2.1   Ad-BMP-2/EGFP转染兔骨髓间充质干细胞   转染后    24 h，荧光显微镜观察到Ad-EGFP及Ad-BMP-2 /EGFP组转染效率均超过90%，空白对照组无荧光蛋白表达，以感染复数为100转染骨髓间充质干细胞，其细胞生长状态良好，见图1。



2.2   骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的表达   转染后48 h，通过RT-qPCR和Western blot检测骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的表达，见图2和图3。与空白对照组和Ad-EGFP组相比，Ad-BMP-2/EGFP转染组骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白表达明显增多(P < 0.05)，说明通过转染外源性人骨形态发生蛋白2基因后能够显著提高骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白mRNA及蛋白表达水平。







2.3   Ad-BMP-2/EGFP促进兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化   成骨诱导7 d，与空白对照组[(6.83±0.87) U/g]和Ad-EGFP组[(6.40±1.25) U/g]相比，Ad-BMP-2/EGFP组碱性磷酸酶表达量[(7.89±0.68) U/g]明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)。成骨诱导14 d，免疫组织化学检测显示Ad-BMP-2/EGFP组Ⅰ型胶原蛋白阳性表达，而空白对照组和Ad-EGFP组不表达Ⅰ型胶原蛋白，见图4。成骨诱导21 d，茜素红S染色显示  Ad-BMP-2/EGFP组出现较多的矿化结节，并被染色为红色，而空白对照组和Ad-EGFP组仅形成了少量钙结节，见图5，说明骨形态发生蛋白2过表达增强了兔骨髓间充质干细胞向成骨分化的能力。







2.4   Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达   转染后48 h采用Western blot检测Wnt信号通路中β-catenin、p-β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、cyclin D1、c-myc和Runx2蛋白的表达水平，见图6。与空白对照组、Ad-EGFP组相比，Ad-BMP-2/EGFP组骨髓间充质干细胞中β-catenin、cyclin D1、Runx2和c-myc蛋白表达水平显著增加(P < 0.05)，而GSK3β和p-GSK3β蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)。结果表明，Ad-hBMP-2/EGFP可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路从而诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

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近年来，骨组织工程在治疗骨、软骨组织缺损方面具有良好前景[1]。已有研究证实骨形态发生蛋白2可以诱导多能干细胞表达Ⅰ型胶原蛋白，促进干细胞向成骨细胞分化[2]，是骨组织工程中研究最广泛的细胞因子之一，已应用于临床促进骨形成。

骨形态发生蛋白的制备方法主要包括纯化骨基质或通过基因工程合成，但操作复杂、效率低[3]。目前临床上诱导新骨生成的主要方法是将骨形态发生蛋白2与骨移植材料复合后直接作用于靶区。但是，天然骨形态发生蛋白诱导成骨分化呈剂量依赖性，并且诱导过程中难以可控释放，局部蛋白量爆炸性释放可能导致局部组织炎症反应[4]。如何获得内源性骨形态发生蛋白2在靶区的持续维持有效浓度是目前研究的热点。

基因转染技术是将目的基因导入靶细胞，可以规避重组细胞因子在目标区域爆发性释放[5]。前期实验用腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因成功转染至兔骨髓间充质干细胞，并发现最适感染复数为100[6]。据此，该实验继续利用腺病毒载体将骨形态发生蛋白2转染到兔骨髓间充质干细胞中，分析骨髓间充质干细胞成骨潜能变化及其可能机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   体外细胞实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2019年10月至2020年7月在昆明医科大学附属曲靖医院中心实验室完成。
1.3   材料   低糖DMEM、胰蛋白酶和胎牛血清(美国Hyclone公司)；MTT、维生素C、β-磷酸甘油、地塞米松(韩国BIOSHARP公司)；辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG、DAB显色试剂盒(北京ZSGO-Bio公司)；小鼠抗兔Ⅰ型胶原蛋白抗体(武汉巴山生物技术有限公司)；骨形态发生蛋白2、β-catenin、p-β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、Runx2、cyclinD1、c-myc抗体(美国Bioworld公司)；cDNA合成试剂盒(美国Invitrogen公司)；SYBR Green PCR Master Mix(美国ABI公司)；茜素红(中国国药集团化学试剂有限公司)；PCR引物由美国Invitrogen公司设计合成。兔骨髓间充质干细胞、腺病毒载体(Ad-EGFP、Ad-BMP2)由桂林医学院附属医院急诊创伤科李强教授赠送。
1.4   实验方法
1.4.1   腺病毒介导骨形态发生蛋白2、增强型绿色荧光蛋白基因转染骨髓间充质干细胞   第3代骨髓间充质干细胞以5×104个/孔接种于6孔板，在含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM完全培养基中复苏培养，分为空白对照组、Ad-EGFP组(阴性对照组)、Ad-BMP-2/EGFP组(实验组)，细胞培养70%-80%融合时，将培养基替换为无血清L-DMEM培养基，Ad-EGFP组、Ad-BMP-2/EGFP组分别以Adv-EGFP、Adv-BMP-2/EGFP按感染复数为100感染骨髓间充质干细胞24 h后，换含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM完全培养基培养24 h，荧光显微镜下观察细胞转染效率及细胞生长情况。
1.4.2   qRT-PCR检测人骨形态发生蛋白2基因表达   转染后 48 h，TRIzol法提取各组骨髓间充质干细胞中总RNA，反转录试剂盒进行cDNA合成并储存。使用ABI 7500 Real-time PCR仪器和SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行定量PCR。PCR反应体系为：SYBR Green® PCR Master Mix 10 μL，上游引物  1 μL，下游引物1 μL，cDNA 1 μL，双蒸水7 μL，PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，40个循环；60 ℃ 1 min。人骨形态发生蛋白2基因表达水平采用2-ΔΔCt方法分析，2-ΔΔCt=2-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]处理组-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]对照组。
根据NCBI数据库中的人骨形态发生蛋白2基因序列，设计并合成了PCR引物，见表1。

1.4.3   Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达   转染后48 h，直接用RIPA提取各组细胞蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度，30 μg样本煮沸10 min，离心10 s，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，在浓缩胶中80 V电泳60 min，分离胶中120 V电泳30 min，90 A下电泳转印50 min，然后转移到5%脱脂牛奶中4 ℃封闭过夜，与一抗骨形态发生蛋白2、β-catenin、p-β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、Runx2、cyclinD1、c-myc抗体在室温下摇床振荡孵育1 h，与二抗在室温下孵育1 h，洗涤3次，每次10 min，ECL发光液孵育1 min，曝光5 min，凝胶成像仪(JS-780)对印迹进行成像。
1.4.4   碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白和钙结节检测   转染后24 h，使用成骨培养基(含10 nmol/L地塞米松，15 mmol/L维生素C，10 mmol/L β-磷酸甘油，体积分数15%胎牛血清的L-DMEM)诱导骨髓间充质干细胞成骨分化。成骨诱导7 d，应用ELISA试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶水平，用酶标仪检测520 nm波长处吸光度值。成骨诱导14 d，将细胞固定、透化、封闭，滴加小鼠抗兔Ⅰ型胶原抗体，4 ℃孵育过夜，滴加二抗孵育1 h，然后着色、染色、脱水、透明、封固，显微镜下观察Ⅰ型胶原的表达。成骨诱导21 d，进行茜素红S染色并在显微镜下观察钙结节生长情况。
1.5   主要观察指标   ①腺病毒转染后兔骨髓间充质干细胞状态；②转染后48 h骨形态发生蛋白2 mRNA、骨形态发生蛋白2蛋白及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达；③成骨诱导后各组骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原蛋白表达、碱性磷酸酶活性及钙结节形成情况。
1.6   统计学分析   数据采用SPSS 11.0统计软件分析，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。

骨组织修复、融合的必要条件是具有多功能分化的骨前体细胞和足量的成骨诱导因子系统性参与和协调，最终在局部形成新骨[5]。传统包括自体、异体骨移植的治疗方案由于受限于替代材料来源问题导致临床中存在一定程度的缺陷和风险。近年来，干细胞研究为骨组织工程提供了新的思路。

骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等功能细胞多向分化潜能[7]。目前体外实验已证实多种细胞因子可以诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞[8]。研究表明，骨形态发生蛋白是诱导干细胞向成骨细胞分化的主要调节因子，其中骨形态发生蛋白2可增强细胞中碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素的表达，是目前应用最广泛的细胞生长因子[9]。已有临床研究证实骨形态发生蛋白可在骨折2周后诱导骨折区完成纤维连接[10]。然而， 骨形态发生蛋白在体内相对不稳定，需要与载体结合才能控制性递送[11]。目前主流的缓释载体包括无机盐材料、金属材料、天然聚合物、有机高分子聚合物材料等[12]。将骨形态发生蛋白装载于缓释载体或支架上以长期诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化进而重建巨大骨缺损是一个不错的选择。向盈盈等[13]利用纤维蛋白胶复合骨形态发生蛋白2实现了缓慢释放骨形态发生蛋白2，用于修复兔桡骨缺损。但是，天然骨形态发生蛋白诱导骨髓间充质干细胞成骨分化呈剂量依赖性。ROOSTAEIAN  等[14]运用人骨形态发生蛋白2诱导兔骨髓间充质干细胞成骨，发现人骨形态发生蛋白2最佳质量浓度为50 μg/L，但骨形态发生蛋白2植入体内后易被组织液稀释或降解，导致供区局部有效浓度不足，发挥有效作用的时间较短[14]。目前临床还难以实现天然骨形态发生蛋白2的可控释放，大量骨形态发生蛋白爆炸性释放可能导致局部组织炎症反应、组织变性坏死等可能[4]。

通过基因转染技术可规避重组细胞因子在目标区域的爆发性释放[5]。该研究通过重组腺病毒载体将骨形态发生蛋白2和增强型绿色荧光蛋白基因导入兔骨髓间充质干细胞内，从而使骨髓间充质干细胞内表达骨形态发生蛋白2蛋白，增加碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白及钙结节形成量，加速骨形成。张斌斌[15]将重组骨形态发生蛋白2导入比特犬骨髓间充质干细胞，并注入骨缝牵引区，固定4周后发现骨缝宽度变窄、骨小梁增厚，新生骨小梁沿牵引力方向排列，能够加速骨形成。但是，也有研究发现腺病毒介导的骨髓间充质干细胞导致了移植区域的炎症反应[16]。因此，腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染兔骨髓间充质干细胞的作用还需进一步研究。

骨形成是骨细胞和细胞外基质之间相互作用、相互诱导分化的过程，其细胞分化与增殖是一个复杂而又协调统一的过程[17]。骨形态发生蛋白可激活Smad蛋白依赖性骨形态发生蛋白信号通路，引起下游相关基因Runx2、Osterix、Msx等转录[18-19] ，也可以上调碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、OCN、OPN和BSP等成骨特异性蛋白表达。通过细胞外蛋白激活Wnt/β-catenin信号通路，上调β-catenin 蛋白水平调节成骨过程。当细胞外蛋白缺乏时，Axin、APC、CK1和GSK3β形成的降解复合物降解胞浆中β-catenin[20]。研究证实骨形态发生蛋白2通过上调β-catenin和cyclin D1水平并抑制GSK3β蛋白表达从而激活Wnt信号通路，促进细胞向成骨细胞前体分化[21]。Chen等[22]也发现激活后的骨形态发生蛋白2信号通路可促进Wnt/β-catenin信号通路中的细胞配体蛋白和受体的表达，正反馈增强Wnt/β-catenin信号通路活性。该研究中，Ad-BMP-2/EGFP使兔骨髓间充质干细胞中β-catenin、cyclin D1、Runx2和c-myc蛋白表达水平显著增加，而GSK3β和p-GSK3β蛋白表达水平下降，说明转染后的人骨形态发生蛋白2激活了经典Wnt信号通路。

既往发现骨形态发生蛋白2能上调Runx2 mRNA表达量并呈剂量依赖性，但对Runx2 基因的启动子却没有影响。该实验发现，转染后骨髓间充质干细胞上调Runx2蛋白表达量，说明骨形态发生蛋白2诱导成骨过程中不仅只依靠骨形态发生蛋白2信号通路相关因子的调节，可能还有其他转录因子的参与[23]。经典的Wnt信号通路是骨形态发生蛋白2信号通路的上游调节通路[24]，Wnt信号通路和骨形态发生蛋白2信号通路以“串话”机制调控细胞分化过程[25]。ZHANG等[26]认为外源性骨形态发生蛋白2激活骨形态发生蛋白2信号通路后，上调经典Wnt信号通路中非磷酸化的β-catenin并在细胞核内积累，同时GSK3β也可以磷酸化Runx2残基，Wnt信号通路亦可以增加骨形态发生蛋白系列蛋白表达。ITASAKI等[27]认为骨形态发生蛋白2参与了不同阶段、不同分子途径的Wnt信号通路，在此过程中与Wnt/β-catenin通路互相影响并参与调节部分Wnt信号通路中的分子水平。结合实验结果，作者发现转染后骨形态发生蛋白2蛋白表达上调导致了Wnt信号通路中β-catenin蛋白集聚，可能通过刺激并启动Wnt信号通路上调下游蛋白Runx2的表达，GSK3β和p-GSK3β蛋白的低表达刚好佐证了这一路径。

综上，骨形态发生蛋白2基因通过腺病毒介导转染骨髓间充质干细胞后可能通过上调骨形态发生蛋白2表达量，激活Wnt信号通路进而促进兔骨髓间充质干细胞的成骨分化。此方法有望构建符合要求的组织工程骨，但如何安全构建并实现临床转化需要进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
Wnt/β-catenin信号通路：是多因子组成的经典通路，Wnt基因编码的Wnt蛋白与卷曲蛋白受体(Frz)结合，将信号传导至胞内，活化后的胞质内蓬乱蛋白(Dsh)抑制由Axin、APC和GSK3β组成的复合物(APC-Axin-GSK3β)的活性，磷酸化的β-catenin在胞质内水平增加并与转录因子核内淋巴增强因子/T细胞转录因子(LEF/TCF)结合，激活T细胞转录因子转录活性，调控下游基因转录。
骨形态发生蛋白/Smad信号通路：该信号通路在骨骼发育和修复过程中至关重要，骨形态发生蛋白首先和它的Ⅱ型受体相结合，然后与Ⅰ型受体结合并使之磷酸化，激活的磷酸化受体又激活下游的R-Smads，激活态的R-Smads与Co-Smads相结合，进而移动到细胞核内，启动了Runx2等靶基因的转录，最终达到促进成骨细胞增殖和分化的效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

临床上目前应用最广泛、最重要的诱导成骨方法仍然是自体骨移植、异体骨移植及天然骨形态发生蛋白2直接作用于靶区。组织工程骨在临床应用中尚存在诸多问题待解决。例如，组织工程骨支架材料复合体(rhBMP2-BMSCs)的生物力学、骨髓间充质干细胞存活、分化及生物相容性，体内能否进一步分化为成骨细胞，诱导成骨修复效率能否达到临床要求，仍需要进一步动物模型进行评估。临床上目前应用最广泛、最重要的诱导成骨方法仍然是自体骨移植、异体骨移植及天然骨形态发生蛋白2直接作用于靶区。组织工程骨在临床应用中尚存在诸多问题待解决。例如，组织工程骨支架材料复合体(rhBMP2-BMSCs)的生物力学、骨髓间充质干细胞存活、分化及生物相容性，体内能否进一步分化为成骨细胞，诱导成骨修复效率能否达到临床要求，仍需要进一步动物模型进行评估。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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