对照组中肿瘤坏死因子信号通路上的炎症因子以上调为主，推测力竭运动可能通过激活肿瘤坏死因子信号通路，介导促炎反应的发生；同时，相比于运动对照组，大麻二酚组中肿瘤坏死因子信号通路上的多个促炎因子受到了抑制，可以推断，大麻二酚可能通过下调肿瘤坏死因子信号通路上促炎因子的表达来缓解机体炎症反应。总之，此次研究丰富了大麻二酚在干预炎症机制方面的研究内容，为深入探讨大麻二酚缓解机体运动性炎症损伤的机制提供了重要线索，也为相关炎症损伤的病因学提供了新的研究方向和解决方法。不足之处：实验仅从肿瘤坏死因子信号通路和TLR信号通路介导的炎症反应探讨大麻二酚对机体炎症的改善作用，并未针对其他机制与通路展开大麻二酚抗炎的相关研究，因此实验相关指标的变化与否可能受其他通路或因素的影响。
结论：①大麻二酚能够显著改善力竭运动大鼠骨骼肌的炎症反应，降低力竭运动大鼠体内的肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等炎症因子的表达；②大麻二酚改善力竭运动大鼠炎症反应的机制可能是通过下调肿瘤坏死因子信号通路和TLR信号通路上的促炎因子的表达来完成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

大麻二酚干预下力竭运动大鼠骨骼肌炎症相关基因的挖掘与验证

Mining and verification of inflammation-related genes in skeletal muscle of exhaustive exercise rats undergoing cannabidiol intervention

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