1.1 设计 细胞学实验，相关数据的分析采用t检验和单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2021年3-9月在河南省中医院河南中医药大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 选择50只清洁级SD雄性大鼠(1月龄)，体质量(100±15) g，常规饲养，购自郑州大学实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2020-0008。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。所有实验操作均经过河南省中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号：HNZYY-2021004)。
1.3.2 主要试剂与仪器 DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液(美国gibco公司，货号：11320033，15140122，42G9150K，25200-056)；H2O2购于上海威奥(WH1028-3)；NC siRNA和Parkin siRNA由广州锐博生物合成；Parkin腺病毒过表达载体购自于汉恒生物；二甲基亚砜(德国WAK CHEMIE公司，货号：WAK-DMSO-50)；Trizol、Lipo 3000 转染试剂(美国invitrogen公司，货号：257408，2209775)，Ⅱ型胶原酶(广州赛国生物科技有限公司，货号：EZ4360324)；CCK-8试剂盒、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒、ATP检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒、脂质氧化丙二醛检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0037，C0016，S0026，S0101S，S0131S，C2006，C1065M)；过氧化氢酶活性检测试剂盒(BC0205)、Ⅱ型胶原抗体(K009364P)购自北京索莱宝科技有限公司；Parkin、LC3、p62、GAPDH(美国
Cell Signaling Technology 公司，货号：4211T，3868T，48768T，5879S)；生物素标记山羊抗兔免疫球蛋白IgG，生物素标记山羊抗小鼠 IgG(中国上海碧云天生物技术有限公司，货号：A0277，A0286)。
细胞培养箱(REVCO，RCO-3000-5)，酶标仪(Molecular Devices，Spectra MaxM3)，低温高速离心机(Eppdorf)，CytoFLEX型流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)，荧光显微镜(Olympus，型号：BX41)，基础电泳仪，转膜仪(美国 Bio-Rad 公司，型号：164-5050，170-3930)。
1.4 方法
1.4.1 药物的制备 黄芪桂枝五物汤中药饮片由河南省中医院提供。黄芪 9 g，芍药 9 g，桂枝 9 g，生姜 18 g，大枣 12枚加入8倍纯水浸泡，2 h后煎煮2次，每次30 min，将2次煎煮所得药液过滤并混合后浓缩至1 mL原液=2 g生药的水提物。将体积分数95%的乙醇缓慢加入到上述制备的水提物中，经过搅拌后进行密封，放置于4 ℃的冰箱中静置24 h。所得到混合物经过抽滤后获得水提醇沉物(1 mL水提醇沉物=2 g生药)。通过旋蒸的方式将水提醇沉物进行浓度设置(1 mL水提醇沉物=5 g生药)，置于-80 ℃保存。使用时将其用完全培养基稀释至6.25，12.5，25 mg/mL。
1.4.2 大鼠椎间盘终板软骨细胞的分离和培养 参考文献[12]的方法分离出大鼠椎间盘终板软骨细胞。采用10%的戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，脊柱脱臼法处死，以体积分数75%的乙醇消毒液擦拭全身，无菌操作下取出大鼠腰椎段，剥离附着组织，仅保留椎间盘终板软骨，无菌PBS洗涤后剪碎研磨，0.25%胰蛋白酶消化液消化30 min，后加入3 mLⅡ型胶原酶消化2 h。待细胞游离状态时收集悬液，离心10 min(1 000 r/min，离心半径5 cm)，去上清液，PBS洗涤后加入DMEM/F12完全培养基重悬为单细胞悬液，接种于培养皿中，于含有体积分数5%CO2的培养箱(37 ℃)中进行培养，第2天换液，此后每隔2 d换1次液，取长至80%以上的P3代软骨细胞进行实验。
1.4.3 终板软骨细胞鉴定 细胞贴壁后，移去培养液后加入40 g/L多聚甲醛，在室温条件固定20 min，之后加入0.2%的Triton X-100进行透化15 min。透化完成后加入3%的BSA进行封闭(30 min)，再加入Ⅱ型胶原一抗(1∶100)，在4 ℃下过夜。最后加入荧光标记的二抗(1∶200)，避光孵育1 h后在荧光显微镜下观察拍照。
1.4.4 分组及处理 ①为了研究黄芪桂枝五物汤对线粒体损伤、氧化应激和线粒体自噬蛋白表达的影响，将细胞分为正常组、模型组和黄芪桂枝五物汤低、中、高剂量组。其中黄芪桂枝五物汤各剂量组分别用含低(6.25 mg/mL)、中(12.5 mg/mL)、高(25 mg/mL)剂量黄芪桂枝五物汤的培养液培养细胞24 h，而正常组和模型组不添加药物。之后除正常组外，模型组和黄芪桂枝五物汤各剂量组中添加400 μmol/L的H2O2继续处理细胞2 h。②为了研究Parkin介导的线粒体自噬在调控细胞氧化应激和线粒体损伤中的作用，将细胞接种于6孔板，每孔细胞数为1×106个。待细胞生长至60%时按照说明书转染相对应的siRNA，24 h后收集细胞。将细胞分为NC siRNA组、NC siRNA+H2O2组、Parkin siRNA组、Parkin siRNA+H2O2组，继续用400 μmol/L 的H2O2处理2 h。NC siRNA的序列为：5’-UUC UGC GAA CGU GUC ACG UTT-3’，Parkin siRNA的序列为：5’-CCA ACU CCC UGA UUA AAG ATT-3’。
1.5 主要观察指标
1.5.1 CCK-8法检测细胞存活率 将椎间盘终板软骨细胞以1×104个/孔的密度接种到96孔板中，按照1.4.4中的分组和方法进行相应处理，每组设置6个复孔，重复3次。处理完成后培养孔中加入CCK-8溶液10 μL，继续孵育2 h。使用酶标仪检测细胞在450 nm处的吸光度值。
1.5.2 乳酸脱氢酶活性的检测 将细胞按照1×106个/孔的密度接种于细胞6孔板中，分组及处理方法见1.4.4中①。处理完成后将椎间盘终板软骨细胞于冰上裂解后离心提取上清(4 ℃，12 000 r/min，离心5 min)，根据乳酸脱氢酶测定试剂盒说明书进行操作，每组设3个复孔，试剂混匀后静置3 min，用酶标仪1 cm光径在440 nm处测定吸光度值。
1.5.3 流式细胞术检测活性氧水平 将细胞接种于细胞12孔板中，椎间盘终板软骨细胞的分组及处理见1.4.4，无菌PBS洗涤2次，加入胰酶消化细胞。收集细胞再次使用无菌PBS洗涤，离心5 min(1 000 r/min，离心半径13.5 cm)，丢弃上清液，加入稀释后的活性氧荧光探针染剂重复吹吸重悬，细胞培养箱内培养(每隔5 min吹吸重新1次)，30 min后转移至FACS管中，立即放入流式细胞仪测量并进行分析。
1.5.4 ATP含量的检测 将细胞接种于12孔板中(1×105个/孔)进行培养，具体分组见1.4.4，于冰上裂解后离心提取上清(4 ℃，12 000 r/min，5 min)，根据试剂盒说明书进行操作，每个样品做3个复孔，随后用化学发光仪测定相对光单位值并分析ATP浓度。
1.5.5 SOD和过氧化氢酶活性的检测 将细胞接种于12孔板中(1×105个/孔)进行培养，具体分组见1.4.4中①，于冰上裂解后离心提取上清(4 ℃，12 000 r/min，5 min)，根据试剂盒说明书进行操作，每个样品做3个复孔，随后用酶标仪测定SOD和过氧化氢酶的吸光度值。
1.5.6 丙二醛含量的测定 将细胞接种于12孔板中(1×105个/孔)进行培养，椎间盘终板软骨细胞分组见14.4，操作步骤严格按照试剂盒的说明书进行。酶标仪在532 nm条件下来测定样品的吸光度值。
1.5.7 JC-1荧光探针检测线粒体膜电位 将细胞以1×105个/孔接种于12孔板培养板中，分组见1.4.4中①，经处理后丢弃培养基，加入JC-1荧光探针染液(二甲基亚砜配制，质量浓度1 g/mL)，于37 ℃培养箱中放置20 min，后使用无菌PBS洗涤细胞3次，使用倒置荧光显微镜观察，并用Image J软件分析平均荧光强度。平均荧光强度=吸光度总和/荧光面积，线粒体去极化比例采用红绿荧光平均强度比值衡量。
1.5.8 流式凋亡双染法检测细胞凋亡 以1×105个/孔接种于12孔板培养皿中，分组见1.4.4中①。处理完成后将各组细胞分别消化离心，制备单细胞悬浮液，加入Annexin-FITC，混合均匀后再加入PI混匀。反应10 min(37 ℃，避光)后加入Binding Buffer，吹打细胞悬浮液，过滤后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.5.9 细胞线粒体自噬 将细胞按照2×105个/孔的密度接种于细胞6孔板中，分组见1.4.4中②，将无菌玻片裁剪后于浸泡于浓硫酸中过夜，纯水洗涤并烘干消毒，加入胰酶消化后计数，待细胞爬片后加入LC3抗体(1∶50)和TOMM20抗体(1∶100)，4 ℃孵育过夜，染色后加入相应的二抗(1∶200)，室温避光孵育1 h。使用荧光显微镜截取图像。使用Image-J软件测量每个视野中黄色(LC3B和TOMM20覆盖层)的相对荧光强度来评估线粒体自噬。
1.5.10 免疫印迹法检测相关蛋白表达 将细胞接种于12孔板中(1×105个/孔)进行培养，具体分组见1.4.4中①。处理完成后细胞内加RIPA裂解液于冰上裂解，100 ℃水浴锅内沸腾10 min，离心提取蛋白上清液。蛋白样品经凝胶电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h(4 ℃)，Parkin、LC3Ⅱ、p62和GAPDH抗体分别按1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶5 000进行稀释，将转移后的PVDF膜放入并在4 ℃环境下孵育过夜，洗涤3次加入二抗室温孵育2 h(1∶1 000)，放入曝光仪中PVDF膜滴加ECL显色液检测各组蛋白条带的吸光度值，Image J软件分析各组条带灰度值，记录蛋白表达水平。
1.5.11 Parkin腺病毒过表达转染及处理 将细胞接种于6孔板中(密度为1×106个/孔)，待细胞生长至50%-60%时，将腺病毒空载(pAd-Null)和Parkin腺病毒载体(pAd-Parkin)分别加入到细胞中(病毒滴度：1.47×1013 PFU/L)。加入DMEM/F12(不含血清)的培养基过夜培养，之后更换完全培养基继续培养48 h。免疫印迹检测转染效率。
将细胞接种于96孔板(1×104个/孔)中，分别用pAd-Null和pAd-Parkin感染终板软骨细胞，其中黄芪桂枝五物汤和H2O2处理的剂量和时间见1.4.4。实验分为6组：即对照组(pAd-Null)、pAd-Parkin组、pAd-Null+H2O2组、pAd-Parkin+H2O2组、pAd-Null+25 mg/mL黄芪桂枝五物汤+ H2O2组、pAd-Parkin +25 mg/mL黄芪桂枝五物汤+ H2O2组。处理完成后进行CCK-8检测。
1.6 统计学分析 数据统计分析采用SPSS 21.0软件进行，所得结果用x±s表示。对于多组数据间的比较采用单因素方差分析；两两组间比较，对于方差齐的运用LSD法，而方差不齐的则使用Dunnett法。以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经由河南省中医药大学的生物统计学专家审核。
