2.1   实验动物数量分析   实验选用C57BL/6J小鼠44只，第1种分组将10只小鼠随机分为2组：假手术组、TAC手术组，每组5只，均进入结果分析；第2种分组将10只小鼠随机分为2组：阴性对照组、miR-20a组，每组5只，均进入结果分析；第3种分组将24只小鼠随机分为阴性对照+假手术组、阴性对照+TAC手术组、miR-20a+假手术组、miR-20a+TAC手术组，每组6只，每组造模成功5只小鼠进入结果分析。
2.2   TAC手术小鼠心脏组织中miR-20a表达水平显著下调   为了研究miR-20a在心肌肥大动物模型中的作用，实验通过TAC手术诱导小鼠心肌肥大。qRT-PCR实验结果显示，与假手术组相比，TAC手术组小鼠术后6周心脏组织中miR-20a的表达水平显著降低(P < 0.05，n=5)，见图1。




2.3   体内过表达miR-20a显著抑制小鼠心肌肥大及纤维化    为了研究miR-20a在体内心肌肥大中的作用，野生型C57BL/6小鼠心脏原位注射miR-20a过表达腺病毒和阴性对照腺病毒1周后，qRT-PCR实验检测miR-20a的表达水平。结果显示，与阴性对照组相比，miR-20a组小鼠心脏组织miR-20a表达水平显著上调(P < 0.05，n=5)，见图2。



野生型C57BL/6小鼠心脏原位注射miR-20a过表达腺病毒1周后行TAC术，术后6周检测各项指标，见图3A。与阴性对照+TAC手术组相比，miR-20a+TAC手术组心脏组织中肥大标志基因脑钠肽(P < 0.05，n=5)和β-肌球蛋白重链(P < 0.05，n=5)的mRNA表达水平明显著降低，见图3B，C，心脏体积明显减小，见图3D，心质量/体质量比值也显著降低(P < 0.01，n=5)，见图3E。同时，心脏组织学染色分析心肌细胞肥大和心肌损伤情况。与阴性对照+TAC手术组相比，miR-20a+TAC手术组麦胚凝集素染色结果(P < 0.05，n=5)和苏木精-伊红染色结果(P < 0.000 1，n=5)均显示心肌细胞横截面积显著减小，见图3F-I；天狼猩红染色结果显示纤维化面积显著减小(P < 0.000 1，n=5)，见图3J，K。以上结果说明，过表达miR-20a显著抑制了TAC手术引起的心肌肥大和心肌纤维化。



2.4   血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大模型中miR-20a表达水平显著下调   qRT-PCR 实验检测miR-20a在心肌细胞肥大模型中的表达水平变化，结果显示，与血管紧张素Ⅱ处理0 h组相比，血管紧张素Ⅱ处理4，8 h后，miR-20a的表达水平轻微下调但没有显著性差异。延长血管紧张素Ⅱ处理时间至16 h和24 h后，miR-20a的表达水平显著降低(P < 0.05)。以上结果表明血管紧张素Ⅱ明显下调了miR-20a在心肌细胞中的表达水平，且与血管紧张素Ⅱ处理时间呈负相关，见图4。



当心脏受到压力超负荷刺激时，心脏中的肾素-血管紧张素系统被激活，导致体内循环血管紧张素Ⅱ水平升高，进而引起心肌肥大[22]。应用血管紧张素Ⅱ刺激H9c2细胞构建心肌细胞肥大模型，于细胞水平探索研究miR-20a在压力超负荷诱导心肌肥大中的作用。文献报道，血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大模型中，心房利钠肽、脑钠肽、β-肌球蛋白重链等肥大标志基因mRNA水平显著升高、蛋白质合成显著增加、心肌细胞表面积显著增大[23]。实验结果也证实，相比于对照组，血管紧张素Ⅱ处理心肌细胞24 h后，肥大标志基因心房利钠肽(P < 0.001)、脑钠肽(P < 0.05)和β-肌球蛋白重链(P < 0.05)的mRNA表达水平显著上调，见图5A-C，同时蛋白质/DNA比值显著升高(P < 0.05)，见图5D，F-actin染色实验结果显示细胞表面积也显著增大(P < 0.05)，见图5E，F。以上结果表明血管紧张素Ⅱ诱导了心肌细胞肥大。



2.5   体外过表达miR-20a显著抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大   为了研究miR-20a在体外心肌肥大中的作用，将miR-20a mimic及其阴性对照(mimic NC)分别转染至正常培养的H9c2细胞，qRT-PCR法检测miR-20a的表达水平，结果表明，与miR-20a阴性对照组相比，miR-20a过表达组中miR-20a的表达水平显著上调(P < 0.01)，见图6。



血管紧张素Ⅱ显著下调了miR-20a在心肌细胞中的表达水平，因此作者猜测miR-20a可能参与了血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大调控，于是开展实验研究。结果显示，与miR-20a阴性对照+血管紧张素Ⅱ组相比，miR-20a过表达+血管紧张素Ⅱ组心房利钠肽(P < 0.05)、脑钠肽(P < 0.01)和β-肌球蛋白重链(P < 0.05)的mRNA表达水平显著降低，见图5A-C，蛋白质/DNA比值显著减小(P < 0.01)，见图5D。此外，F-actin染色结果显示，与miR-20a阴性对照+血管紧张素Ⅱ组相比，miR-20a过表达+血管紧张素Ⅱ组细胞表面积显著减小(P < 0.05)，见图5E，F。以上结果表明，过表达miR-20a显著抑制了血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。
2.6   miR-20a调控线粒体分裂   心肌肥大发生时往往伴随着线粒体分裂，抑制线粒体分裂则抑制了心肌肥大[24]。文献报道，MitoTracker线粒体荧光探针具有细胞通透性，能够特异性地标记细胞中具有生物活性的线粒体，检测线粒体膜电位。探针标记的区域若呈现碎片状、颗粒状则表明线粒体发生分裂[25-26]。因此，实验使用MitoTracker线粒体荧光探针检测线粒体分裂情况，结果显示，与对照组相比，血管紧张素Ⅱ处理后心肌细胞线粒体分裂增多，分裂率显著升高(P < 0.05)。过表达miR-20a后，心肌细胞线粒体的碎片化程度减轻，分裂率显著降低(P < 0.05)，见图7。以上结果说明，miR-20a参与了线粒体分裂调控，过表达miR-20a抑制了血管紧张素Ⅱ诱导的线粒体分裂。



2.7   生物信息学方法预测分析miR-20a靶向心肌肥厚调控分子PKIA   进一步寻找miR-20a调控线粒体分裂的下游靶标。实验使用TargetScan Human 8.0分析预测miR-20a的下游靶基因[27]，结果显示，cAMP 依赖性蛋白质活化酶抑制剂 α [protein kinase (cAMP-dependent, catalytic) inhibitor alpha，PKIA]可能是miR-20a的重要靶标，miR-20a的7 mer-m8种子区和PKIA mRNA 的3’UTR的1165-1171位可互补配对，见表2和图8A。同时使用RNAhybrid 2.2软件分析了PKIA的3’UTR序列与miR-20a序列[28]，结果显示PKIA的3’UTR区存在miR-20a的潜在结合位点，且该结合位点在多物种间具有高度保守性，见图8A，B。以上结果提示miR-20a在体内可能与PKIA mRNA的3’UTR区相互结合进而抑制PKIA的表达。已有研究表明细胞质中的cAMP可自由扩散到线粒体外膜，激活线粒体表面局部的PKA。活化的PKA磷酸化促裂变动力蛋白相关蛋白1(DRP1)阻断其向线粒体表面的转位，从而导致线粒体分裂减少[29]。而PKIA已被证明可以结合并抑制 PKA的催化亚基的活性，进而促进线粒体分裂，在线粒体动力学中起到重要的作用[30]。因此作者推测miR-20a可能通过靶向结合PKIA并抑制其表达，参与了线粒体分裂的调控途径，进而发挥抵抗心肌肥大的作用。

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心肌肥大是当心脏受到生理或病理性刺激时，为了维持心脏功能所做出的适应性反应，通常表现为心肌细胞增大和心室壁增厚，但当心脏发生病理性重构时，室壁厚度增加，心肌细胞进一步增大，导致心脏收缩功能受损，如果不及时治疗，这种适应性肥大可能会转变为心力衰竭甚至猝死[1]。当心脏受到刺激发生肥大时，心房利钠肽、脑钠肽、β-肌球蛋白重链等胚胎基因表达程序被重新激活，继而引起心肌细胞增大所需的蛋白质合成增加，而动物细胞中DNA的量通常是稳定的，因此，心房利钠肽、脑钠肽、β-肌球蛋白重链的表达水平以及蛋白质/DNA比值可作为心肌肥大的可靠标志[2-4]。目前心肌肥大被认为是心力衰竭的一个主要危险因素[5-6]，但其致病机制仍未阐明。
心肌细胞中存在着丰富的线粒体，线粒体提供心脏正常功能所需的90%以上的ATP，对心脏维持正常的收缩功能至关重要，而线粒体是大多数细胞中高度动态的细胞器，处于不断分裂和融合变化之中，保持线粒体动力学平衡即分裂和融合的动态平衡是维持线粒体稳态的重要基石[7-10]。大量证据表明，正常的线粒体动力学对维持心脏功能具有重要的作用[11]，线粒体动力学失衡是心肌肥大发病机制的一个重要因素。抑制线粒体分裂能够预防或逆转心脏肥大，改善心脏功能，并避免其向心力衰竭发展[10]，因此研究心肌肥大的线粒体机制具有非常重要的意义。
microRNAs (miRNAs)是一类由约22个核苷酸组成的单链非编码RNA，通过与靶基因mRNA的3’UTR区、5’UTR区或CDS区互补结合，介导靶基因mRNA的翻译抑制或降解[12]，进而抑制靶基因的表达。miRNAs在心肌肥大[13-14]、心肌梗死[15]、心肌炎[16]、心力衰竭等多种心血管疾病中起到重要的调控作用[17]。最新有研究报道miR-20a参与了心脏病理过程调控，其在冠心病中表达下调，过表达miR-20a可以减轻人冠状动脉内皮细胞的炎症和损伤[18]，且在运动预防冠心病发生中起到了重要的作用[19]。双重过表达miR-20a和miR-19a通过抑制炎症和氧化应激反应来改善扩张性心肌病大鼠的左心室功能[20]。在链脲佐菌素诱导的1型糖尿病大鼠模型中miR-20a表达下调，过表达miR-20a可改善糖尿病大鼠的心肌肥大、心肌纤维化和心脏功能障碍[21]。然而miR-20a在压力超负荷所致心肌肥大中的作用和分子机制尚未见报道，尤其是线粒体动力学的相关变化尚不清楚。因此，该研究主要探索miR-20a在压力超负荷所致心肌肥大中的作用及相关分子机制，为心力衰竭的预防、诊断和治疗提供重要的理论基础。  中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   细胞生物学实验、随机对照动物体内实验。
1.2   时间及地点   实验于2021年1月至2022年11月在山西医科大学基础医学院细胞生理学教育部重点实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   细胞   H9c2大鼠心肌细胞购买自南京科佰生物科技有限公司，细胞培养于37 ℃，体积分数为5% CO2的细胞培养箱。
1.3.2   动物   雄性6周龄的C57BL/6J小鼠44只，体质量20-22 g，由山西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK (晋)2019-0004。
实验动物均饲养于SPF级动物房，室温(22±2) ℃，12 h明/暗循环，提供小鼠所需的洁净饮用水、标准饲料和常规垫料。实验方案经山西医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号：SYDL2022024)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.3   实验试剂   胎牛血清(Ausgene公司，FBS500-5)；双抗(北京索莱宝科技有限公司，P1400)；DMEM培养基(Hyclone)；血管紧张素Ⅱ(Sigma-Aldrich公司，A9525)；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，MR101)；M5 Sprint qPCR RT kit with gDNA remover (北京聚合美生物科技有限公司，MF949)；2X M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Rox (SYBRgreen，with anti-Taq)(北京聚合美生物科技有限公司；MF797)；含DAPI的防淬灭剂(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9557)；线粒体红色探针(翌圣生物科技股份有限公司，40741ES50)；Lipofectamine® 2000 Reagent (Invitrogen公司，11668)；TRIzol试剂(Invitrogen)；DNA定量试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司，MF620)；苏木精-伊红染色试剂盒(北京雷根生物技术有限公司，DH0006)；天狼猩红染色试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)；麦胚凝集素染料(Sigma-Aldrich公司，L4859)。
1.3.4  实验仪器   细胞培养箱(Forma Scientific公司)；超净工作台(苏净安泰公司)；低速离心机(Eppendorf 公司)；低温高速离心机(Beckman公司)；倒置荧光显微镜(Olympus公司)；激光共聚焦荧光显微镜(Olympus 公司)；QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪(BioRad公司)。
1.4   方法   
1.4.1   实验动物分组   ①小鼠适应性喂养1周后，用计算机取随机数法随机将10只小鼠分为2组：假手术组、横向主动脉缩窄(transverse aortic constriction，TAC)手术组，每组5只。假手术或TAC术后6周提取心脏组织RNA，qRT-PCR法检测miR-20a的表达水平。②小鼠适应性喂养1周后，用计算机取随机数法随机将10只小鼠分为2组：阴性对照组、miR-20a组，每组5只。心脏原位注射miR-20a过表达腺病毒或阴性对照腺病毒后1周提取心脏组织RNA，qRT-PCR法检测miR-20a的表达水平。③小鼠适应性喂养1周后，用计算机取随机数法随机将24只小鼠分为4组：阴性对照+假手术组、阴性对照+TAC手术组、miR-20a+假手术组、miR-20a+TAC手术组，每组6只。心脏原位注射miR-20a过表达腺病毒或阴性对照腺病毒1周后进行TAC手术或假手术，术后6周后取小鼠心脏组织观察及检测心肌相关指标变化。
1.4.2   腺病毒的构建   miR-20a模拟物mimic序列为5’-TAA AGT GCT TAT AGT GCA GGT AG-3’，阴性对照mimic NC序列为5’-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3’，以上寡核苷酸的合成和腺病毒构建均由上海吉玛制药技术有限公司完成。miR-20a过表达腺病毒的构建方法简述如下：制备好腺病毒颗粒中含有miR-20a模拟物mimic的ADV1 穿梭质粒及其骨架质粒，进行高纯度无内毒素抽提后共转染至293A细胞，获得腺病毒原液，通过反复扩增、纯化、浓缩后得到更高滴度的腺病毒浓缩液，最终获得滴度为1×108 PFU/mL的表达miR-20a mimic的腺病毒溶液。
1.4.3   心脏原位注射腺病毒   使用2%异氟烷麻醉小鼠后，仰卧位固定，经口对小鼠行气管插管后连接呼吸机(潮气量0.2 mL，呼吸频率110次/min)，沿剑突与腋窝连线做0.5 cm皮肤切口，钝性分离胸大肌和胸小肌并打开第三肋，暴露心脏。通过充满腺病毒的Hamilton注射器将1×108 PFU/mL的miR-20a过表达腺病毒或阴性对照腺病毒溶液注射到心肌的5个部位(左心室腹壁、左心室背壁、左心室侧壁、右心室腹壁、右心室背壁)，每个部位注射8-10 μL。注射完成后，用5-0丝线缝合皮肤。
1.4.4   TAC手术   使用2%异氟烷麻醉小鼠后，仰卧固定，经口对小鼠行气管插管后连接呼吸机(潮气量0.2 mL，呼吸频率110次/min)，沿胸骨左缘剪开皮肤后顺着胸骨左侧打开胸腔，暴露出主动脉弓，一根6-0的丝线预先穿过主动脉弓，将平行于血管处放置的26G垫针与主动脉弓一起结扎，随即取出垫针。假手术组除丝线不打结，其余操作同TAC手术组。TAC手术后6周，戊巴比妥给药对小鼠实施安乐死，开胸取出心脏组织，生理盐水清洗血液，后续检测心肌相关指标变化。
1.4.5   组织病理学分析   小鼠心脏原位注射miR-20a腺病毒或其阴性对照腺病毒，1周后行TAC手术，术后6周对小鼠实施安乐死，开胸取出心脏，洗净血液，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，将心脏切成4 μm厚薄片，按照苏木精-伊红染色试剂盒说明书进行苏木精-伊红染色。苏木精-伊红染色图像在光学显微镜下放大400倍进行观察拍照，使用Image J软件对心肌细胞进行量化分析。按照天狼猩红染色试剂盒说明书进行天狼猩红染色，光学显微镜观察拍照，使用Image J软件对纤维化面积进行量化分析。麦胚凝集素染色前，切片在二甲苯中脱蜡，在梯度乙醇系列中水化至蒸馏水，然后用PBS洗5次，每次3 min，切片从PBS中取出，在50 µg/mL的FITC标记的麦胚凝集素(溶解于含1 mmol/L CaCl2的PBS)中孵育60 min，PBS冲洗，用封片剂封固后在荧光显微镜下观察心肌细胞横截面积，使用Image J软件统计心肌细胞横截面积。
1.4.6   心肌细胞培养   H9c2心肌细胞接种于含有体积分数为10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中，在37 ℃和体积分数为5%CO2的恒温箱中培养，待H9c2细胞汇合度达到70%-80%时，用1 μmol/L血管紧张素Ⅱ处理H9c2细胞24 h来诱导体外心肌肥大模型，用1 μmol/L血管紧张素Ⅱ处理0，4，8，16，24 h检测miR-20a表达水平。
1.4.7   细胞分组   ①取H9c2细胞，设置对照组(不做处理)、miR-20a过表达组、miR-20a阴性对照组；②取H9c2细胞，设置对照组(不做处理)、血管紧张素Ⅱ组、miR-20a过表达+血管紧张素Ⅱ组、miR-20a阴性对照+血管紧张素Ⅱ组。
1.4.8   细胞转染   根据制造商的使用说明书进行操作，使用Lipofectamine ® 2000 Reagent将miR-20a mimic和对应的miR-20a mimic NC转染至H9c2细胞，转染24 h后提取RNA，
qRT-PCR法检测miR-20a的表达水平，以及在转染24 h后继续加入1 μmol/L血管紧张素Ⅱ处理24 h进行后续功能实验。

1.4.9   qRT-PCR   小鼠心脏进行TAC手术或假手术6周后取心脏组织，检测miR-20a的表达水平；小鼠心脏原位注射miR-20a腺病毒或其阴性对照腺病毒1周后，检测miR-20a的表达水平；小鼠心脏原位注射miR-20a腺病毒或其阴性对照腺病毒1周后行TAC手术或假手术，术后6周取小鼠心脏组织，检测脑钠肽、β-肌球蛋白重链表达水平；在H9c2细胞中转染miR-20a mimic或阴性对照24 h后检测miR-20a的表达水平；血管紧张素Ⅱ分别处理H9c2细胞0，4，8，16，24 h后检测miR-20a的表达水平；在H9c2细胞中转染miR-20a mimic或阴性对照24 h后，加入血管紧张素Ⅱ继续处理24 h，检测心钠肽、脑钠肽和β-肌球蛋白重链表达水平。根据制造商的使用说明书，使用TRIzol试剂提取H9c2细胞或心脏组织的总RNA，使用NanoDrop分光光度计测量RNA浓度和纯度。qRT-PCR中使用的引物序列见表1。miRNA用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)和miR-20a特异性引物反转成cDNA，mRNA用M5 Sprint qPCR RT kit with gDNA  remover反转成cDNA，用 2X M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Rox (SYBRgreen，with anti-Taq)在Applied Biosystems QuantStudio 3上检测miRNA或mRNA的表达，U6和GAPDH分别作为miRNA和mRNA的内参。qRT-PCR的结果用2-ΔΔCT分析。 

1.4.10   F-actin染色法测量细胞表面积   正常培养的H9c2细胞接种于1 cm×1 cm的玻片上，贴壁培养16-24 h后，转染miR-20a mimic或其阴性对照24 h后加入1 μmol/L血管紧张素Ⅱ处理24 h，制作细胞爬片，用PBS洗2次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，加入100 nmol/L TRITC染料染色30 min，PBS洗3次，每次5 min，用含DAPI的防淬灭剂封固，荧光显微镜下观察心肌细胞，ImageJ软件统计细胞表面积。
1.4.11   蛋白质/DNA比值测定   正常培养的H9c2细胞接种于12孔板，待密度汇合至70%左右，转染miR-20a mimic或其阴性对照24 h后加入1 μmol/L血管紧张素Ⅱ处理24 h，用预冷的PBS洗2次，加入100 μL裂解液(150 mmol/L氯化钠、15 mmol/L柠檬酸钠、0.25%SDS；pH=7.0)，裂解后用细胞刮收集细胞后，并立即于-20 ℃冷冻。解冻后涡旋混匀，取1 μL样品用BCA法测蛋白质含量，用DNA定量试剂盒测DNA含量，计算蛋白质/DNA比值。
1.4.12   线粒体染色   正常培养的H9c2细胞接种于1 cm×1 cm的玻片上，贴壁培养16-24 h后，转染miR-20a mimic 24 h，然后加入1 μmol/L血管紧张素Ⅱ处理24 h，制作细胞爬片，PBS洗1次，加入0.02 μmol/L MitoTracker Red CMXRos线粒体红色荧光探针，37 ℃染色10 min；PBS洗3次，每次5 min；40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min；用含DAPI的防淬灭剂封固；激光共聚焦显微镜观察拍照，使用ImageJ软件分析计算有碎片化线粒体的细胞数占总细胞数的百分比。
1.4.13   生物信息学分析   使用TargetScan Human 8.0 (https://www.targetscan.org/vert_80/)分析预测miR-20a的下游靶基因并得到相关预测参数。使用 RNAhybrid 软件分析miR-20a与 PKIA 的相互作用情况和结合位点的二级结构模拟图。        
1.5   主要观察指标   ①心脏组织和H9c2细胞的miR-20a表达水平；②小鼠心肌肥大及纤维化表型，包括肥大标志基因脑钠肽和β-肌球蛋白重链的mRNA表达水平、心质量/体质量比值、心肌细胞表面积、心肌细胞纤维化程度；③H9c2细胞肥大表型，包括肥大标志基因心房利钠肽、脑钠肽和β-肌球蛋白重链的mRNA表达水平，蛋白质/DNA比值，心肌细胞表面积。
1.6   统计学分析   所有统计分析使用GraphPad Prism Version 9和SPSS 26.0进行，数据用至少3个独立实验的x±s表示。两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经山西医科大学生物统计学专家审核。

心力衰竭是全球高患病率和高致死率的一种心血管疾病，而心肌肥大是造成心力衰竭的一个重要危险因素，适度的肥大有利于减轻室壁压力，维持心脏功能，而长期的病理刺激会诱发病理性心肌肥大，往往会伴随着心律失常、心衰甚至是猝死[31]。越来越多的证据表明，压力超负荷会触发自分泌/旁分泌机制参与心肌肥大的发生发展[32]。
肾素-血管紧张素-醛固酮系统的过度激活是血压调节中最常见的调节机制，该系统响应血流动力学压力而被激活，例如TAC手术使左心室后负荷增大，激活了肾素-血管紧张素系统，血管紧张素Ⅱ是该系统的主要效应因子，其与AT1受体结合，通过全身和局部作用在心血管系统中发挥多种病理生理作用[33]，当血管紧张素Ⅱ过量刺激时，活性氧水平升高，激活活性氧下游相关通路，会导致心血管功能障碍包括心肌肥大[34-36]。该研究采用血管紧张素Ⅱ刺激心肌细胞构建心肌肥大体外模型，对6周的C57BL/6小鼠进行TAC手术构建心肌肥大体内模型[37-38]，进而同时在体内(动物水平)和体外(细胞水平)阐明了miR-20a在压力超负荷型心肌肥大中的作用。
实验发现在血管紧张素Ⅱ诱导的肥大心肌细胞和TAC手术诱导的肥大心脏组织中，miR-20a的表达水平显著降低。心肌细胞中过表达miR-20a显著抑制了血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大，包括减小的细胞表面积、下调的肥大标志基因心房利钠肽、脑钠肽和β-肌球蛋白重链的表达水平，降低的蛋白质/DNA比值。小鼠心脏中过表达miR-20a显著抑制了TAC手术诱导的心脏肥大，包括下调的肥大标志基因脑钠肽和β-肌球蛋白重链的表达水平，减小的心脏体积，降低的心质量/体质量比值，减小的细胞表面积，以及减轻的心肌纤维化程度。以上结果表明miR-20a具有抵抗压力超负荷型心肌肥大的作用。未来将会继续研究miR-20a在其他因素诱导的心肌肥大模型中是否有调控作用，例如异丙肾上腺素、醛固酮、胰岛素和苯丙肾上腺素等诱导的心肌肥大模型，同时将在心肌肥大临床患者样本中研究miR-20a的作用，进一步揭示miR-20a在心肌肥大中的功能。
研究发现，除了细胞，血清、血浆和其他体液中也存在着大量的循环miRNAs，在多种疾病中呈现出差异性表达，进而被作为一种新的生物标志物，用于一些心血管疾病的早期筛查与诊断，如缺血性心肌病[39]、心力衰竭[40-41]、肥厚性心肌病等[42]。由于miRNA可以调控广泛而特异的基因网络，所以基于miRNA的治疗方法研究引起了人们的极大兴趣。但递送miRNA到靶部位以及药物的稳定性等问题一直是一个尚待克服的难关[43]。之前有研究报道第一批miRNA制剂如miR-34模拟物和miR-122拮抗剂目前已经进入了临床阶段[12]。
此外，最新研究报道，THUM团队完成了首次miRNA人体临床试验[44]，发现miR-132的抑制剂CDR132L，即一种反义寡核苷酸，显著降低了血浆中miR-132的表达水平，改善心衰，虽然该研究仍需要更多临床试验来验证，但其实现了miRNA治疗心脏病的里程碑式的突破。此次研究在细胞水平和动物水平阐明了miR-20a具有抵抗心肌肥大的作用，明确了miR-20a在压力超负荷诱导心肌肥大中的功能，这将为开发miR-20a成为心肌肥大和心力衰竭等心脏疾病的诊断试剂盒和核酸类治疗药物提供重要的理论基础。然而，由于miR-20a已被广泛证明是重要的促癌因子，介导了多种癌症的发生发展，如乳腺癌、宫颈癌、肝癌和卵巢癌等，这为将miR-20a开发成为心肌肥大的临床治疗药物带来了困难。该研究揭示了miR-20a具有抑制病理性心肌肥大的作用，体内实验结果表明心脏原位注射miR-20a过表达腺病毒后能够抵抗压力超负荷型心肌肥大，但是与此同时，miR-20a是否引起体内某些部位的细胞癌变？课题并没有开展相关研究。在未来的研究中，将重点关注miR-20a在抑制心脏肥大的同时是否有促癌的不良反应以及如何降低不良反应，为进一步将miR-20a应用于临床治疗提供理论依据。
在生理条件下，线粒体处于分裂和融合的动态平衡，产生ATP，对于维持心脏结构和功能至关重要，此时线粒体大小是均匀的[45]。但当线粒体受到不可逆转的损伤并对细胞可能有害时，就会发生线粒体分裂，形成较小的球形细胞器，然后通过线粒体自噬过程消化降解[9]。越来越多的证据表明，异丙肾上腺素[24]、苯丙肾上腺素[46]、阿霉素处理后显著增加了心肌细胞线粒体分裂水平[47]，并与心肌肥大的发展密切相关。此外，miRNA 在调节心肌肥大的线粒体网络中也起到了关键的作用。目前已经有研究报道miR-153-3p通过下调线粒体融合相关蛋白Mfn1的表达[24]，进而抑制了异丙肾上腺素诱导的线粒体分裂，减轻了心肌肥大。因此，调控线粒体动力学可能是心肌肥大的一种潜在治疗策略。最近研究报道，在小鼠心肌细胞中血管紧张素Ⅱ诱导了显著的线粒体分裂[48]，该研究进一步证实了血管紧张素Ⅱ促进线粒体分裂，而过表达miR-20a显著抑制了血管紧张素Ⅱ所诱导的线粒体分裂，这可能是miR-20a发挥抵抗心肌肥大作用的重要机制。生物信息学方法预测miR-20a的7 mer-m8种子区和PKIA mRNA 的3’UTR的1165-1171位有很好的互补配对，且具有高度保守性，提示miR-20a可能与PKIA mRNA结合并抑制PKIA的表达。已有研究表明PKA通过磷酸化DRP1进而阻断其向线粒体表面的转位，从而导致线粒体分裂减少[29]。而PKIA则可以抑制 PKA的活性，进而促进线粒体分裂，此外，有研究报道PKIA参与了血管紧张素(1-9)诱导的线粒体分裂和心肌肥大的调控[30]。因此，作者推测miR-20a可能通过靶向抑制PKIA，进而发挥抑制线粒体分裂和抵抗心肌肥大的作用。作者目前的工作只是预测了miR-20a的下游靶点，没有做进一步实验验证，未来将会开展实验研究miR-20a与PKIA的相互作用，以及miR-20a是否与PKIA组成线粒体分裂和心肌肥大的调控轴。
结论：在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大细胞模型和TAC手术诱导的心肌肥大动物模型中，miR-20a的表达水平均显著下调。过表达miR-20a显著抑制了心肌肥大、心肌纤维化和线粒体分裂。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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文题释义：

心肌肥大：心肌肥大通常表现为心肌细胞增大和心室壁增厚，这种变化最初是用来维持心输出量的生理性适应性反应，而当受到持续的病理性刺激时，会引起病理性心肌肥大，并可能导致心力衰竭。
线粒体分裂：线粒体通过不断地经历融合和分裂来调节它们的形态、分布和功能，线粒体为心脏的收缩和代谢提供能量，线粒体分裂参与了心肌肥大的调控。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

心血管疾病是威胁人类生命健康的头号杀手，预防和治疗心血管疾病已成为亟待解决的重大科学问题。心肌肥大是心脏发生临床病变的一个里程碑式心肌形态变化，是导致心脏猝死的一个危险因素。心肌肥大长期受人们关注，但其分子机制尚未被完全了解。最新研究报道，线粒体动力学失衡是心肌肥大发病机制的一个重要因素。我们的工作揭示了一种新的心肌肥大抑制因子miR-20a，明确了其在线粒体动力学和压力超负荷型心肌肥大中的重要调控作用。本研究推动了人们对心肌肥大线粒体机制的理解和认识，丰富了miR-20a在心脏病理过程中的功能，同时为开发基于miR-20a的心肌肥大和心力衰竭等心脏疾病的诊断试剂盒和核酸类治疗药物提供重要的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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