2.1   兔骨髓间充质干细胞的形态   首次换液后可见细胞呈集落样生长，继续培养3 d后可见细胞明显增多，细胞数量越加密集，呈纺锤形或梭形，培养至第7天后细胞继续增多，更加密集生长。经过传代处理后，细胞基本长满，见图1。
2.2   兔骨髓间充质干细胞多向分化能力鉴定及免疫荧光鉴定细胞表型   诱导骨髓间充质干细胞向成骨、成软骨、成脂分化，采用茜素红、阿利新蓝、油红O染色鉴定骨髓间充质干细胞的多向分化能力，茜素红染色可见红色钙结节；阿利新蓝染色可见许多蓝色的颗粒，细胞质染成红色，聚集在一起，形成细胞外基质；油红O染色可见大量的褐色沉着，见图2。免疫荧光染色显示：骨髓间充质干细胞高表达CD29(+)、CD44(+)、CD90(+)，不表达CD34(-)、HLA-DR(-)，见图3。
2.3   NGF慢病毒转染构建稳定细胞株   通过Western blot检测验证转染效率，与NC-NGF组相比，oe-NGF组NGF表达上调(P < 0.05)，见图4。
2.4   过表达NGF对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响   两组骨髓间充质干细胞增殖活性均显著升高，且oe-NGF组与NC-NGF组相比无显著差异，说明NGF对骨髓间充质干细胞的增殖活性无显著影响，见图5。
2.5   过表达NGF对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响   细胞划痕实验显示：培养24 h时两组骨髓间充质干细胞较0 h发生迁移，但并无明显区别；培养48 h时oe-NGF组无细胞区域基本被迁移的细胞填满，而NC-NGF组虽较24 h迁移的细胞增多，但较oe-NGF组无细胞区域较大，说明NGF可以促进骨髓间充质干细胞的迁移，见图6。
2.6   过表达NGF对骨髓间充质干细胞成骨及成软骨相关蛋白表达的影响   Western blot检测成软骨分化相关蛋白Ⅱ型胶原、SOX9和肥大分化相关蛋白Ⅹ型胶原、RUNX2的表达，与NC-NGF组相比，oe-NGF组成软骨相关蛋白Ⅱ型胶原、SOX9表达上调(P < 0.05)，肥大分化相关蛋白Ⅹ型胶原、RUNX2表达下调(P < 0.05)，见图7。
2.7   过表达NGF减弱白细胞介素1β对骨髓间充质干细胞软骨表型稳定的影响   Western blot检测成软骨分化相关蛋白Ⅱ型胶原、Sox9和肥大分化相关蛋白Ⅹ型胶原、Runx2的表达，与NC-NGF组相比，NC-NGF+白细胞介素1β组成软骨相关蛋白Ⅱ型胶原、SOX9表达下调(P < 0.05)，肥大分化相关蛋白Ⅹ型胶原、RUNX2表达上调(P < 0.05)；与NC-NGF+白细胞介素1β组相比，oe-NGF+白细胞介素1β组成软骨相关蛋白Ⅱ型胶原、SOX9表达上调(P < 0.05)，肥大相关蛋白Ⅹ型胶原、RUNX2表达下调(P < 0.05)，见图8。
2.8   过表达NGF减弱白细胞介素1β引起骨髓间充质干细胞的肥大分化   与NC-NGF组相比，oe-NGF组骨髓间充质干细胞的钙含量降低(P < 0.05)，表明NGF可以抑制骨髓间充质干细胞的肥大分化；与NC-NGF组相比，NC-NGF+白细胞介素1β组骨髓间充质干细胞的钙含量升高(P < 0.05)；与NC-NGF+白细胞介素1β组相比，oe-NGF+白细胞介素1β组骨髓间充质干细胞的钙含量下降(P < 0.05)，表明NGF可以减弱白细胞介素1β引起骨髓间充质干细胞的肥大分化，见图9。

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近年来骨关节炎发病率逐年上升，究其原因是包括关节损伤、肥胖等的患病率提高[1-2]。骨关节炎的特征包括滑膜炎、软骨下骨重塑和骨赘形成，最突出的是进行性软骨退化[3-4]。此外，骨关节炎作为一种无菌性炎症在发生发展过程中也会产生许多促炎因子，其中以白细胞介素1β为主，这些促炎因子会加速骨关节炎的进展，促使软骨细胞的肥大分化并形成矿化区[5]。由于缺血、低氧等恶劣生存环境，关节软骨的再生潜力较低[6]，故各种危险因素引起的损伤更易导致软骨结构和功能的变化。临床上，创伤及退变性关节软骨损伤可以通过止痛及抗炎等药物治疗或者微骨折术[7-8]、骨软骨移植[9]、自体软骨细胞移植等侵入性治疗来延缓人工关节置换的时间[10]。然而，这些方法修复的都是机械性较差的纤维软骨，其在组织学上与透明软骨不同，且存在移植组织来源有限、免疫排斥等问题未能获得满意的治疗效果，限制了其应用，而组织工程的出现为软骨再生提供了可行的方法。骨髓间充质干细胞具有多谱系分化潜力和免疫调节特性，成为骨组织工程和再生医学的重要种子细胞[11]。
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经营养因子家族的成员之一，因其在神经系统胚胎发育和神经元细胞存活/分化中的关键作用而受到广泛关注[12]。NGF在神经系统方面的研究较为透彻，但在骨修复中的应用未得到充分研究[13]，目前研究发现NGF及其受体参与调节骨髓间充质干细胞的增殖、分化和血管生成等生物学行 为[14-16]，且部分接受抗NGF治疗的骨关节炎患者表现出快速的关节破坏，导致关节置换时间早于预期，也增加了发生快速进行性骨关节炎的风险[17]，说明NGF在维持关节软骨损伤修复的动态平衡中起重要作用。CHARTIER等[18]研究表明位于软骨下骨/关节软骨界面的细胞中NGF免疫染色强阳性，并且可以释放NGF，可延缓软骨随着骨关节炎疾病进展而导致的弹性和强度下降。总之，NGF在许多方面发挥重要作用，如神经再生[19]、改善疼痛[20]，亦可成为骨关节炎及其他骨相关疾病的潜在治疗靶点[21-22]。该研究旨在探讨NGF对骨髓间充质干细胞软骨分化、迁移的作用，以期望为NGF应用于组织工程奠定基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   体外细胞学实验。
1.2   时间及地点   实验于2022年3月至2023年3月在遵义医科大学第三附属医院中心实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   新西兰大白兔9只，3月龄左右，雌雄不限，体质量2.0-2.5 kg，购自重庆康格生物科技有限公司，实验动物合格证号：SCXK(黔)2021-0001，饲养于遵义医科大学第三附属医院中心实验室动物中心，通风良好，自由饮水，定期饲养。
该研究方案已通过遵义市第一人民医院实验动物伦理委员会审核[伦审(2022)-2-12号]。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   实验试剂和仪器   CO2恒温培养箱(Panasonic公司)；DMEM低糖培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Biological Industries)；T25培养瓶、15 mL离心管、50 mL离心管(NEST)；成软骨诱导培养基(Sciencell公司)；成骨诱导培养基、成脂诱导培养基(Procell公司)；细胞计数板(Thermo Fisher Scientific)；反转录试剂盒(Takara公司)；CCK-8试剂盒、胰酶、茜素红S染色液、油红O染色液、阿利新蓝染色试剂盒、高效RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、DAPI溶液、氯化十六烷基吡啶-水合物、嘌呤霉素(Solarbio公司)；白细胞介素1β(义翘公司)；PAGE凝胶快速制备试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、双色预染蛋白Marker(10-250 kD)、Omni-ECL™超灵敏化学发光检测试剂盒(飞克级)、无蛋白快速封闭液(5×)(雅酶生物公司)；GAPDH 抗体(NO.GTX100118，GeneTex公司)；Ⅱ型胶原抗体(NO.28459-1-AP，Proteintech公司)；抗RUNX2抗体、抗Ⅹ型胶原抗体、抗SOX9抗体、抗NGF抗体(HUABIO公司，批号分别为NO. ET1612-47，NO. ET1702-13，NO.ET1611-56，NO. ET1606-29)；Goat Anti-Rabbit IgG-H&L(HRP)(欣博盛生物公司)；PVDF膜(0.45 µm，Millipore公司)；PrimeScript RT Reagent Kit(Takara公司)；CD29抗体、CD44抗体、CD90抗体、CD34抗体、HLA-DR抗体(Bioss公司)；Coralite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Proteintech公司)。
1.4   实验方法
1.4.1   骨髓间充质干细胞分离与培养   取新西兰大白兔9只，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，待麻醉成功后，采取仰卧位固定四肢，兔膝关节部位备皮，消毒，铺治疗巾，用无菌骨穿针接20 mL注射器，预先吸取含肝素、体积分数10%胎牛血清的DMEM低糖培养基5 mL，然后抽取双侧股骨骨髓5 mL，上下颠倒轻轻摇匀后注入含4 mL DMEM低糖培养基的培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中静置培养，2 d后首次半换液，以后每两三天换液1次，在显微镜下观察细胞生长状态。待细胞长满瓶底80%-90%，用0.25%胰酶消化细胞，以1∶2比例传代处理，记为第1代，依次类推。
1.4.2   骨髓间充质干细胞多向分化潜能鉴定及免疫荧光鉴定细胞表型   取第3代生长状态良好的骨髓间充质干细胞，PBS洗涤2次，加入1.0-2.0 mL 0.25%胰酶进行消化处理，将消化下来的细胞转移至15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM低糖培养基制成细胞悬液，调整细胞浓度为2×106 L-1，接种于6孔板中，每孔2 mL细胞悬液，待细胞融合达孔底80%-90%时，分别加入不同的培养基：成骨诱导培养基、成软骨诱导培养基、成脂诱导培养基，连续培养14 d后，分别进行茜素红染色、阿利新蓝染色、油红O染色，各组染色方法根据染色试剂盒说明书进行，然后于显微镜下观察并拍照。
取第3代生长状态良好的骨髓间充质干细胞，胰酶消化处理后，以5×103/孔密度接种至6孔板中培养，置于37 ℃、体积分数5% CO2孵箱，待细胞贴壁后取出6孔板，通过免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞表面分子CD29、CD44、CD90、CD34的表达，具体染色步骤如下：用40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，每孔加入1 mL免疫染色通透液室温通透10 min，PBS洗涤，每孔加入1 mL 5%BSA封闭30 min；加入一抗(CD29、CD44、CD90、CD34、HLA-DR，稀释比例均为1∶200)，4 ℃冰箱孵育过夜，加入二抗[Coralite488-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)，1∶200]，室温避光孵育1 h，DAPI溶液复染10 min，PBS洗涤，滴加抗荧光淬灭剂封固，荧光显微镜下观察。
1.4.3   细胞转染   NGF过表达慢病毒载体委托贵州禾晋生物科技有限公司构建及包装，分别命名为NC-NGF(对照组，空载病毒)、oe-NGF。取对数生长期且3代及以上的骨髓间充质干细胞，细胞达到约80%汇合度时，用胰酶消化，离心弃上清，加1 mL细胞培养基重悬并计数，最终调整细胞浓度至2×108 L-1，然后每孔加2 mL含血清低糖培养基和4.5 μL Polybrene，将孔板置于37 ℃、体积分数5% CO2孵箱30 min；设置不同感染复数值：20，30，40，每个感染复数值设3个复孔，计算所需病毒体积，公式为病毒体积(mL)=细胞数×感染复数值/病毒滴度，根据计算出的体积添加病毒，混匀室温放置15 min后置于细胞孵箱中培养；24 h后贴壁细胞更换含血清低糖培养基，培养两三天后，在荧光显微镜下观察转染细胞情况，得出该病毒的最佳感染复数值为40，故后续转染细胞均选用感染复数=40进行转染。将嘌呤霉素设置为5个浓度梯度，分别为1，2，3，4，5 μg/mL，每组设置3个复孔。将感染慢病毒的细胞重悬混匀，将细胞浓度调整为2×108 L-1，每孔100 μL细胞悬液，向每孔加入不同浓度梯度的含嘌呤霉素的培养基2 mL，加入嘌呤霉素1-3 d后观察不同浓度梯度的细胞生长状态，当观察到大部分未转染慢病毒的细胞被杀死而对转入慢病毒的细胞无影响时，此时的嘌呤霉素质量浓度为筛选出的最佳质量浓度；该实验的最佳嘌呤霉素质量浓度为2 μg/mL。构建稳转细胞株后，选取细胞状态良好且3代及以上的稳转细胞用于后续实验。
1.4.4   CCK-8实验   选取细胞状态良好且3代及以上的稳转细胞进行消化，调整细胞浓度为5×107 L-1，按照5×103/孔的细胞密度接种到96孔板，放于CO2孵箱中，在接种后的1，2，3，4，5 d取出相应的96孔板，每孔加入10 μL CCK-8试剂，孵育1.5 h，在酶标仪450 nm处检测吸光度值，每组细胞至少设置3个复孔。
1.4.5   划痕实验   选取细胞状态良好且3代及以上的稳转细胞进行消化，以1×105/孔的细胞密度接种到6孔板，细胞达到约80%汇合度，使用无菌移液器10 μL吸头划出无细胞区域，然后细胞用无血清低糖培养基进一步培养，在倒置光学显微镜下拍摄培养24，48 h的细胞图像。
1.4.6   茜素红染色及钙含量分析   选取细胞状态良好且3代及以上的稳转细胞，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，1%茜素红室温染色1 h，PBS孵育15 min，显微镜下拍照，弃上清，PBS洗3遍，加入氯化十六烷基1 mL室温孵育30 min，吸取上清，使用酶标仪检测波长562 nm处吸光度值，用氯化十六烷基溶液调零，同时测定未加茜素红的单纯细胞上清吸光度值，每个样本重复3次。最终样本测定吸光度值=样本吸光度值-单纯细胞上清吸光度值。
1.4.7   白细胞介素1β干预   选取细胞状态良好且3代及以上的稳转细胞，分为NC-NGF组，NC-NGF+白细胞介素1β组，oe-NGF+白细胞介素1β组，NC-NGF组骨髓间充质干细胞正常用含血清低糖培养基培养14 d，NC-NGF+白细胞介素1β组和oe-NGF+白细胞介素1β组骨髓间充质干细胞用含0.1 ng/mL白细胞介素1β的低糖培养基培养14 d。
1.4.8   Western blot检测相关蛋白表达   按照总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入1/4蛋白体积的5×蛋白上样缓冲液，煮沸变性10 min，待冷却后放入-20 ℃保存备用。Western blot步骤：制备SDS-PAGE凝胶，加入蛋白样品和Marker后，将电压调至70 V恒压电泳，待蛋白跑最下方时停止电泳，取出玻板，根据目的蛋白分子质量大小进行切胶，裁剪好合适大小PVDF膜，放入甲醇中浸泡3-5 min，按照“黑胶白膜”的顺序放置凝胶和PVDF膜，制备类似“三明治”结构，放入转膜槽中，倒满电转液，盖好盖子将电流调至295 mA，转膜50 min。转膜结束后将PVDF膜放入封闭液中室温封闭1 h，TBST洗涤，加入一抗[GAPDH (1∶1 000)、Ⅱ型胶原 (1∶1 000)、SOX9 (1∶500)、Ⅹ型胶原(1∶1 000)、RUNX2(1∶1 000)、NGF(1∶1 000)]，4 ℃冰箱孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗[Goat Anti-Rabbit lgG-H&L(HRP) 1∶6 000]室温孵育1 h，TBST洗涤，ECL化学发光液浸泡PVDF膜后于凝胶成像仪下显影曝光。对目的蛋白的灰度值进行统计分析，计算目的蛋白的相对表达量。
1.5   主要观察指标   ①过表达NGF对骨髓间充质干细胞增殖、迁移的影响；②过表达NGF对骨髓间充质干细胞成骨及成软骨相关蛋白表达的影响；③促炎因子环境下过表达NGF对骨髓间充质干细胞成骨及成软骨相关蛋白表达的影响。

1.6   统计学分析   应用SPSS 29.0统计软件进行数据处理。数值变量资料用x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法经过遵义医科大学相关统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

间充质干细胞的增殖、多向分化、迁移和免疫调节活性等生物学特性因体内环境以及分离和扩增方法而异，不同组织分离的间充质干细胞之间也有所不同[23]。此外，第8-15代间充质干细胞开始退化并显示出一些细胞衰老迹象，例如细胞体积较大、汇合度降低、增殖速度较慢、多向分化潜力减弱以及分子谱发生变化[24]。因此间充质干细胞来源的软骨细胞易肥大分化被认为是阻碍软骨修复的主要原因[25-26]。
间充质干细胞成软骨分化过程涉及多种细胞因子，SOX9是软骨细胞中的关键转录因子，贯穿软骨细胞发育的各个阶段，有研究表明SOX9在骨关节炎中下调，也会随年龄增长显著降低，而SOX9缺乏不会干扰关节形成和发展的过程，但在承重区域，它会在祖细胞阶段引起软骨细胞到成骨细胞的转化[27-28]。软骨细胞外基质为软骨细胞提供物理支撑并调节许多细胞过程，它的降解是骨关节炎软骨组织丧失的基础[29]，软骨细胞外基质破坏和异常稳态作为软骨再生的治疗靶点越来越受到关注。Ⅱ型胶原不仅是软骨细胞外基质的重要有机成分之一[30]，也是构成软骨细胞外基质的结构框架[31]。综上所述，SOX9和Ⅱ型胶原对于软骨细胞的表型稳定起着关键作用。与之相反的是间充质干细胞肥大分化，不仅会破坏软骨细胞表型的稳定，也会加速软骨细胞矿化和程序性死亡[32]，并且不会产生透明软骨(关节软骨的主要类型)[33]，多项研究表明，RUNX2在间充质干细胞肥大分化过程中表达上调，RUNX2的表达与肥大分化指标Ⅹ型胶原的表达增加密切相关，二者使关节软骨中的蛋白聚糖减少，钙化软骨区扩大[34]。在该研究中，慢病毒转染过表达NGF后SOX9和Ⅱ型胶原表达上调，而RUNX2和Ⅹ型胶原表达降低，表明NGF能维持骨髓间充质干细胞软骨表型的稳定，抑制骨髓间充质干细胞的肥大分化，体现了对骨髓间充质干细胞积极成软骨分化的作用。
有研究指出，促炎细胞因子白细胞介素1β在骨关节炎中大量表达[35]，白细胞介素1β在体外和体内影响软骨降解酶的产生，抑制细胞外基质的合成，并刺激骨关节炎组织中其他促炎细胞因子的表达[36]，从而加速骨关节炎的发展。另外，白细胞介素1β刺激可诱导骨关节炎软骨细胞进行性增殖和肥大[37]，促进软骨细胞的矿化和分解代谢[38]。该研究结果显示，加入白细胞介素1β后，肥大分化相关蛋白(Ⅹ型胶原、RUNX2)上调，成软骨相关蛋白(Ⅱ型胶原、SOX9)下调，而过表达NGF后可以减弱由白细胞介素1β引起的肥大相关蛋白上调和成软骨相关蛋白下调，表明NGF可以减轻关节软骨退化和软骨下骨破坏，更好地保护关节软骨。
越来越多的研究表明，内源性间充质干细胞从骨髓迁移到外周血和外周组织，以应对损伤或各种病理状况，并且损伤组织的再生能力取决于迁移细胞的再生能力[39-40]。该研究发现与NC-NGF组相比，oe-NGF组48 h的迁移细胞明显增多，这表明NGF可以促进骨髓间充质干细胞的迁移。
综上所述，神经生长因子可以促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化，增强迁移能力，并且减弱由白细胞介素1β引起的关节软骨退化和破坏，抑制骨髓间充质干细胞的肥大分化。NGF可作为组织工程中的生长因子并期望应用于软骨损伤修复。


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文题释义：

神经生长因子：由Rita Levi-Montalcini首次发现，是一种诱导神经生长的蛋白质，能调节间充质干细胞的增殖、分化等生物学行为。#br#

骨髓间充质干细胞：属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，具有强大的增殖能力和多向分化潜能。

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近年来骨关节炎的发病率逐渐增加，骨关节炎最突出的特征就是进行性软骨退化。关节软骨的主要构成是透明软骨，其无淋巴、神经、血管分布导致再生潜力弱，损伤后难以修复。临床上，多用抗炎止痛和侵入性的方法来延缓骨关节炎的发展，但效果和应用有限，随着交叉学科的飞速发展，组织工程给软骨损伤治疗带来了新的希望。在组织工程中，运用间充质干细胞可分化为软骨细胞特点，修复并替代损伤的软骨，被认为是修复软骨损伤最有潜力的治疗方法之一，但间充质干细胞来源的软骨细胞易肥大分化被认为是阻碍软骨修复的主要原因。目前研究发现神经生长因子及其受体参与调节骨髓间充质干细胞的增殖、分化和血管生成等生物学行为，可成为骨关节炎及其他骨相关疾病的潜在治疗靶点。

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