2.1   实验动物数量分析   纳入30只新西兰兔，随机分为3组，所有动物均未发生意外，并顺利通过实验全程。
2.2   动物的一般情况   仰卧位睡眠时，对照组呼吸匀速通畅，无觉醒及呼吸暂停；OSA组打鼾较重，易觉醒，呼吸暂停时唇、耳部发绀；下颌前移矫治器组呼吸大体平稳，偶有轻微打鼾现象，见图1。



2.3   上气道CT结果    与对照组比较，OSA组的软腭1/4点、1/2点和3/4点处上气道横截面积以及上气道矢状向间隙明显减小，而下颌前移矫治器组和对照组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。



2.4   多导睡眠监测结果   根据记录，对照组呼吸平稳，OSA组有不同程度的呼吸困难或低通气，伴胸腹腔波动增加、呼吸暂停、低通气指数上升、动脉血氧饱和度和睡眠效率下降。下颌前移矫治器组仅偶尔出现呼吸困难或低通气。同时，下颌前移矫治器组的低通气指数、动脉血氧饱和度和睡眠效率均显著优于OSA组，见表2。



2.5   颏舌肌线粒体超微结构比较   对照组线粒体形态结构正常，OSA组内部结构破坏严重，下颌前移矫治器组内外膜结构完整，水肿程度较OSA组有明显减轻，接近正常对照组，见图2。



2.6   氧化应激水平   颏舌肌组织内和血浆内8-异前列腺素水平呈显著正相关(r=0.678)。OSA组血浆及颏舌肌组织内8-异前列腺素水平明显高于对照组，下颌前移矫治器组较OSA组显著降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)。

OSA组颏舌肌组织内丙二醛水平与对照组相比显著升高，下颌前移矫治器组比OSA组明显降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)，上述指标下颌前移矫治器组与对照组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3及图3-5。















2.7   抗氧化能力   OSA组SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD活性均低于对照组和下颌前移矫治器组(P < 0.05)。OSA组谷胱甘肽水平、过氧化氢酶和琥珀酸脱氢酶活性与对照组相比均明显降低(P < 0.05)。上述指标下颌前移矫治器组与对照组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4及图6，7。

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阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea，OSA)以睡眠期间反复发生呼吸暂停或低通气为特征，发病原因与上呼吸道塌陷、阻塞所致的通气不足有关。随着生活水平的提高，OSA发病率也随之提升，OSA长期发病可危害人类身体各个系统的健康，因此开展对OSA的研究对人类健康具有重要意义。口咽腔由软组织构成，在OSA过程中易形成负压，致上气道塌陷，而颏舌肌的收缩可抵抗此塌陷，对保持上气道通畅至关重要[1-2]。

OSA与颏舌肌功能有密切联系。目前研究多为颏舌肌功能异常对OSA发病的影响，而对于OSA致颏舌肌结构功能损伤及其机制的研究还不深入。作者所在课题组前期研究发现，OSA可引起颏舌肌的损伤和功能障碍，但其中损伤机制并不明确[3]。颏舌肌正常功能发挥与线粒体密切相关，线粒体通过呼吸链进行电子传递生成ATP供能，其结构异常与颏舌肌功能密切相关。活性氧已被广泛证实主要来源于线粒体呼吸链[4]，氧化应激主要因活性氧自由基产生过多而对组织造成一系列损伤，且多种研究表明OSA使活性氧簇含量增加[5-6]。慢性间断性低氧为OSA重要的病理特征，研究证实，慢性间断性低氧可通过抑制抗氧化酶系统提高颏舌肌内氧化应激水平[7]，然而OSA引起颏舌肌的结构功能损伤是否与氧化应激相关未见报道。

目前，下颌前移矫治器(mandibular advancement device，MAD)可治疗轻中度OSA和持续气道正压通气不耐受患者，具有无创、舒适、价格低、疗效好的优点[8-10]。下颌前移矫治器治疗OSA的研究目前大多数关注治疗后主观症状及气道大小的改变，其中颏舌肌的作用尚不完全清楚，有学者认为下颌前移矫治器治疗使颏舌肌的肌电活动增加，可改善OSA症状[11]，但OSA及下颌前移矫治器治疗对颏舌肌线粒体结构的影响及相关机制的探讨并未见报道。同时，之前有关OSA动物模型的建立是放在低压氧仓，此种模型忽略了上气道的改变；而对临床OSA患者的研究则因为病因病程不易判断颏舌肌异常是OSA发生的病因还是OSA引起的结果。

此次实验采取LU等[12-13]创立的新西兰兔OSA模型，能模拟OSA患者的临床症状及发病程度，并具有“慢性间断性低氧/高碳酸血症、由于机械阻塞导致的胸腹运动增强以及睡眠中断”3个OSA典型特征，弥补了其他模型的不足。此次实验旨在研究下颌前移矫治器治疗前后对OSA颏舌肌线粒体超微结构的影响，并探讨氧化应激是否可使OSA致颏舌肌损伤。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照实验，两组间差异比较用LSD检验，多组间用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2013 年12月至2020年12月在河北医科大学口腔医院(河北省口腔医学重点实验室)完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   30只雄性6月龄纯种新西兰大白兔，体质量3.0-3.5 kg，由河北医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。排除先天性OSA或上气道狭窄的影响，将其根据完全随机设计分3组，即对照组、OSA组和下颌前移矫治器组，每组10只。OSA组与下颌前移矫治器组成功建立阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征动物模型后，下颌前移矫治器组佩戴下颌前移矫治器。

实验方案经河北医科大学动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   主要药品及试剂   下颌前移矫治器为自制，用自凝牙托水和自凝牙托粉制作；齿科用蜡片，上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂；贺利氏印模材变色龙型，贺利氏古莎齿科有限公司；自凝牙托粉，上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂，自凝牙托水，上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂；丙二醛测定试剂盒、谷胱甘肽测定试剂盒、过氧化氢酶测定试剂盒、琥珀酸脱氢酶测定试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；兔8-异前列腺素 ELISA试剂盒，Bio-Swamp公司。
1.4   方法   
1.4.1   OSA动物模型的建立   经OSA组和下颌前移矫治器组兔耳缘静脉注射1%戊巴比妥钠(20 mg/kg)麻醉成功后，在距离兔软硬腭交界1.5 cm的软腭黏膜下肌层注射聚丙烯酰胺水凝胶混合物，看到局部黏膜表面隆起，直至阻力加大至难以再进入时停止[13]。对照组不做任何处理。完成建模后，通过仰卧位上气道螺旋CT(Lightspeed GE16，美国邦德)扫描和多导睡眠仪(美国邦德Monet型)来检测建模是否成功。

建模成功后，下颌前移矫治器组佩戴下颌前移矫治器，用自凝牙托水和自凝牙托粉制作，调整角度，使其前斜面和上前牙呈30°角，用玻璃子将其与上前牙黏固，引导下颌前移3.0-4.0 mm，咬合打开2.0-3.0 mm，确保动物的舒适度[14-15]。建模完成后，再应用仰卧位上气道螺旋CT扫描和多导睡眠监测来检测下颌前移矫治器治疗OSA的效果。测量软腭后上气道间隙：软腭最上端、1/4点、1/2点、3/4点及软腭最下点处上气道矢状向直径及横截面积。具体操作参考作者所在实验室模型建立方法[12]。

1.4.2   仰卧位睡眠   建模成功后，每日上午均灌注10%水合氯醛进行催眠，剂量为5.0-6.0 mL/kg，诱导其仰卧位睡眠，每日4-6 h，连续8周。

1.4.3   标本采集及处理   仰卧位睡眠8周后，取兔耳缘静脉血1.5 mL，4 000 r/min，离心5 min，取上清，-70 ℃保存备用；分离颏舌肌后立即离断，在低温下(置于生物冰袋上)将颏舌肌组织沿肌纤维方向制成大小为1 mm×1 mm×3 mm的新鲜组织块，立即固定于4%戊二醛中；取肌组织并将其迅速投入液氮中，-70 ℃保存备用。
1.4.4   透射电镜标本制备及观察   将颏舌肌新鲜组织块经前固定、漂洗、后固定、漂洗、脱水、浸透后在胶囊或包埋板中包埋，放入烤箱聚合，切成厚约50 nm的超薄切片并电子染色，置于小铜网上，用透射电镜观察组织超微结构并照相。电镜观察的颏舌肌标本处理步骤：①取材：暴露颏舌肌后，迅速离断，即刻用锋利刀片在低温下(置于生物冰袋上)将颏舌肌组织沿肌纤维方向制取成长条状若干，大小为1 mm×1 mm×3 mm的新鲜组织块，并立即投入4%戊二醛固定液中。②4%戊二醛前固定，1/15 mol/L PBS漂洗，1%四氧化锇后固定，1/15 mol/L PBS漂洗10-15 min，逐级丙酮 脱水，100%丙酮浸透，然后进行包埋，聚合，最后经超薄切片和 电子染色，最后置于透射电子显微镜下观察组织超微结构并照相。
1.4.5   氧化应激水平测定   采用ELISA法对兔血浆和颏舌肌组织的8-异前列腺素水平进行测定；应用硫代巴比妥酸法(TBA法)对兔颏舌肌组织的丙二醛水平进行测定。
1.4.6   抗氧化能力水平测定   应用黄嘌呤氧化酶法与抽提法测定兔颏舌肌组织的总超氧化物歧化酶(T-SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的活性；应用二硫代二硝酸苯甲酸显色法检测颏舌肌组织内谷胱甘肽的水平；用可见光法检测颏舌肌组织内过氧化氢酶的活性；通过测定2，6-二氯靛酚钠的还原速度算出琥珀酸脱氢酶的活性。 
1.5   主要观察指标   建模成功并诱导实验动物睡眠8周后，透射显微镜下观察颏舌肌组织超微结构；ELISA法测定氧化应激水平；应用黄嘌呤氧化酶法与抽提法、二硫代二硝酸苯甲酸显色法、可见光法测定抗氧化能力水平。
1.6   统计学分析   应用SPSS 13.0统计学软件进行处理，统计描述用x±s表示。两组间差异比较用LSD检验，多组间用单因素方差分析，检验水准为α=0.05。文章统计学方法已经河北医科大学生物统计学专家审核。

颏舌肌是上气道的“安全肌”，其功能异常时上气道塌陷阻塞，引发OSA；同时OSA的发生也会引发颏舌肌损伤，从而形成恶性循环，疾病不断进展[16-17]。作者所在课题组前期研究表明OSA可造成颏舌肌结构和功能的变化，导致颏舌肌疲劳性增加，这可能与慢性间断性低氧与颏舌肌超负荷运动有关。线粒体是细胞呼吸和氧化磷酸化的主要部位[18]，可产生活性氧，也是氧化应激损伤的靶点，过量的活性氧簇等高活性分子堆积或清除不足使线粒体肿胀，氧化与抗氧化系统失衡从而引起组织损伤[19]。当线粒体损伤时，氧化应激水平显著增加。线粒体与骨骼肌的正常功能密切相关，颏舌肌是骨骼肌，因此，线粒体结构和功能异常可引起其细胞功能障碍。可通过检测骨骼肌活性氧含量来反映氧化应激水平，但活性氧性质十分活泼，难以准确检测。丙二醛是生物膜脂质过氧化代谢产物之一[20]，其含量与活性氧水平及脂质过氧化程度相符；8-异前列腺素稳定，特异性好，是检测活性氧水平的金标准，可精确测定含量，因此常以丙二醛和8-异前列腺素检测氧化应激水平。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等则是机体自身抗氧化防御机制中的主要抗氧化酶。此次研究进一步探讨线粒体的超微结构和氧化代谢在OSA引起颏舌肌结构及功能异常中的作用及下颌前移矫治器治疗后的
影响。
3.1  下颌前移矫治器治疗OSA对颏舌肌线粒体结构的影响   此次研究显示，电镜下OSA组线粒体超微结构发生肿胀、嵴断裂、嵴膜融合等异常。线粒体是细胞有氧呼吸和产能的场所，对缺氧非常敏感[21]，故推测OSA兔颏舌肌结构损伤与慢性间断性低氧密切相关。此次实验中OSA组建模成功后，诱导其仰卧位睡眠，模拟OSA患者的睡眠，使其长时间处于低氧状态下，其分解代谢加强，颏舌肌蛋白质分解，致肌肉形态结构、功能异常。有研究表明，低氧条件可刺激活性氧或自由基生成[22]，且在较高的活性氧水平下，线粒体通透性转换孔开口变大，可能使活性氧释放爆发，氧自由基过多损伤细胞，以致脂质过氧化，破坏细胞膜及细胞器，最终致线粒体结构破坏[23]。

下颌前移矫治器组与对照组线粒体结构相似，表明下颌前移矫治器治疗可在一定程度上保护线粒体的结构完整。下颌前移矫治器可扩张上气道，以拮抗低氧，通过保护颏舌肌功能有效改善OSA引起的线粒体功能障碍，使线粒体功能结构状况好转，从而有效缓解OSA症状。
3.2   下颌前移矫治器治疗OSA颏舌肌功能结构损伤的机制探讨
3.2.1   氧化应激途径对OSA颏舌肌的致病性   此次研究显示OSA会损坏颏舌肌线粒体结构，推测氧化应激途径与其损伤发生有关。因而此次研究进一步观察血清及颏舌肌中的氧化应激水平，发现OSA组颏舌肌中丙二醛水平、8-异前列腺素水平与对照组相比显著升高，且血清中8-异前列腺素水平与颏舌肌中成正相关，提示OSA可引起颏舌肌组织内脂质过氧化，氧化应激增强。研究表明，OSA促进活性氧生成，引起氧化应激有多种机制：OSA特有的慢性间断性低氧是高频缺氧/再氧的反复交替，近似缺血-再灌注损伤，能激发黄嘌呤氧化酶途径产生大量的活性氧[24]；缺氧后复氧促使白细胞活化，同时促进炎症反应[25]，为了弥补缺氧，机体颏舌肌长期反复剧烈收缩，均可增加活性氧的产生[26]；OSA患者交感神经活性提高，使儿茶酚胺含量增多[27]，OSA患者睡眠结构紊乱，机体处于高代谢状态也能使活性氧增多；此外，OSA致颏舌肌线粒体结构破坏，线粒体酶活性降低，氧不能被充分利用形成氧自由基。最终，增多的活性氧和过氧化物使颏舌肌的结构和功能受损。此组实验模型除具备慢性间断性低氧、用力呼吸、睡眠中断等OSA最典型特征外，也能体现因睡眠中断、气道塌陷等引起颏舌肌反复收缩用力呼吸对肌肉的影响，符合OSA引起氧化应激的表现。有学者发现氧化应激可降低肌肉收缩力、影响其特异性蛋白的表达，破坏肌肉系统[28]，导致肌纤维功能紊乱和骨骼肌细胞ATP减少，提示氧化应激在OSA导致的肌肉损伤中起重要作用。
3.2.2   抗氧化系统对OSA颏舌肌的致病性   抗氧化能力是氧化应激的标志物，其降低意味着氧化应激状态的加剧。此次实验发现OSA组中兔颏舌肌的谷胱甘肽、SOD、过氧化氢酶、琥珀酸脱氢酶活性显著降低，提示OSA能减弱肌细胞的抗氧化能力。酶抗氧化系统在抵御自由基损害细胞和线粒体中发挥着关键效用：SOD为其中最重要的一员，构成细胞抗氧化的第一道防线，SOD可通过催化、清除自由基并干扰其链式反应，缓解氧化应激水平[29]；过氧化氢酶可持续清除体内过氧化氢，防止其生成羟自由基来保护细胞；Mn-SOD可反映线粒体清除活性氧的能力，Mn-SOD在核基因编码后，在线粒体内加工成熟并保存[30]。而在非酶抗氧化系统中，谷胱甘肽能依赖巯基还原体内自由基，促使自由基分解排出，拮抗过氧化物的损害；并可通过保护细胞中蛋白质等生物大分子，减轻自由基造成的损伤[31] ，还可通过活性巯基保护体内蛋白酶巯基不被氧化破坏来保护酶活性[32]。氧化应激可导致细胞谷胱甘肽水平下降[33]，氧自由基增加，线粒体膜通透性变大，最终导致线粒体功能紊乱和凋亡。LAVIE等[34]观察到OSA患者已知的抗氧化能力标志物paraxonase-1(PON1)水平降低；CHRISTOU等[35]使用Trolox当量抗氧化能力测定法观察到OSA患者抗氧化能力减弱，与此次研究结果相符。由此，结合此次实验观察所见线粒体结构变化和抗氧化系统功能降低，作者也可推断OSA能损伤颏舌肌的抗氧化系统，造成对线粒体的一系列破坏。基于上述结果，可推断OSA通过氧化应激反应损害颏舌肌的结构与功能。
3.2.3   下颌前移矫治器治疗OSA对氧化应激和抗氧化系统的作用   此次研究结果显示，下颌前移矫治器治疗可减弱OSA兔全身以及颏舌肌组织中的氧化应激程度。BARCELÓ等[36]通过测量血浆的总抗氧化剂状态、维生素A、E和γ-谷氨酰转移酶的水平，发现OSA患者的抗氧化能力减弱，而持续气道正压治疗可改善此种情况，说明改善通气可提高OSA患者抗氧化能力。此次实验中，下颌前移矫治器治疗可使兔上气道开放，减缓兔睡眠时间断性缺氧状态，明显减少OSA造成的颏舌肌氧化损害，并提高颏舌肌组织内SOD及过氧化氢酶活性和谷胱甘肽水平，以抑制氧化损伤，预防或缓解颏舌肌线粒体的结构和功能损伤。
3.3   下颌前移矫治器治疗对“多导睡眠监测结果”影响的分析讨论   多导睡眠监测纪录中可见，OSA组均出现了不同程度的低通气或呼吸暂停，低通气指数、动脉血氧饱和度和睡眠效率均受到影响；下颌前移矫治器组的低通气指数、动脉血氧饱和度和睡眠效率均显著优于OSA组(P > 0.05)。基于前面讨论，可以推测下颌前移矫治器治疗在一定程度上可以保护线粒体结构完整和减轻OSA兔全身以及颏舌肌组织中氧化应激程度。以上都可表明使用下颌前移矫治器可对OSA兔有一定治疗效果，同时下颌前移矫治器组兔佩戴下颌前移矫治器后，下颌可被引导进行前伸，打开上气道，防止阻塞发生，缓解发病症状，改善低通气和呼吸暂停的情况，使得多导睡眠监测结果优于OSA组。

综上，此次研究发现，OSA引起颏舌肌线粒体结构紊乱，下颌前移矫治器作为治疗方法通过阻断低氧可预防、缓解颏舌肌线粒体损伤，改善颏舌肌线粒体功能。OSA可诱导颏舌肌组织过度的氧化应激，从而损伤线粒体结构，而下颌前移矫治器治疗能降低颏舌肌的氧化应激，保护线粒体损伤。此次实验为进一步探讨OSA与由线粒体超微结构改变而引起的动力学异常的关系提供了新思路，并探讨了下颌前移矫治器治疗改善线粒体结构功能的相关机制，为治疗OSA提供了新的依据和方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
阻塞性睡眠呼吸暂停：是一种常见的严重危害人类健康的睡眠紊乱性疾病，由于睡眠不足而引起患者晨起头晕、乏力、白天嗜睡、注意力不集中、记忆力减退等，严重影响患者的生活质量。长期发病不治疗可引起高血压、心血管疾病，以及脑、肺、肾各系统病变，严重时可能危及患者的生命，甚至发生猝死。
颏舌肌：其解剖位置为起于下颌体内侧近中点处的上颏棘，肌纤维呈扇形向后延伸并向舌内放散，其运动主要受舌下神经支配，主要作用为控制舌的运动，颏舌肌收缩可使舌骨向前上移动，并牵拉舌体向前和向对侧运动，从而扩张咽腔并稳定上气道，颏舌肌为最重要的上气道扩张肌，被称为上气道的“安全肌”。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

阻塞性睡眠呼吸暂停以睡眠期间反复发生呼吸暂停或低通气为特征，发病原因与上呼吸道塌陷、阻塞所致的通气不足有关。随着生活水平的提高，阻塞性睡眠呼吸暂停发病率也随之提升，阻塞性睡眠呼吸暂停长期发病可危害人类身体各个系统的健康，因此开展对阻塞性睡眠呼吸暂停的研究对人类健康具有重要意义。口咽腔由软组织构成，在阻塞性睡眠呼吸暂停过程中易形成负压，致上气道塌陷，而颏舌肌的收缩可抵抗此塌陷，对保持上气道通畅至关重要。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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