新橙皮苷治疗骨质疏松症的靶点及对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用

doi:10.12307/2025.030

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (7): 1437-1447.doi: 10.12307/2025.030

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新橙皮苷治疗骨质疏松症的靶点及对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用

章镇宇1，2，梁秋健1，2，杨军1，韦相宇1，蒋捷1，黄林科1，谭桢1

1广西医科大学第二附属医院，广西壮族自治区南宁市 530005；2广西医科大学，广西再生医学重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2023-11-28 接受日期:2024-02-06 出版日期:2025-03-08 发布日期:2024-06-27
通讯作者: 黄林科，博士，副主任医师，广西医科大学第二附属医院，广西壮族自治区南宁市 530005 通讯作者：谭桢，博士，主任医师，广西医科大学第二附属医院，广西壮族自治区南宁市 530005
作者简介:章镇宇，男，1996 年生，浙江省绍兴市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事骨与关节疾病的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(8216140155)，项目负责人：谭桢；2023年度广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(2023KY0109)，项目负责人：黄林科；广西自然科学青年科学基金项目(2022JJB140140)，项目负责人：蒋捷

Target of neohesperidin in treatment of osteoporosis and its effect on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Zhenyu1, 2, Liang Qiujian1, 2, Yang Jun1, Wei Xiangyu1, Jiang Jie1, Huang Linke1, Tan Zhen1

1Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530005, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Guangxi Key Laboratory of Regenerative Medicine, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-11-28 Accepted:2024-02-06 Online:2025-03-08 Published:2024-06-27
Contact: Huang Linke, MD, Associate chief physician, Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530005, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Tan Zhen, MD, Chief physician, Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530005, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhang Zhenyu, Master candidate, Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530005, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Regenerative Medicine, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 8216140155 (to TZ); 2023 Basic Research Ability Improvement Project Young and Middle-Aged Teachers of Guangxi Universities, No. 2023KY0109 (to HLK); Guangxi Natural Science Youth Science Foundation, No. 2022JJB140140 (to JJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

生物信息学：是一门整合了生物、计算机、信息学工程、数学和统计等多个学科内容的交叉学科，以研究、开发、应用计算工具和方法来获取、存储、可视化和解释医学或生物数据。
骨质疏松症：是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病，严重影响了患者的生活质量与身心健康。

背景：前期研究发现新橙皮苷可以延缓去卵巢小鼠的骨丢失，具有治疗骨质疏松症的潜力，但其具体作用机制仍有待探究。
目的：基于生物信息学和体外细胞实验探索新橙皮苷治疗骨质疏松症的关键靶点与可能机制。
方法：从GEO数据库获得骨质疏松症相关的基因表达数据集，通过R语言筛选和分析差异表达基因，从GeneCards和DisGeNET数据库筛选骨质疏松症的相关靶点，从ChEMBL和PubChem数据库筛选新橙皮苷的相关靶点，三者取交集获得共同靶点，使用String数据库构建交集基因的PPI网络，筛选关键目标靶点，使用DAVID数据库进行GO、KEGG富集分析，运用AutoDock软件对新橙皮苷与目标靶点蛋白进行分子对接验证。检测新橙皮苷对C57小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，以完全培养基为空白对照组、成骨诱导液为对照组，含不同浓度(25，50 μmol/L)新橙皮苷的成骨诱导液为实验组，在相应时间检测细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达、矿化程度、成骨相关基因及目标靶点基因的表达。
结果与结论：①筛选出差异表达基因9 253个，骨质疏松症相关靶点2 161个，新橙皮苷相关靶点326个，三者共同靶点53个，53个基因在骨质疏松症样本中皆上调。PPI网络筛选出具有研究意义的目标靶点基因PRKACA。GO功能与KEGG通路富集分析表明，新橙皮苷通过PRKACA靶点治疗骨质疏松症主要依靠蛋白质磷酸化和蛋白质自身磷酸化等生物过程，作用于内分泌抵抗、癌症中的蛋白聚糖、雌激素信号通路等发挥治疗作用。分子对接结果表明，新橙皮苷与目标靶点PRKACA对应的蛋白有一定的结合能力。②碱性磷酸酶染色显示新橙皮苷可以促进间充质干细胞成骨分化早期碱性磷酸酶的表达，茜素红染色显示新橙皮苷可以促进间充质干细胞成骨分化的矿化。RT-qPCR检测结果显示，新橙皮苷可以促进碱性磷酸酶、PRKACA、骨钙素mRNA的表达。③结果表明，新橙皮苷可能通过雌激素信号通路上的PRKACA靶点促进成骨分化，从而防治骨质疏松症。

https://orcid.org/0009-0004-4726-4289 (章镇宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 生物信息学, 骨质疏松症, 新橙皮苷, 骨髓间充质干细胞, PRKACA基因

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have found that neohesperidin can delay bone loss in ovariectomized mice and has the potential to treat osteoporosis, but its specific mechanism of action remains to be explored.
OBJECTIVE: To explore the key targets and possible mechanisms of neohesperidin in the treatment of osteoporosis based on bioinformatics and cell experiments in vitro.
METHODS: The gene expression dataset related to osteoporosis was obtained from GEO database, and the differentially expressed genes were screened and analyzed in R language. The osteoporosis-related targets were screened from GeneCards and DisGeNET databases, and the neohesperidin-related targets were screened from ChEMBL and PubChem databases, and the common targets were obtained by intersection of the three. The String database was used to construct the PPI network of intersection genes, and the key targets were screened. The DAVID database was used for GO and KEGG enrichment analysis. The AutoDock software was used to verify the molecular docking between the neohesperidin and the target protein. The effect of neohesperidin on osteogenic differentiation of C57 mouse bone marrow mesenchymal stem cells was detected. Complete medium was used as blank control group; osteogenic induction medium was used as the control group; and osteogenic induction medium containing different concentrations of neohesperidin (25, 50 μmol/L) was used as experimental group. The expression of alkaline phosphatase, the degree of mineralization, the expression of osteogenic-related genes and target genes during osteogenic differentiation of cells were measured at corresponding time points.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) 9 253 differentially expressed genes, 2 161 osteoporosis-related targets, and 326 neohesperidin-related targets were screened. There were 53 common targets among the three. All 53 genes were up-regulated in osteoporosis samples. The PPI network screened the target gene PRKACA of research significance. GO function and KEGG pathway enrichment analysis showed that neohesperidin’s treatment of osteoporosis through PRKACA target mainly depended on biological processes such as protein phosphorylation and protein autophosphorylation, acting on endocrine resistance, proteoglycan in cancer, and estrogen signaling pathway to play a therapeutic role. Molecular docking results showed that neohesperidin had a certain binding ability to the protein corresponding to the target PRKACA. (2) The results of alkaline phosphatase staining showed that neohesperidin could promote the expression of alkaline phosphatase in the early stage of osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Alizarin red staining showed that neohesperidin could promote the mineralization of osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. RT-qPCR results showed that neohesperidin could increase the mRNA expression of alkaline phosphatase, PRKACA, and osteocalcin. (3) These results indicate that neohesperidin may promote osteogenic differentiation through PRKACA target on the estrogen signaling pathway to prevent and treat osteoporosis.

Key words: bioinformatics, osteoporosis, neohesperidin, bone marrow mesenchymal stem cell, PRKACA gene

中图分类号:

章镇宇, 梁秋健, 杨军, 韦相宇, 蒋捷, 黄林科, 谭桢. 新橙皮苷治疗骨质疏松症的靶点及对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1437-1447.

Zhang Zhenyu, Liang Qiujian, Yang Jun, Wei Xiangyu, Jiang Jie, Huang Linke, Tan Zhen. Target of neohesperidin in treatment of osteoporosis and its effect on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(7): 1437-1447.

图/表（结果） 5

2.1 数据集获取及差异表达基因的生物信息学筛选与分析从GEO数据库下载GSE230665芯片数据，获得人类女性绝经后股骨组织的基因表达谱，该数据集包含15例接受髋关节置换的绝经妇女样本，分别为3例绝经后健康妇女样本和12例绝经后原发性骨质疏松症患者样本。使用Excel表格筛选差异表达基因，去除重复项，条件为P Value < 0.01，获得符合筛选条件的9 253条差异表达基因。对P Value由小到大排列的前50个基因进行分析，对各基因的表达值进行log10转换，得到上调基因48个，下调基因2个，绘制热图，见图1A。
按照前述方法进行P Value校正，对差异表达基因进行分析，筛选条件为adj.P Value < 0.05，|logFC| > 1，得到上调基因23个，下调基因25个，绘制火山图，见图1B。按照adj.P Value由小到大排列的前5个上调基因分别为KIAA1654、FAM74A4、HLA-B、COL1A1、RPL34，前5个下调基因分别为CSN1S1、PRG4、AMTN、MMP3、CRTAC1。
采用CIBERSORT计算方法估计所有样本的肿瘤浸润性免疫细胞丰度谱，发现该组样本中活化的肥大细胞占优势，绘制占比堆叠柱状图，见图1C。

2.2 骨质疏松症相关靶点在GeneCards数据库得到骨质疏松症相关的基因靶点信息5 630条，以Relevance score > 1为标准对得到的数据进行筛选，剩余1 659个基因靶点。在DisGeNET数据库得到基因靶点信息1 098条。将2个数据库的基因靶点信息进行整合，删除重复项，最终得到2 161个骨质疏松症相关靶点基因。
2.3 新橙皮苷相关靶点在ChEMBL数据库中得到新橙皮苷相关的蛋白靶点信息255条，将筛选后的数据导入UniProt数据库匹配，得到相应的基因靶点255个。在SwissTarget Prediction数据库得到新橙皮苷相关的基因靶点信息100条。将以上两部分基因靶点信息进行整合，删除重复项，最终得到326个新橙皮苷相关靶点基因。
2.4 数据集、疾病靶点、药物靶点的交集基因通过Venny 2.1.0在线作图工具对GEO芯片数据集GSE230665的差异表达基因、骨质疏松症相关靶点基因、新橙皮苷相关靶点基因取交集，并制作韦恩图，见图2A，得到交集基因53个。对交集基因在GSE230665中的表达值进行log10转换，发现53个交集基因的表达量在骨质疏松症样本中都上调，绘制热图，见图2B。
2.5 构建蛋白互作网络将交集基因导入STRING数据库进行分析，绘制交集基因PPI网络图，见图3A。获取TSV数据文件并导入Cytoscape 3.9.1软件进行分析，使用CytoHubba插件根据Betweenness值、Closeness值、Degree值进行拓扑分析，筛选出前10位核心靶点，见图3B-D。
进一步研究发现，根据Betweenness值排序的前3位基因分别是MAPK3、PRKACA、EGFR，根据Closeness值和Degree值排序的前3位基因都是EGFR、BCL2、MAPK3，汇总得到4个核心靶点EGFR、MAPK3、BCL2、PRKACA。在中国知网以这4个核心靶点基因分别和“骨质疏松症”为主题进行高级检索，其中只有PRKACA基因未见与骨质疏松症相关的研究报道，因此将PRKACA作为进一步研究的目标靶点基因。

2.6 GO富集分析结果将交集基因导入DAVID数据库进行GO富集分析，得到的分析结果按P.Value值由小到大排列，使用微生信在线作图软件对前20条富集结果制作气泡图进行可视化分析。其中生物过程(Biological Process，BP)主要涉及细胞对活性氧的反应、正向调节蛋白磷酸化和正向调节细胞增殖等，见图4A；细胞成分(Cellular Component，CC)主要涉及大分子复合物、核和质膜等，见图4B；分子功能(Molecular Function，MF)主要涉及相同蛋白质结合、酶结合和RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合，见图4C。
目标靶点基因PRKACA涉及的生物过程有蛋白质磷酸化和蛋白质自身磷酸化，涉及的细胞成分主要有核、质膜、胞质等，涉及的分子功能有蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性和蛋白结合。

2.7 KEGG富集分析结果将交集基因及其logFC值导入微生信在线作图软件进行KEGG富集分析，获得按P Value由小到大排列的前10条富集结果制作的富集气泡图和基因网路图，见图5A，B。主要涉及前列腺癌、黑素瘤、内分泌抵抗、癌症中的蛋白聚糖、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、雌激素信号通路、膀胱癌、化学致癌作用-受体激活、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、胶质瘤等。
目标靶点基因PRKACA涉及的信号通路有内分泌抵抗、癌症中的蛋白聚糖、雌激素信号通路、化学致癌作用-受体激活，其中雌激素信号通路与女性绝经后骨质疏松症的发生最为密切，绘制相应的信号通路图，见图5C。
2.8 分子对接结果将新橙皮苷与目标靶点基因PRKACA对应的蛋白进行分子对接，见图6A，分子与靶点蛋白的最低结合能为-12.05 kJ/mol < 0，说明配体和受体可以自发结合。选择该配体-受体构象及口袋结构绘制对接示意图，见图6B，说明新橙皮苷与PRKACA对应的蛋白之间可以通过氢键结合。

2.9 新橙皮苷对骨髓间充质干细胞成骨分化和目标靶点基因的影响碱性磷酸酶染色结果显示，空白对照组培养3 d时碱性磷酸酶染色呈阴性，培养7 d时呈现阳性；其余3组培养3，7 d时碱性磷酸酶染色均呈阳性，相较于对照组，实验组染色加深，说明新橙皮苷可以显著促进骨髓间充质干细胞成骨分化早期碱性磷酸酶的表达，见图7A-D。
培养21 d的茜素红染色结果显示，空白对照组茜素红染色呈阴性，其余3组茜素红染色呈阳性，并且相较于对照组，实验组茜素红染色明显加深，提示矿化结节明显增多，说明新橙皮苷可以显著促进骨髓间充质干细胞成骨分化的矿化，见图7E，F。
RT-qPCR检测结果显示，与空白对照组比较，对照组培养3，7 d的碱性磷酸酶mRNA表达、培养3，7 d的PRKACA mRNA表达升高(P < 0.001，P < 0.000 1)；与对照组比较，低浓度新橙皮苷组培养3，7 d的碱性磷酸酶mRNA表达升高(P < 0.05，P < 0.000 1)，高浓度新橙皮苷组培养3 d的碱性磷酸酶mRNA表达升高(P < 0.05)，低、高浓度新橙皮苷组培养7 d的骨钙素mRNA表达升高(P < 0.01)，低、高浓度新橙皮苷组培养3 d的PRKACA mRNA表达升高(P < 0.000 1)，见图8。

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引言

骨质疏松症是由多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病，以绝经期妇女和老年人的原发性骨质疏松最为多见，发病率随着年龄的增加逐渐增高，易骨折风险严重影响了患者的生活质量与身心健康[1]。骨质疏松症的发病机制尚未完全明确，目前主要认为是成骨细胞与破骨细胞功能失衡的结果，其中绝经期妇女发生骨质疏松症的机制可能与雌激素剥夺消除了其对破骨细胞活性的抑制有关[2]。因此，进一步了解骨质疏松症的发病机制，研究防治骨质疏松症的方法是目前医学上亟待解决的问题。
新橙皮苷是一种从枳实分离的天然黄酮类化合物，可以改善激素性股骨头坏死[3]，对类风湿性关节炎也有一定的治疗作用[4]，提示该药物在骨骼系统疾病治疗中有着巨大潜力。课题组前期研究发现，新橙皮苷可以延缓去卵巢小鼠的骨丢失，对骨质疏松症具有一定的治疗潜力[5]，但其具体机制仍然有待探究。
生物信息学是一门整合了生物、计算机、信息学工程、数学和统计等多个学科内容的交叉学科，以研究、开发、应用计算工具和方法来获取、存储、可视化和解释医学或生物数据，在揭示疾病与药物的分子机制中具有重要意义。网络药理学融合了生物信息学、计算机科学、药理学和药动学等多学科的技术和内容，通过药物再利用实现精确有效的治疗干预，加快了临床转化[6]。
此次研究通过获得GEO数据库中骨质疏松症的表达谱数据，筛选和分析差异表达基因，借助网络药理学方法得到新橙皮苷对骨质疏松症作用的潜在靶点及其表达数据。对交集的潜在靶点制作蛋白质互作网络(Protein-Protein Interaction Networks，PPI)图，进行基因本体论(Gene Ontology，GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，对关键预测靶点进行分子对接验证。在体外细胞实验中，以不同浓度新橙皮苷处理C57小鼠骨髓间充质干细胞，检测其对于细胞成骨分化和目标靶点基因表达的影响，推测具体作用的生物过程和信号通路。将生物信息学技术与基础实验相结合，能够更好地推断药物作用的可能机制，对未来将新橙皮苷用于临床骨质疏松症患者的诊疗有着重要的意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计生物信息学结合体外细胞实验验证，筛选新橙皮苷治疗骨质疏松症的核心靶点。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2023年4月在广西医科大学再生医学重点实验室进行。
1.3 材料
1.3.1 细胞 C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(广州赛业生物科技有限公司，货号：MUBMX-01001)。
1.3.2 药品与试剂新橙皮苷(成都曼斯特生物科技有限公司，货号：A0033，纯度98.63%)；DMSO(北京索莱宝科技有限公司，货号：D8371)；DMEM培养基(美国Gibco公司，货号：11054-001)；特级胎牛血清(美国Gibco公司，货号：A5669701)；青-链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司，货号：P1400)；成骨诱导分化试剂盒(广州赛业生物科技有限公司，货号：BLDM-03011、FBSSR-01021和MUXMX-04021)；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索莱宝科技有限公司，货号：T1300)；40 g/L多聚甲醛固定液(北京索莱宝科技有限公司，货号：P1110)；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(北京碧云天生物科技有限公司，货号：C3206)；茜素红S染色液(北京碧云天生物科技有限公司，货号：C0148S)；RNA 提取试剂TRIzol® Reagent(美国Thermo公司，货号：15596018CN)；RNA提取辅助试剂RNA Extraction Agent(武汉汇宇诚生物科技有限公司，货号：RHYC10)；反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美国Thermo公司，货号：K1622)；qPCR体系FastStart Universal SYBR® Green Master(ROX)(瑞士Roche公司，货号：04913914001)；特异性基因引物(上海生工生物工程股份有限公司)。
1.3.3 实验仪器生物安全柜(美国Thermo公司)；恒温CO2培养箱(美国Thermo公司)；高速离心机(德国Eppendorf公司)；倒置光学显微镜(德国Leica公司)；BioTek全自动扫描仪(美国BioTek仪器有限公司)；超微量分光光度计(美国Thermo公司)；梯度PCR仪(美国Thermo公司)；荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)。
1.3.4 数据库及软件研究生物信息学部分涉及的数据库及软件作用汇总，见表1。

1.4 方法

1.4.1 数据集获取及差异表达基因的生物信息学筛选与分析在GEO数据库中搜索与骨质疏松症相关的基因芯片[7]，搜索的关键词为“osteoporosis”，筛选条件为“Expression profiling by array”和“Homo sapiens”，获得GPL10332平台上由XIE等[8]提供的芯片数据集GSE230665。在Rstudio软件中，使用BiocManager包中的GEOquery、Biobase、affy包进行差异基因提取和基因ID转换。使用Excel表格筛选差异表达基因，去除重复项，条件为P Value < 0.01，获得符合筛选条件的差异表达基因。使用pheatmap包对P Value由小到大排列的前50个基因进行分析，对各基因的表达值进行log10转换，绘制热图。使用tidyverse和limma包对差异表达基因进行分析，使用经验贝叶斯模型拟合标准误差，fdr进行P值校正，绘制火山图。下载LM22.txt数据集和GSE230665.tsv数据文件并读取基因表达数据，使用CIBERSORT包对基因表达数据进行免疫浸润分析，绘制占比堆叠柱状图。
1.4.2 骨质疏松症相关靶点获取在GeneCards数据库中以“osteoporosis”为检索词[9]，以Relevance score > 1为标准进行筛选，得到骨质疏松症相关的基因靶点信息。在DisGeNET数据库中以“osteoporosis”为检索词[10]，得到骨质疏松症相关的基因靶点信息。将以上2个数据库得到的基因靶点数据进行整合，去重，得到骨质疏松症疾病相关靶点基因。
1.4.3 新橙皮苷相关靶点获取在ChEMBL数据库中以“Neohesperidin”为检索词[11]，得到新橙皮苷相关的蛋白靶点信息，以Organism选项“Homo sapiens”为标准进行筛选，将筛选后的数据导入UniProt数据库匹配相应的基因[12]。在PubChem数据库中以“Neohesperidin”为检索词[13]，得到新橙皮苷的SMILES结构表达式，将该结构表达式导入SwissTargetPrediction数据库中[14]，得到新橙皮苷相关的基因靶点信息。将以上两部分基因靶点数据进行整合，去重，得到新橙皮苷相关靶点基因。
1.4.4 构建韦恩图并获取交集基因通过Venny 2.1.0在线作图工具对GEO芯片数据集GSE230665的差异表达基因、骨质疏松症相关靶点基因、新橙皮苷相关靶点基因三者取交集，并制作韦恩图。使用R语言pheatmap包对交集基因绘制热图。
1.4.5 构建蛋白互作网络将交集基因导入STRING数据库进行分析[15]，将Organism设置为“Homo sapiens”，Settings设为“medium confidence(0.400)”，隐藏无关系的靶点，其他参数保持默认设置，通过Clusters将基因大致分为3组，绘制交集基因PPI网络。获取TSV数据文件并导入Cytoscape 3.9.1软件进行分析，使用CytoHubba插件根据Betweenness值、Closeness值、Degree值进行拓扑分析，分别筛选出前10位核心靶点。汇总每种分析方法的前3位靶点进行进一步研究。
1.4.6 GO富集分析将交集基因导入DAVID数据库进行分析[16]，将Identifier设为“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，species设为“Homo sapiens”，Type选择“Gene List”，进行GO富集分析。使用微生信在线作图网站[17]，对GO富集分析按P Value由小到大排列的前20条富集结果制作富集气泡图进行可视化分析。
1.4.7 KEGG富集分析将交集基因及其logFC值导入微生信在线作图网站进行KEGG富集分析，按P.Value由小到大排列的前10条富集结果制作富集气泡图和基因网路图进行可视化分析，绘制涉及目标靶点基因的最有可能的信号通路图。
1.4.8 分子对接在TCMSP数据库下载新橙皮苷的mol2格式的结构文件[18]。在PDB数据库下载目标靶点基因相应的蛋白结构[19]，使用PyMOL软件对目标蛋白进行去水、去配体等操作。利用AutoDock
Tools 1.5.7软件对目标蛋白进行加氢操作，并将其与新橙皮苷结构式都转换为pdbqt格式，设置Grid Box为整个蛋白分子，运行Genetic Algorithm Parameters进行分子对接，对接成功后，选择分数最高的配体-受体构象绘制对接示意图。
1.4.9 验证新橙皮苷对成骨分化和目标靶点基因的影响复苏骨髓间充质干细胞后接种于DMEM完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青-链霉素)中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。将新橙皮苷完全溶解于含有DMSO的母液中，浓度为100 mmol/L，置于-20 ℃下保存；使用前用DMEM完全培养基将其溶解于所需的工作液中，浓度为1 mmol/L。
实验分组：将骨髓间充质干细胞分4组培养，空白对照组加入DMEM完全培养基，对照组加入成骨诱导液，实验组分别加入含不同浓度新橙皮苷(25，50 μmol/L)的成骨诱导液。
碱性磷酸酶染色：将骨髓间充质干细胞以1×105/孔的密度接种于24孔板，按实验分组处理。间隔72 h采用半换液的方式更换培养基。培养3，7 d后，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，每孔加入碱性磷酸酯酶显色试剂200 µL，放入37 ℃恒温CO2培养箱染色30 min，观察细胞染色达深蓝色即可终止染色。采用BioTek成像系统拍照，利用Image J软件进行定量分析。
茜素红染色：将骨髓间充质干细胞以5×104/孔的密度接种于48孔板，按实验分组处理。间隔72 h采用半换液的方式更换培养基。培养21 d后，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，每孔加入100 µL茜素红染液室温下孵育30 min，观察细胞染色达深红色即可终止染色。采用BioTek成像系统拍照，利用Image J软件进行定量分析。
成骨相关基因与目标靶点基因的检测：将骨髓间充质干细胞以3×105/孔的密度接种于6孔板，按实验分组处理。间隔72 h采用半换液的方式更换培养基。培养3，7 d后，用总RNA提取试剂TRIzol® Reagent提取RNA。提取RNA后用超微量分光光度计测量RNA的浓度及纯度。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit体系反转录成cDNA，使用FastStart Universal SYBR® Green Master(ROX)体系在荧光定量PCR 仪上进行荧光定量PCR，检测成骨相关基因和目标靶点基因mRNA的表达。qPCR反应体系(10 μL/孔)：SYBR GREEN 5 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，cDNA样品(400 ng)+无酶水 3 μL。引物序列见表2。qPCR反应条件设置为95 ℃ 600 s孵育，50个扩增循环(95℃ 15 s变性，60 ℃ 15 s退火，72 ℃ 30 s延伸)，最后熔解冷却。以GAPDH作为内参，计算2-ΔΔCt 值和P值，比较基因的相对表达量。

1.5 主要观察指标差异表达信息的生物信息学分析结果。新橙皮苷对骨髓间充质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶、矿化程度、成骨分化相关基因和预测靶点基因表达的影响。

1.6 统计学分析所有数据采用GraphPad Prism 8.0.2软件包进行统计分析，计量资料满足正态分布则采用x±s表示，偏态分布则以四分位数间距进行描述，采用单因素方差分析(ANOVA)，P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经广西医科大学生物统计学专家审核。

讨论

骨质疏松症是世界性疾病，发病风险与年龄呈正相关。由于女性绝经后雌激素水平的显著下降，大于50岁女性人群原发性骨质疏松症的发病率远高于男性。骨质疏松症的病理生理学基础在于成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的功能失衡，导致进行性骨量减少及骨强度降低，骨小梁破坏，增加了骨折风险，不仅严重影响了患者的生活，还给家庭和社会带来了沉重的经济负担。目前临床治疗骨质疏松症的主要药物有雌激素、双膦酸盐、甲状旁腺激素相关肽类似物、钙补充剂和维生素D等[20]，这些药物具有一定不良反应，如雌激素替代疗法会增加患者发生子宫内膜癌和乳腺癌的风险[21]；双膦酸盐吸收不良，容易引发恶心、呕吐等胃肠道反应[22]；
甲状旁腺激素容易引起高钙血症，长期应用则会减少皮质骨量[23]。目前有研究表明，中草药及提取物中的活性化学成分具有被开发为新型抗骨质疏松药物的巨大潜力，这些活性成分主要包括黄酮、皂苷、木质素和香豆素[24]。研究新的安全有效的骨质疏松症治疗药物是现代医学界追求的目标。因此，此次研究基于生物信息学筛选与新橙皮苷治疗骨质疏松症相关的关键基因，再用体外细胞实验加以验证，对验证新橙皮苷治疗骨质疏松症的能力和寻找治疗骨质疏松症的潜在靶点具有重要意义。
此次研究从GEO数据库获得骨质疏松症相关的9 253条基因表达数据，从GeneCards和DisGeNET数据库获得骨质疏松症的相关靶点基因2 161个，从ChEMBL和PubChem数据库获得新橙皮苷的相关靶点基因326个，三者取交集获得交集基因53个。使用String数据库构建交集基因的PPI网络，筛选核心靶点基因，进一步研究发现，根据Degree值、Closeness值、Betweenness值排序的前3位基因汇总可以得到4个核心靶点基因——EGFR、MAPK3、BCL2、PRKACA。LIU等[25]通过细胞实验证明，骨内膜骨祖细胞中表皮生长因子受体信号通路的下调可能与衰老过程中的皮质骨变性的机制有关。XIAO等[26]通过对人循环B细胞的体内全基因组表达研究提出，B细胞中MAPK3的下调可以调节导致破骨细胞生成增加或成骨细胞生成减少的因子的分泌。而HU等[27]通过实验验证了辣木叶可以通过调节MAPK信号达到抗骨质疏松症的效果。VAKILI等[28]通过细胞实验和大鼠摘除卵巢模型证明，槲皮素和维生素E通过上调BCL2表达显著改善了骨质疏松症。PRKACA与骨质疏松症的关系目前尚未有相关文献报道，因此研究考虑将PRKACA作为进一步研究的目标靶点基因。运用AutoDock软件对新橙皮苷与PRKACA对应的蛋白进行分子对接验证，发现两者可以通过氢键自发结合，新橙皮苷是否可以通过调节PRKACA的表达来治疗骨质疏松症，值得继续深入研究。
GO富集分析结果显示，新橙皮苷治疗骨质疏松症的潜在靶点的作用主要涉及细胞对活性氧的反应、正向调节蛋白磷酸化和正向调节细胞增殖等生物过程。氧化应激诱导的活性氧可导致骨细胞和成骨细胞凋亡，抑制骨矿化和成骨，并与破骨细胞形成不平衡结合，导致骨丢失增强，进而引起骨质疏松症的进展[29]。成熟骨细胞受到基础或增强氧化应激水平的影响更大，这可以解释为什么老年人更容易遭受骨折[30]。降低活性氧水平对平衡细胞分化、自我再生和增殖、维持骨稳态至关重要[31]。目前研究发现，富马酸二甲酯[32]、黄芩新素Ⅱ等可以通过增强抗氧化作用来衰减活性氧信号传导[33]，从而抑制破骨细胞；生物制剂如活性氧清除水凝胶在骨质疏松症中调节干细胞行为，促进骨质愈合[34]。磷酸化是控制许多蛋白质核运输的主要机制(包括转录因子)，对蛋白质功能的正常发挥起着重要的调节作用。骨细胞与成骨细胞的增殖对治疗骨质疏松症的作用十分关键。目标靶点基因PRKACA涉及的生物过程主要有蛋白质磷酸化和蛋白质自身磷酸化，PRKACA编码蛋白激酶A催化亚基C的主要亚型Cα，在多数组织中表达[35]，其在骨骼系统疾病中的作用有待深入研究。
信号通路预测是生物信息学分析不可或缺的关键部分。KEGG富集分析结果显示，新橙皮苷治疗骨质疏松症涉及前列腺癌、黑素瘤、内分泌抵抗、癌症中的蛋白聚糖、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性、雌激素信号通路、膀胱癌、化学致癌作用-受体激活、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、胶质瘤等许多通路。其中，与调控骨平衡关系比较密切的通路有雌激素信号通路(第6位)，甲状腺激素信号通路(第13位)，Ras信号通路(第17位)，MAPK信号通路(第28位)，甲状旁腺激素的合成、分泌及作用(第62位)，生长激素的合成、分泌和作用(第68位)，胰岛素信号通路(第72位)，钙信号通路(第82位)，cAMP信号通路(第92位)，这些通路中都有PRKACA的参与。成骨重要相关基因RUNX2下游的靶基因有催化雄激素合成雌激素的芳香化酶，骨中雌激素的部分产生可能是由于RUNX2介导的芳香化酶基因表达[36]。雌激素与雌激素受体结合促进骨保护素的表达，并且抑制核因子κB受体活化因子配体的作用，从而抑制破骨细胞的形成和骨吸收活性，与女性绝经后骨质疏松症的发生最为密切[37]。雌激素信号通路涉及上述4个核心靶点基因EGFR、MAPK3、BCL2、PRKACA，故推测新橙皮苷可能通过作用于雌激素信号通路上EGFR、MAPK3、BCL2、PRKACA等靶点发挥抗骨质疏松的作用。
大部分雌激素介导的信号通路依赖雌激素受体，在细胞核或质膜上启动，但也存在不依赖雌激素受体的机制，通过调节酶活性或与非性类固醇激素核受体相互作用来启动。其中，膜相关的内质网通路可以通过激活不同的蛋白激酶级联来介导，如MAPK/ERK、PI3K/AKT、cAMP、PKA、PKC和酪氨酸激酶通路[38]。雌激素受体α在骨和生长板软骨的调节中发挥作用，成骨细胞祖细胞中的雌激素受体α信号通路可以刺激皮质骨积累[39]，PKA可以磷酸化雌激素受体α的DNA结合域Ser 236并调节受体二聚体[40]。HU等[41]通过网络药理学结合细胞、动物实验证明，二氢黄酮苷可能通过雌激素受体1激活雌激素信号通路，抑制促炎细胞因子和降低氧化应激，促进斑马鱼的成骨。NIU等[42]通过实验探究了川续断皂苷Ⅵ通过雌激素信号通路诱导人脐带间充质干细胞成骨分化的能力。KOBYLKA等[43]通过研究提出，白藜芦醇类似物可以作为选择性雌激素信号通路调节物，但在低剂量下可能促进癌细胞增殖。
在KEGG富集结果分析时还发现了一些与骨骼系统关系比较密切的通路。甲状腺激素与Wnt/β-Catenin信号通路相互作用，促进生长板软骨细胞的终末分化[44]。Ras/MAPK信号通路在骨稳态中起着重要作用，该信号通路的过度活跃可能导致破骨细胞成熟和骨形成缺陷[45]。甲状旁腺激素可以激活Wnt、cAMP-PKA、cAMP-PKC和RANKL-RANK-OPG等信号通路，在骨缺损修复中具有很大的应用潜力[46]。生长激素/胰岛素的作用在人类青春期达到峰值，并且通过刺激细胞外基质的产生和增加骨密度来调节骨形成[47]。
钙信号通路则与老年人骨密度和轻度认知障碍密切相关[48]。这些通路可能在新橙皮苷治疗骨质疏松症过程中发挥了一定作用，值得进一步探究。
骨髓间充质干细胞因具有多向分化潜能、骨髓支持能力、抗炎和免疫调节特性成为了骨组织工程和再生医学研究的热点，研究方向主要有直接应用、外泌体作用或与生物材料/生物活性分子结合使用。此次研究通过碱性磷酸酶和茜素红染色发现，新橙皮苷具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化和矿化的作用。说明新橙皮苷不仅可以作用于骨祖细胞直接促进成骨，还可以结合骨髓间充质干细胞更好地发挥治疗骨质疏松症的潜力。
此次研究筛选出了4个新橙皮苷治疗骨质疏松症作用评分最高的基因，结合骨髓间充质干细胞的培养及成骨诱导，对成骨相关基因碱性磷酸酶、骨钙素及目标靶点基因Prkaca的表达进行了RT-qPCR验证。碱性磷酸酶在成骨分化早期产生，引发骨细胞的钙沉积，可以直观反映骨的活跃程度[49]。骨钙素是最丰富的成骨细胞特异性非胶原蛋白，是骨形成的决定因素[50]。PRKACA基因在关于骨质疏松症的既往研究中从未涉及，此次研究对PRKACA基因的筛选及验证可能为骨质疏松症的靶向治疗提供新的见解。该研究也存在不足之处，未对PRKACA基因进行沉默/过表达以实现进一步验证，虽进行了体外细胞实验以验证PRKACA基因的表达，但体外实验存在局限性，之后应通过体内实验进一步探究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

新橙皮苷治疗骨质疏松症的靶点及对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用

Target of neohesperidin in treatment of osteoporosis and its effect on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

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