2.1 丝素蛋白/纳米羟基磷灰石的热重分析结果 图1是5组丝素蛋白/纳米羟基磷灰石的热重曲线。

纳米羟基磷灰石的热重曲线平稳无明显变化，证明了纳米羟基磷灰石的热稳定性；其他各组均随着温度升高逐步发生了质量损失，室温至120 ℃归因于水分的蒸发，350-650 ℃归因于有机大分子丝素蛋白的彻底灼烧。10%，20%，30%组质量损失各自约为9.9%，18%，28%，与实验设计的配比基本吻合，40%组质量损失约为32%，与设计比例相差较大，说明丝素蛋白含量30%是丝素蛋白和纳米羟基磷灰石相互结合的饱和比例，因此本文中对丝素含量的讨论范围是0-40%(在进行丝素蛋白含量影响分析讨论时所列出的比例均为设计比例)。

2.2 丝素蛋白/纳米羟基磷灰石的傅里叶红外变换分析结果 图2是5组丝素蛋白/羟基磷灰石和丝素蛋白的红外对比谱图。

纳米羟基磷灰石曲线中3 420，1 033，957 cm^-1分别对应的是纳米羟基磷灰石的特征基团OH和PO₄的吸收峰；丝素蛋白曲线中1 624，1 514，1 234 cm^-1分别为丝素蛋白酰胺Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的吸收峰。这些特征峰也都出现在了其他4组样品中，并且没有其他新的特征峰，说明丝素蛋白与纳米羟基磷灰石发生吸附；而每个丝素蛋白/羟基磷灰石样品中的丝素蛋白酰胺Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的吸收峰都发生移动，基本上酰胺Ⅰ的吸收峰从1 624 cm-1移动到1 632 cm-1左右，酰胺Ⅱ的吸收峰从1 514 cm-1移动到1 528 cm-1左右，酰胺Ⅲ的吸收峰从1 234 cm-1移动到1 240 cm-1左右，特征吸收峰发生红移。特征峰的红移说明丝素蛋白/羟基磷灰石中纳米羟基磷灰石与丝素蛋白分子链之间产生了化学键合，其原因可能是丝素蛋白所含酰胺基(-CONH-)和侧链中的羧基(COO^-)、羟基(OH^-)带有负电荷，容易与带有正电荷的Ca²⁺发生正负电荷吸附，当纳米羟基磷灰石的Ca²⁺与-CONH-、 COO^-配位形成配位键时^[4]，导致矿化材料酰胺区吸收谱带的红移。

2.3 丝素蛋白/纳米羟基磷灰石的透射电镜分析结果 图3是5组丝素蛋白/羟基磷灰石颗粒的透射电镜图片。

图3 各组丝素蛋白/纳米羟基磷灰石的透射电镜图片 (×20 000)
Figure 3 Transmission electron microscope images of five groups of silk fibroin/nano-hydroxyapatite samples

由图3a可见，纳米羟基磷灰石晶粒形状为棒状，晶粒尺寸长度小于100 nm，宽度(35±4) nm，图3b中10%组纳米羟基磷灰石晶粒形状为针状，长度为(150±10) nm，宽度为(20±5) nm，图3c中20%组纳米羟基磷灰石晶粒形状为针状，长度为(150±10) nm，宽度为(15±5) nm，图3d中30%组纳米羟基磷灰石晶粒形状为针状，长度为(140±10) nm，宽度为(15±5) nm，图3e中40%组纳米羟基磷灰石晶粒形状为针状，长度为(130±10) nm，宽度为(10±2) nm。该结果说明丝素蛋白的加入明显调控了纳米羟基磷灰石晶粒的形貌和尺寸，晶粒由棒状变为针状，长度增长，宽度变窄，长径比明显增大，而丝素蛋白含量的变化对纳米羟基磷灰石晶粒尺寸的影响不明显。

纳米羟基磷灰石以丝素蛋白为基质，在丝素蛋白中有序排布[13]，丝素蛋白含量明显影响纳米羟基磷灰石晶粒在基质中的排布有序程度，图3a中纳米羟基磷灰石晶粒的分布无序、随机、杂乱；图3b和图3c显示10%、20%组样品中，纳米羟基磷灰石晶粒密集交错并呈现放射状有序分布；图3d显示从30%组样品开始纳米羟基磷灰石晶粒团聚并无序分布；图3e显示40%组样品中的纳米羟基磷灰石晶粒明显团聚并无序分布。上述现象说明丝素蛋白的加入对纳米羟基磷灰石晶体在有机大分子中的排布起到了调控作用，晶粒排布状态由随机分布变化为有序的密集交错，而后又团聚并无序分布，而当丝素蛋白含量在10%和20%时晶粒密集交错并呈现放射状有序分布；当丝素蛋白含量等于30%时，晶粒开始无序团聚；当丝素蛋白含量等于40%时，晶粒团聚并无序分布。该结果与本文前期研究结果基本一致。

2.4 丝素蛋白/纳米羟基磷灰石的X射线衍射分析结果 图4是5组丝素蛋白/羟基磷灰石的X射线衍射图谱。

由图可见，各样品的衍射图谱在衍射峰位置和强度上基本一致，随着丝素蛋白含量的增加并未出现其他晶相的衍射峰，所有衍射峰归属于纳米羟基磷灰石晶相。纯纳米羟基磷灰石的(002)面的衍射峰峰型尖锐，(211)和(300)面各自都能看到尖锐的特征峰；加入丝素蛋白(10%-40%)后，样品的(002)面的衍射峰峰型保持尖锐，但(211)和(300)面各自对应的衍射峰出现宽化导致几乎完全重叠合并，说明丝素蛋白的加入对纳米羟基磷灰石晶格常数产生了影响。表1是5组丝素蛋白/纳米羟基磷灰石颗粒的晶胞参数及平均结晶尺寸。表中数据显示，丝素蛋白/纳米羟基磷灰石相较于纯纳米羟基磷灰石无论在a轴方向或是c轴方向平均结晶尺寸都有所增长，在丝素蛋白含量不超过20%时这种现象明显；L^ac/L^aa值的增高可以看出，丝素蛋白的加入促进纳米羟基磷灰石晶体生长的各向异性，而c轴生长更为明显，上述结果说明丝素蛋白的加入对纳米羟基磷灰石晶体生长具有明显的调控作用，在丝素蛋白的调控下纳米羟基磷灰石晶体生长在c轴方向上具有高度择优取向的能力，而丝素蛋白含量的增加对晶体生长的各向异性无明显影响，该结果与透射电镜图片中丝素蛋白的加入使晶粒形貌由短棒状变化为针状，以及丝素蛋白含量对晶粒尺寸影响不明显的结果一致。

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体内骨组织是受细胞高度调节控制生长而成的生物矿化组织，由有机质和无机质两大部分构成。有机质主要成分是骨胶原纤维，无机质的主要化学成分是羟基磷灰石。合成的胶原/羟基磷灰石复合材料被广泛作为骨组织替代修复材料进行研究，并取得了较大进展，但胶原蛋白自身的昂贵价格和炎症反应又局限了其应用。
针对这一问题，蚕丝丝素蛋白作为一种天然提取蛋白，引起关注并成为研究热点。丝素蛋白由于其良好的生物相容性、生物可降解性，力学性能优良，对细胞的黏附、扩增、分化作用好等优势，近几年被逐渐应用于生物替代材料和组织工程材料，特别是丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料正在被探索用来作为骨组织修复材料^[1]。
丝素蛋白/羟基磷灰石纳米复合材料的制备方法^[2-5]、性能特点及应用形式等方面已经有了大量的研究^[6-13]，现有结果表明浓度、pH值等参数会显著影响丝素蛋白/羟基磷灰石的晶体结构^[14-15]，作者的工作表明，丝素蛋白含量对丝素蛋白/羟基磷灰石的性能与结构有一定影响，体现在丝素蛋白/羟基磷灰石中的纳米羟基磷灰石以丝素蛋白为基质的排布方式受到丝素蛋白含量的影响，但这种影响仅仅是通过透射电镜对微观形貌进行观察得到的结论，本文将针对这一结论，通过多种手段详细讨论丝素蛋白含量对纳米羟基磷灰石晶体结构的调控作用，并总结这种调控作用的规律。

设计：观察性实验。
时间及地点：于2011年9月至2012年1月在纳米技术及应用国家工程研究中心完成。
材料：桑蚕茧由湖州市农业科学研究院提供，Na2CO3、CaCl2、NH4OH、(NH4)2HPO4、无水乙醇等试剂购自国药集团化学试剂有限公司(上海)，均为分析纯。热重分析仪(STAPT 1 600，LINSEIS，德国)；傅里叶红外光谱仪(Nicolet 6 700，Thermo FisherScientific，美国)；透射电镜(JEM-2 100F，Joel，日本)；X射线粉末衍射仪(D/max-2 600/pc, RIGAKU，日本)。
方法：
材料制备：参考本文前期工作的制备工艺[13]，合成了一系列不同丝素蛋白/纳米羟基磷灰石质量比率(设计比率分别为0，10%，20%，30%，40%)的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石纳米复合材料。其中丝素蛋白含量为0时，样品是纯纳米羟基磷灰石。现将过程简述如下：首先将购买的桑蚕茧用0.5%的Na2CO3水溶液进行脱胶处理，烘干后得到干燥的丝素纤维；然后分别称取1.12， 2.51，4.3，6.69 g(分别对应设计比率10%，20%，30%，40%)的丝素纤维，置入加热到75 ℃的CaCl2-CH3CH2OH-H2O三元溶剂(摩尔比为1∶2∶8)至完徐全溶解，其中三元溶剂中CaCl2为11.10 g。然后向该溶解液中逐滴加入(NH4)2HPO4溶液，体系中出现白色沉淀，继续在温度75 ℃和搅拌条件下反应24 h，通过加入氨水维持整个体系的pH值为10左右。最后将白色沉淀反复清洗，冻干，得到不同丝素蛋白含量的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石粉末样品。
材料表征：热重分析仪测试丝素蛋白/纳米羟基磷灰石有机成分质量分数，测试温度范围是室温-700 ℃；傅里叶红外光谱仪对丝素蛋白和丝素蛋白/纳米羟基磷灰石进行红外光谱测试，波长范围4 000-400 cm-1；透射电镜对丝素蛋白/羟基磷灰石的微观形貌进行观察；X射线粉末衍射仪分析丝素蛋白/纳米羟基磷灰石晶体结构，CuKα激发，4 (°)/min步长。
主要观察指标：不同质量比丝素蛋白/羟基磷灰石材料的表征结果。
统计学分析：采用SPSS 13.0统计学软件包对数据进行t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

以前工作表明，仿生矿化的材料界面示意图如图5a所示^[5]，丝素在三元体系的溶解过程中，在高浓度的Ca²⁺作用下丝素蛋白的二级结构由无规线团转变为β-折叠，促使丝素蛋白丝肽链上的NH^-和COO^-等基团外露，Ca²⁺与丝素蛋白酰胺键上的氧通过配位键形成环状络合物，并且通过羟基与NH^-形成氢键与丝素蛋白结合形成丝素蛋白-Ca²⁺配合物，为纳米羟基磷灰石的成核提供活性位点；当(NH⁴)²HPO⁴溶液逐滴加入到溶解了丝素蛋白的三元体系中时，PO₄^3-在丝素蛋白-Ca²⁺活性位点处不断积聚至饱和时与Ca²⁺成核，形成纳米羟基磷灰石微晶，并在此位点上微晶开始生长^[4,13]。由于Ca²⁺和丝素蛋白丝肽链之间强烈的化学键合，纳米羟基磷灰石微晶的成核与生长都以丝素蛋白为模板，在丝素蛋白的调控下纳米羟基磷灰石晶体生长沿c轴明显择优取向的结果，纳米羟基磷灰石微晶沿着丝素蛋白长链的方向定向生长，纳米羟基磷灰石晶体自身沿c轴方向。丝素蛋白/纳米羟基磷灰石的形成是以丝素蛋白-Ca²⁺为活性位点并沿着丝素蛋白长链方向取向生长，同样的CaCl₂-CH₃CH₂OH- H₂O三元溶剂溶解不同质量的丝素蛋白导致的结果仅可能是丝素蛋白-Ca²⁺活性位点的数量不同，丝素蛋白与Ca²⁺的化学键合作用并不会改变，因此丝素蛋白含量的变化对纳米羟基磷灰石晶体形貌和尺寸的影响不明显。   

 

丝素蛋白含量的变化对纳米羟基磷灰石在丝素蛋白基质中的排布有序程度有明显影响，其原因可能是丝素蛋白-Ca²⁺活性位点的不足、饱和或者过量。根据本文中热重分析结果，丝素蛋白含量30%左右是丝素蛋白和纳米羟基磷灰石相互结合的饱和质量分数，当丝素蛋白含量小于30%时，进入反应体系的丝素蛋白全部与Ca2+吸附，参与丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合物的形成反应，当超过30%时即使再多加入丝素蛋白进入反应体系中也不能与Ca²⁺吸附，而是残留在溶液当中；本文中透射电镜结果还显示出的丝素蛋白含量≤20%时，纳米羟基磷灰石晶粒密集交错团簇并呈现放射状分布，当丝素蛋白含量为30%和40%时，纳米羟基磷灰石晶粒团聚并无序分布。根据上述结果建议丝素蛋白含量对纳米羟基磷灰石晶体在基质中的排布有序度的调控作用示意图如图5b-e：在丝素蛋白含量不超过30%的范围内，进入反应体系的丝素蛋白全部参加反应，当丝素蛋白含量为10%时(见图5b)，由于丝素蛋白含量的偏少，丝素蛋白-Ca²⁺活性位点数量不足，PO₄³-与Ca²⁺成核的纳米羟基磷灰石晶体有一部分以丝素蛋白长链为模板自组装沿长链方向生长，并呈现有序放射状分布；当丝素蛋白含量为20%时(见图5c)，丝素蛋白-Ca²⁺活性位点数量与足够的PO₄³-恰好饱和，所有的纳米羟基磷灰石晶体以丝素蛋白长链为模板自组装沿长链方向生长，纳米羟基磷灰石晶体有序放射状分布；当丝素蛋白含量为30%时(见图5d)，丝素蛋白量足够与纳米羟基磷灰石晶体上所有的Ca²⁺键合，纳米羟基磷灰石晶体与多条丝素蛋白链结合，导致丝素蛋白链和纳米羟基磷灰石晶体无规团聚；当丝素蛋白含量为40%时(见图5e)，部分丝素蛋白与纳米羟基磷灰石晶体上所有的Ca²⁺键合，纳米羟基磷灰石晶体与多条丝素蛋白链结合，导致丝素蛋白链和纳米羟基磷灰石晶体无规团聚，反应体系内过量的丝素蛋白分子将残留在溶液体系中。   

结论：30%的丝素蛋白含量可能是丝素蛋白与Ca²⁺的饱和吸附临界点，当丝素蛋白含量小于30%时，进入反应体系的丝素蛋白全部与Ca²⁺吸附，参与丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合物的形成反应，当超过30%时即使再多加入丝素蛋白进入反应体系中也不能与Ca²⁺吸附而是残留在溶液当中；丝素蛋白的加入对纳米羟基磷灰石晶体的成核和生长具有明显的调控作用：促进纳米羟基磷灰石晶粒沿c轴高度择优生长，长径比增大，形貌由短棒状调控为针状；丝素蛋白含量对纳米羟基磷灰石晶体成核和生长的影响较微弱，但对晶粒在丝素蛋白基质的有序排布有明显的调控作用：当丝素蛋白含量等于10%和20%时，纳米羟基磷灰石晶粒以丝素蛋白长链为模板自组装沿长链方向生长并呈现有序放射状分布；当丝素蛋白含量等于30%和40%时，纳米羟基磷灰石晶粒在丝素蛋白基质中团聚并且无序分布。  

基金资助：上海市科学与技术委员会基金资助项目(1052nm03201)；国家重点基础研究发展计划项目(2009CB93000)。
致谢：感谢纳米技术及应用国家工程研究中心何丹农教授提供实验场所和技术性帮助。
作者贡献：徐宁、陈玉云进行实验设计及实施，许国华进行实验评估及资料收集，徐宁、陈玉云共同成文，钟建、叶晓健审校，徐宁、许国华、叶晓健对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

1     针对目前丝素蛋白含量对丝素蛋白/纳米羟基磷灰石制备工艺在影响方面的报道较少，文章在此方向做了详细的研究，并进行了机制讨论。
2     实验结果发现，丝素蛋白含量对纳米羟基磷灰石晶体的成核和生长影响微弱，但对晶粒在丝素蛋白基质的有序排布有明显的调控作用。

全文见《中国组织工程研究》杂志2012年16卷    期。

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