2.1   血小板临床应用的发展   1842年，Donne在血细胞中发现了除了红细胞和白细胞以外的结构[6]。Julius Bizzozero将这种新结构命名为“血小板”，1882年，他发现血小板具有使血液凝固的作用[7]。20世纪初，临床医生发现血小板输入可治疗血小板减少症，并在外科手术中通过补充血小板浓缩物预防患者出血。1954年，Kingsley等首次使用“PRP”一词代表用于输注的血小板浓缩物[8]。在20世纪60年代，第一个血库PRP制剂出现，并在20世纪70年代开始流行[9]。1972年，Matras首次在外科手术过程中使用血小板作为密封剂来建立血液稳态[10]。20世纪80年代，研究者发现血小板不止在血液系统里发挥凝血相关的作用，还能够释放多种生物活性分子修复受损组织，先后发现了表皮生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子[11]。至此，血小板促进组织修复的作用逐渐引起关注。1986年，Knighton等是第一批描述血小板浓缩制备方案并将其命名为自体血小板衍生的伤口愈合因子的科学家[12]。自20世纪80 年代末以来，PRP在再生医学领域开始广泛应用，普通外科、心脏外科、颌面外科、骨科、美容皮肤科、妇科、泌尿科以及眼科等许多医学领域均开展了自体PRP的应用[9]。由于自体血小板的应用受到患者诸多个人条件的限制，国内外研究者开始尝试异体血小板的非输注性应用研究，国内异体血小板的拓展应用研究最早可追溯到2008年，广州军区广州总医院单桂秋主任开展了异体血小板凝胶对难治性糖尿病足溃疡的治疗研究[13]。总之，在PRP 大约70年的应用历史中，异体PRP的应用研究至少有15年了，在临床的非输注性应用特别是针对难治性皮肤损伤修复是可行和有效的。
2.2   WBPC在慢性难愈性创面治疗中的临床应用   关于慢性难愈性创面目前尚无统一的定义，国际创伤愈合学会将其定义为无法通过正常、有序、及时修复而造成的或经修复但无法恢复解剖及功能状态完整的创面[14]。
伤口愈合是一个动态过程，包括止血阶段、炎症反应阶段、增殖阶段(血管生成和细胞外基质形成)以及重构阶段。与愈合的伤口相比，慢性伤口中基质金属蛋白酶浓度明显更高[15]。在这种情况下，同源异体PRP被认为是一种治疗选择[16]。尽管对PRP促进伤口愈合的分子基础还不完全清楚，但一些临床证据表明，这种策略可以促进伤口修复[17-26]，见表1。在慢性难愈性创面的治疗中，WBPC主要以激活后的凝胶形式应用，在凝血酶和/或氯化钙/葡萄糖酸钙等激活剂的作用下血小板被激活，血小板的α颗粒与血小板膜融合，释放出多种促生长细胞因子，对表达PRP中相关生长因子受体的细胞具有一定的调控作用：激活细胞内信号蛋白，引起基因序列的表达，指导细胞增殖、基质形成，促进组织修复与再生。同时血浆中可溶性的纤维蛋白原转化为不可溶的纤维蛋白，形成富含生长因子的纤维蛋白网状凝胶，不仅可粘合组织缺损，还可使血小板在局部长时间缓慢释放生长因子，更好地发挥组织修复作用。研究认为包括糖尿病足创面、压疮、下肢静脉溃疡等难愈性皮肤损伤，应用异体WBPC凝胶治疗后，溃疡面积缩小、伤口愈合时间缩短，特别是在使用的前2周，加速肉芽组织形成，促愈合效果显著。一项关于“异体和自体PRP对糖尿病性下肢溃疡治疗的比较研究”认为，异体WBPC可以替代自体PRP作为糖尿病患者溃疡创面的治疗方案[19]。在10例异体WBPC作为慢性难愈性创面干预措施的文献中，未见明显不良反应(发热、水肿、疼痛、皮肤瘙痒、皮疹等)的报告，其中1例开展了血小板抗体检测，未检出血小板抗体[19]，异体WBPC的免疫原性可以忽略不计，原因如下：首先，用于伤口愈合的异体WBPC是一种外用产品，不进入血液循环系统，凝胶中的HLA和HPA抗原与患者接触面积有限；第二，血小板活化后形成凝胶，活化血小板的表面抗原结构和表达水平均发生改变，免疫原性降低；第三，PRP可以在几周内被完全降解和吸收，从而消除了慢性免疫反应的可能性。刘鸿雁等[17-18]在“同种异体富血小板对糖尿病足等慢性难愈合创面的研究”指出，促愈合机制可能与降低白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、C-反应蛋白等炎症因子水平并提高血清透明质酸、血管内皮生长因子、血清促红细胞生成素及转化生长因子β1表达水平有关。但由于病例数量较少，WBPC制备参数、血小板的浓度以及WBPC使用量未详尽描述，未来还需要开展大规模的随机对照试验，更进一步确定异体WBPC对慢性难愈性创面的利弊。




2.3   WBPC的制备方法   输血性血小板制品仅可由血液中心、血站或单采血浆站等采供血机构采集供应，包括APC和WBPC，APC是使用血细胞分离机，在全封闭的条件下自动将符合要求的献血者血液中的血小板成分分离并悬浮于一定量血浆中的一种单采成分血。WBPC是使用血袋制备，将采集后置于室温保存和运输的全血于采集后6 h内，或采集后置于20-24 ℃保存和运输的全血于24 h内，在室温条件下将血小板分离出，并悬浮于一定量血浆内的成分血，包括白膜法和PRP法，见图3，4。依据《血站技术操作规程》，两者的主要区别在于轻离心和重离心的先后顺序，将采集后于室温保存和运输6 h内的全血或于20-24 ℃保存和运输24 h内的全血，先重离心转移出适量血浆和白膜层，再轻离心获得上层PRP的方法即为白膜法，而PRP法是先轻离心获得上层PRP，再重离心去除上层部分乏血小板血浆的方法。在WBPC的制备研究中，白膜法因较高的血小板质量、较低的白细胞残余率、较低的血小板活化率而备受国内外研究者的青睐，2005年欧洲大部分国家就已经采用白膜法替代PRP法制备WBPC[27]。目前，除了美国采用PRP法制备WBPC外，大多数国家都采用白膜法制备WBPC[28]。国内采供血机构制备WBPC也从PRP法逐渐向白膜法过渡，在2018年，中国向临床供应WBPC的55家采供血机构中，大多数血站以白膜法为主[29]，但由于不同采供血机构制备WBPC所使用的仪器设备、离心条件、装罐方法、血袋结构不同，WBPC的质量存在很大的差异。WBPC的质量对慢性难愈性创面的临床疗效具有一定的影响，下面主要从中国采供血机构制备WBPC的实际情况，论述白膜法制备WBPC的影响因素。



2.4   白膜法制备WBPC的影响因素   
2.4.1   WBPC制备原料的保存条件   WBPC的质量(血小板浓度和活性)受多种因素影响，其中原料全血的保存和运输条件是非常关键的一个环节。室温保存和运输的全血于采集后6 h内，或采集后置于20-24 ℃保存和运输的全血于24 h内均可用于制备WBPC。但采集的全血当天制备WBPC与全血过夜后再制备WBPC，血小板的数量高低不一，绝大部分研究认为全血经室温放置过夜更易分离血小板，全血室温过夜制备的血小板数平均高于当天制备所得的血小板数的18.60%-33.00%[30-31]，也有与此结果不一致的报道[32]，但因为样本、离心参数等诸多条件不同，导致各结果间无可比性。但室温保存全血过夜不利于其他血液成分的保存，制备WBPC后的其他血液成分如悬浮红细胞、血浆凝血因子的质量受到一定的影响[33]，特别是对Ⅷ因子的影响较大(降低约20%)[34]。因此，可以控制在血液采集6 h内完成全血室温静置和白膜层分离，通过全血静置1.0-2.0 h来促进血小板在血液运输、交接过程中发生的可逆性聚集解聚，从而实现在不影响其他血液成分质量的基础上制备出血小板回收率更高的WBPC。全血分离出白膜层后，白膜层的保存条件也是影响血小板回收率的关键因素。一般将白膜层在(22±2) ℃静置1.0-2.0 h后再制备WBPC，白膜层静置有利于使血小板和白细胞形成的微聚体解聚，从而提高血小板回收率。研究表明，白膜层不同静置时间对制备WBPC的血小板回收率也会产生影响，静置2 h血小板回收率最高[35-36]。若白膜层静置后不能及时制备WBPC，可将白膜层保存12 h内制备WBPC，但也会因保存温度较高造成红细胞破裂，导致游离血红蛋白含量增加[37]。因此，在条件允许的情况下，采集全血室温保存6 h内制备出白膜层，将白膜层于(22±2) ℃静置2 h制备WBPC的方式更有利于获得高质量的血液成分；如若受场地、工作人员等因素限制无法达到制备条件，可将白膜层静置2 h后振荡过夜再制备WBPC，血小板的回收率及其他血液成分质量也较白膜层静置过夜保存更具优势[38]。以往的研究表明，血小板浓度约为5倍以上，非输注性临床应用即可获得令人满意的结果[39]。若将WBPC应用在慢性难愈性创面，不止需要考虑血小板的浓度，还需要关注WBPC中血小板的活性，释放生长因子的能力等指标。
2.4.2   离心条件   影响WBPC质量的离心条件主要包括离心参数和装罐方式。白膜法制备WBPC最早可追溯到1969年[40]，后来研究者为提高血小板的回收率从离心参数方面对白膜法提出了多种改良。目前，中国采供血机构制备WBPC的离心参数，一般为(22±2) ℃时，第1次重离心力为(1 642-2 620)×g，离心时间在12-19 min，第2次轻离心力为(163-400)×g，离心时间控制在5-10 min，离心时通常是慢降速，以避免分界处不同密度的血液成分移位混合。不同的离心力往往导致血小板的回收率不同，若离心力过高会使大量的血小板混入红细胞界面，若离心力过低又会造成红细胞沉降率降低，两者均导致血小板分离率降低，而且过高的离心力可能也会导致血小板的早期活化，从而导致生长因子丧失或WBPC治疗无效。在WBPC的制备中，需要根据所用离心机的品牌、型号等情况设置离心参数，目前关于WBPC制备离心参数的绝大多数研究集中在提高血小板回收率，对于调整离心参数对血小板活性的影响也应是WBPC非输注性临床应用需要重点关注的方向。此外，白膜成分袋离心时装罐配平方法对WBPC质量也会产生较大影响，因白膜成分袋内白膜层血量较少，袋体软而薄，在离心过程中由于袋体与离心杯内壁之间存在空隙，易下坠和折叠，一方面导致有形成分滞留在袋体折叠处，造成血液成分回收率低。研究表明，当新鲜全血离心后，也会有一些灰白色层牢牢地黏附在血袋褶皱的内壁上，并且即使在挤压血浆过程中血液成分向顶部的流动也无法完全被去除，从而造成血小板回收率降低[41]。另一方面下坠折叠的袋体因垂直悬挂后，导致白膜层液面扰动移位，进而达不到预期的分离效果，影响WBPC质量。血液成分制备的一线工作人员提出，在离心杯内增加离心隔板支撑夹紧白膜成分袋，避免袋体产生褶皱，使血液能更紧密的贴合在离心杯内，可有效防止血液因离心旋转出现滑动移位，离心后袋体仍处于平整竖直状态且血液分层清晰[42-43]。装罐时空腔距离在0-1 cm之内，即可高效回收血小板的同时降低血小板2次回离概率[44]。除此之外，为避免血液红细胞层泛起影响WBPC质量，需动作轻柔，平稳放置。总之，避免白膜成分袋折叠是保证离心效果好的前提条件。
2.4.3   血袋结构   塑料血袋作为血液及血液成分采集、处理、转移、分离、贮存和输注必不可少的医用耗材，直接影响血液成分的质量。目前，中国采供血机构主要采用传统联袋采集制备WBPC的全血，包括四联袋、五联袋和六联袋。传统联袋的血液转移管在采血袋顶端(简称TT袋)，见图5，制备WBPC时，血液成分需经同一出口和转移管转移，血小板的回收率较低(50%-70%不等)。白膜袋和采血主袋连接管长，白膜袋和血小板转移袋尺寸/容积大，常使白膜层附着在管路和血袋壁，导致血小板回收率低。研究发现，六联袋因转移管更短，较四联袋血小板的回收率更高，可达80%[45]。白膜成分袋的尺寸由15 cm×12 cm优化为11 cm×9 cm后，血小板的回收率由(55.03±0.06)%提高到(79.23±0.09)%[46]。除了TT袋，也有采用顶底袋制备WBPC(简称TB袋)，提高血小板回收率的研究报道[47-48]，见图5，顶底袋组制备WBPC中血小板的回收率(91.0%)高于传统血袋对照组(69.0%)，并且差异有显著性意义(P < 0.01)[47]。TB袋是在不改变TT袋的材料、性能和转移袋结构的基础上，将主袋袋体的进、出口分别置于袋体的顶部和底部。当抗凝全血离心后，血浆从血袋袋体的顶部转移，浓缩红细胞从袋体的底部出口转移，上下层之间的一层富含血小板和白细胞的成分(白膜层)留在血袋袋体中，即可用于制备WBPC。白膜层保留在TB袋内能够降低细胞黏附损失，从而提高血小板回收率，通过不同出口转移血液成分还可避免因多次转移操作导致血小板活化。国外已广泛使用顶底袋制备随机捐赠者的WBPC，同时所得的悬浮红细胞的质量及血浆量也有所提高[49-50]。随着血袋结构的优化，血液成分分离机的普及，血小板保存袋及血小板型去白细胞滤器等的应用，WBPC的制备将更加高效和快速。

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[15]	王晓梅，王 府，杨晓辉，金成吉，李 湘. 原位定型微囊化载体制剂在糖尿病大鼠皮肤溃疡中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2011, 15(38): 7123-7126.

近几十年来，随着中国正在进入老龄化社会，慢性难愈皮肤损伤的发生率显著增加[1]。慢性难愈性创面比较常见的包括静脉溃疡、动脉溃疡、糖尿病足、压疮等，发生机制复杂、病程长、致残率高。富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是一种通过离心的方法从血液中提取出来的富含血小板的血液制品，含有高浓度的生长因子、抗菌肽[2-3]，具有促进细胞增殖、分化、基质合成、组织再生与修复等作用，可加快软组织愈合速度，对难愈性创面有一定的修复效果。一直以来，PRP的临床治疗主要以采集自体血液的试管法制备为主，但对于某些自身患有疾病或年龄较大的人群来说，可能存在不适合采集自身血液、血液采集困难、血小板活性较差或血小板释放生长因子能力降低等问题，导致使用自体PRP受限或效果较差。同时PRP的临床制备方法还没有统一标准，在采血量、离心条件、PRP制备量以及制备人员技术水平等方面差异性较大，导致PRP的成分不稳定，临床疗效也不同，给临床医务工作者应用PRP造成了诸多困扰[4-5]。因此，自体PRP在临床的推广及应用受到一定限制。
PRP是一种富含高浓度血小板的血液制品，与采供血机构供应给临床机构的机采血小板(apheresis platelet concentrate，APC)、浓缩血小板(whole-blood-derived platelet concentrate，WBPC)的成分基本一致，采供血机构按照《血站技术操作规程》采集制备成分血更易实现标准化，成分血质量符合《全血及成分血质量要求》，经过献血者健康筛查、血传疾病检验检测，安全性问题可以得到保障，因此采供血机构采集、制备的APC、WBPC作为异体PRP供应的来源是可行的。但APC在临床的供应一直是供不应求，同时费用昂贵，WBPC由健康献血者的全血制备，来源广泛，成本较APC低，若能有效利用，不仅能够节约宝贵的血液资源，同时也能为临床治疗提供多一种手段或方法。但目前仍缺乏异体WBPC对慢性难愈性创面疗效和治疗方案的共识。因此，该综述从采供血机构制备WBPC的现状，总结了影响WBPC对慢性难愈性创面疗效的相关因素，为采供血机构制备对慢性难愈性创面有效的标准化浓缩血小板提供参考。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   资料来源   
1.1.1   检索人及检索时间   第一作者在2023年3月进行检索。
1.1.2   检索文献时限   2000年1月至2023年3月。
1.1.3   检索数据库   PubMed数据库、中国知网和万方医学网。
1.1.4   检索词   中文检索词为“异体血小板，白膜法，皮肤溃疡，创面”，英文检索词为“allogeneic platelets(concentrate)，buffy coat method，skin ulcer，refractory wounds”。
1.1.5   检索文献类型   临床研究、综述、病例报告、Meta分析、指南和研究报告。
1.1.6   手工检索情况   手工检索《输血服务蓝皮书：中国输血行业发展报告(2019)》。

1.1.7   检索策略   以PubMed数据库为例，检索策略见图1。

1.1.8   检索文献量   中文文献218篇，英文文献348篇，总共检索566篇相关文献。
1.2   纳入和排除标准
1.2.1   纳入标准   ①论点论据可靠的文章，而且创新性强；②权威性强，时效性新的综述及基础性研究；③异体血小板在慢性难愈性创面应用相关的研究进展。
1.2.2   排除标准   ①内容重复或陈旧的文献；②讲座与会议摘要之类的文献。

1.3   数据提取与文献质量评估   由第一作者通过计算机独立检索完成，经过审阅文题和相关摘要等进行初次筛选，排除研究目的与内容重复以及与主题无关，最终得到中文文献19 篇，英文文献32 篇，共51 篇符合标准的文献进行综述，包括PubMed数据库32篇，中国知网11篇，万方医学网7篇，文献筛选流程见图2。

PRP已广泛用于难愈合伤口的修复，特别是在治疗慢性难愈性创面方面取得了满意的疗效，但一些不适合采集自身血液、血液采集困难、血小板活性较差或血小板释放生长因子能力降低的患者，使用自体PRP受限或效果较差。
WBPC是由采供血机构供应的输注性血小板成分血，WBPC由健康献血者的全血制备，来源广泛，在封闭状态(采血联袋)进行制备，严格无菌，并且经乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒以及艾滋病等血传疾病检测合格，是可以直接做静脉输注的血小板制品，安全性极高，同时WBPC可实现大规模、标准化制备，成分稳定，因此异体WBPC应用于临床后，在减少了供者选择困难的同时，更丰富了创面修复的手段，特别是拓宽了非手术方式修复慢性难愈性创面，对慢性难愈性创面的治疗安全、有效[51]。总之，异体WBPC为慢性难愈性创面的治疗提供了一种新的选择。尽管异体WBPC对慢性难愈性创面的治疗已有一些病例，但异体WBPC在慢性难愈性创面的应用也存在一些问题：首先，现有证据样本量较小，结果尚需进一步证实，缺乏一定的说服力；其次，WBPC促进不同创面愈合的最佳制备方法、最佳剂量以及治疗方案均有待进一步深入研究；最后，采供血机构制备与临床应用疗效脱节。目前，WBPC的制备相关研究更多的是关注血小板的浓度，对于改良方法制备WBPC后血小板活性变化情况的研究还很少，其对慢性难愈性创面的疗效变化情况未知。另外，在WBPC应用前是否需要去除白细胞、是否需要辐照、是否需要病毒灭活，使用超出血小板保存期限(血小板的活性)的WBPC临床疗效是否受到影响，未来还需要更多随机、多中心临床试验进行验证。
未来如果由采供血机构向临床提供WBPC治疗慢性难愈性创面，仍需考虑以下2个问题：一是伦理学问题。采供血机构的血液来源于无偿献血者，无偿献血者捐献的血液一般只能用于临床输注治疗，如何让无偿献血者接受WBPC非输注性临床应用，还需要国家、省、市行政机关出台相应的支持政策，例如异体WBPC临床非输注性治疗的规范以及收费标准等。二是临床医院与采供血机构需建立精准有效的预约取血流程。WBPC的质量受多个因素的影响，例如原料保存条件(全血过夜/白膜过夜、振荡/静置(时间)、离心条件(离心参数、装罐方式)以及血袋的结构等，同时WBPC保存期较短，无法提前较长时间制备。因此，为获得高质量的WBPC，同时避免血液资源浪费，临床机构和采供血机构可建立WBPC精准的预约-取血机制。临床机构至少提前36 h向采供血机构发出精准WBPC使用时间预约申请，根据临床机构提供的WBPC使用时间，采供血机构要综合考虑白膜法制备WBPC的影响因素：不单单只考虑血小板回收率，还需从血小板活性、血小板生长因子释放方面综合衡量WBPC的质量，合理安排全血采集、白膜层分离及WBPC制备的时间。三是建立WBPC成分制备和临床应用疗效的反馈机制。临床机构及时向采供血机构反馈WBPC的治疗效果，采供血机构根据反馈及时调整制备方案，做到信息互通。期待在采供血机构和临床医生的共同努力下，将异体WBPC作为慢性难愈性创面的治疗手段的大规模临床应用很快实现，为慢性难愈性创面患者带来福音。   中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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文题释义：

浓缩血小板：使用采血联袋制备，将置于室温保存和运输的全血于采集后6 h内或置于20-24 ℃保存和运输的全血于采集后24 h内，在室温条件下分离出血小板，并悬浮于一定量血浆内的成分血，制备方法包括白膜法和富血小板血浆法，国内采供血机构主要采用白膜法制备浓缩血小板。
慢性难愈性创面：无法通过正常、有序、及时修复而造成的或经修复但无法恢复解剖及功能状态完整的创面，包括静脉溃疡、动脉溃疡、糖尿病足、压疮等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

血小板不仅可通过静脉输注预防和治疗血小板减少和/或血小板功能障碍，其还可通过局部注射、外敷、填充等应用方式进行异体非输注性临床应用，应用领域涉及外科皮肤损伤、创面，骨折或骨缺损等，治疗效果显著。采供血机构为临床机构提供的机采血小板、浓缩血小板，来源于健康献血者，经过血液传播疾病相关指标检测，安全性高，在使用前还可以选择辐照、病毒灭活等技术进一步保证其安全性。未来在出台相关法律、法规及普及临床合理用血理念的基础上，血小板成分血将是再生医学领域的宝贵财富。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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