MiR-204-5p减轻大鼠坐骨神经慢性缩窄损伤引起神经病理性疼痛的作用机制

doi:10.12307/2022.839

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (29): 4680-4686.doi: 10.12307/2022.839

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MiR-204-5p减轻大鼠坐骨神经慢性缩窄损伤引起神经病理性疼痛的作用机制

毛轲1，高誉华1，周松林1，赵彦芬1，张原源1，杜思龙1，李喜龙2

1河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)麻醉科，河南省郑州市 450002；2河南省肿瘤医院(郑州大学附属肿瘤医院)麻醉与围术期医学科，河南省郑州市 450002

收稿日期:2021-08-05 接受日期:2021-11-11 出版日期:2022-10-18 发布日期:2022-03-27
通讯作者: 毛轲，主治医师，河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)麻醉科，河南省郑州市 450002
作者简介:毛轲，男，1987年生，河南省原阳县人，汉族，2011年新乡医学院毕业，主治医师，主要从事麻醉与疼痛研究。
基金资助:
河南省医学科技攻关计划项目(LHGJ20200184)，项目负责人：李喜龙

MiR-204-5p alleviates neuropathic pain in rats with chronic constriction injury

Mao Ke1, Gao Yuhua1, Zhou Songlin1, Zhao Yanfen1, Zhang Yuanyuan1, Du Silong1, Li Xilong2

1Department of Anesthesiology, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine (the Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinses Medicine), Zhengzhou 450002, Henan Province, China; 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Henan Provincial Tumor Hospital (Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University), Zhengzhou 450002, Henan Province, China

Received:2021-08-05 Accepted:2021-11-11 Online:2022-10-18 Published:2022-03-27
Contact: Mao Ke, Department of Anesthesiology, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine (the Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinses Medicine), Zhengzhou 450002, Henan Province, China
About author:Mao Ke, Attending physician, Department of Anesthesiology, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine (the Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinses Medicine), Zhengzhou 450002, Henan Province, China
Supported by:
Henan Provincial Medical Science and Technology Research Project, No. LHGJ20200184 (to LXL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
miRNA：是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。一个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。众多研究表明，miRNAs作为神经系统中基因表达和神经网络构建的关键调节器，在神经病理性疼痛的产生和调节中起着重要的作用。
神经病理性疼痛：国际疼痛研究协会将神经病理性疼痛定义为由神经系统原发性损害和功能障碍所激发或引起的疼痛。它属于一种慢性疼痛，疼痛表现为自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛和感觉异常等临床特征。神经病理性疼痛可由多种因素诱发，如药物毒性、手术和创伤等。虽然研究人员对神经病理性疼痛的预后和治疗进行了大量研究与报道，但对神经病理性疼痛的作用机制仍不够清楚。

背景：miR-204-5p是神经病理性疼痛的潜在生物标志物，但其在神经病理性疼痛中的作用及作用机制尚未阐明。
目的：探讨miR-204-5p对大鼠坐骨神经慢性缩窄性损伤引起的神经病理性疼痛的作用及其分子机制。
方法：①将90只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、空载体组、miR-204-5p过表达组、杂乱干扰组和AURKB干扰组，每组15只。采用坐骨神经慢性缩窄性损伤方法建立大鼠神经性疼痛动物模型，建模后分别注射以下重组慢病毒(空载体、miR-204-5p过表达载体、杂乱干扰载体、AURKB短发夹RNA)，注射量为1 μg。术前及术后第7，14天，采用RT-qPCR检测大鼠背根神经节中miR-204-5p和AURKB mRNA的表达水平；术前及术后第3，7，14，21天，通过缩足反应阈值和缩足潜伏期评估机械异位痛和热痛觉过敏；术后第7天，采用酶联免疫吸附法分析大鼠背根神经节中炎性细胞因子水平。②采用100 nmol/L脂多糖诱导大鼠小胶质细胞HAPI产生炎症反应，细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+NC mimic组、脂多糖+miR-204-5p mimic组、脂多糖+miR-204-5p mimic+空载体组、脂多糖+miR-204-5p mimic+AURKB过表达组。采用酶联免疫吸附法分析大鼠小胶质细胞HAPI中炎性细胞因子水平；Western blot法检测大鼠小胶质细胞HAPI中AURKB及Wnt/β-catenin通路标志蛋白的表达水平；双荧光素酶报告基因法验证miR-204-5p与AURKB的靶定关系。
结果与结论：①与假手术组比较，坐骨神经慢性缩窄性损伤大鼠背根神经节中miR-204-5p表达显著降低；②与模型组比较，过表达miR-204-5p可显著提高缩足反应阈值和缩足潜伏期；③在坐骨神经慢性缩窄性损伤大鼠和脂多糖激活的HAPI细胞中，过表达miR-204-5p可以抑制炎性细胞因子的分泌；④双荧光素酶报告基因证实了AURKB是miR-204-5p的下游靶基因；⑤在坐骨神经慢性缩窄性损伤大鼠背根神经节中，AURKB mRNA表达显著升高，沉默AURKB可抑制神经病理性疼痛和神经炎症；⑥在脂多糖激活的HAPI细胞中，miR-204-5p过表达通过抑制AURKB表达降低Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达水平，减轻神经炎症反应；⑦以上研究结果表明，miR-204-5p通过AURKB/Wnt/β-catenin通路缓解坐骨神经慢性缩窄性损伤大鼠神经病理性疼痛。

https://orcid.org/0000-0003-0979-900X (毛轲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: miR-204-5p, 神经性疼痛, AURKB, 坐骨神经慢性缩窄性损伤, 大鼠, Wnt通路

Abstract: BACKGROUND: MiR-204-5p is a potential biomarker of neuropathic pain, but its role and mechanism in neuropathic pain have not been clarified.
OBJECTIVE: To investigate the effect and molecular mechanism of miR-204-5p on neuropathic pain caused by chronic constriction injury in rats.
METHODS: (1) A total of 90 male Sprague-Dawley rats were randomized into sham group, model group, empty vector group, miR-204-5p overexpression group, scramble group, and aurora kinase B (AURKB) interference group, with 15 rats in each group. The rat neuropathic pain model was established based on chronic constriction injury of the sciatic nerve. After modeling, rats in each group were injected with the following recombinant lentiviruses (empty vector, miR-204-5p
overexpression vector, scrambled shRNA, AURKB shRNA), and the injection volume was 1 μg. The expression levels of miR-204-5p and AURKB mRNAs in the dorsal root ganglia of rats were measured by RT-qPCR before surgery and on the 7th and 14th days after surgery. Mechanical allodynia and thermal hyperalgesia were assessed by paw withdrawal threshold and paw withdrawal latency before surgery and on the 3rd, 7th, 14th, and 21st days after surgery. The levels of inflammatory cytokines in dorsal root ganglion tissues of rats were determined by ELISA on the 7th day after surgery. (2) 100 nmol/L lipopolysaccharide was used to induce inflammation in rat microglia cell line (HAPI). The cells were divided into control group, lipopolysaccharide group, lipopolysaccharide+NC mimic group, lipopolysaccharide+miR-204-5p mimic group, lipopolysaccharide+miR-204-5p mimic+empty vector group, lipopolysaccharide+miR-204-5p mimic+AURKB overexpression group. The levels of inflammatory cytokines in HAPI cells were detected using enzyme-linked immunosorbent assay. The expression levels of AURKB and Wnt/β-catenin pathway proteins in HAPI cells were detected by western blot assay. The targeting relationship between miR-204-5p and AURKB was verified by dual luciferase reporter gene assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham operation group, the expression of miR-204-5p in the dorsal root ganglion of rats with chronic constriction injury was significantly reduced. Compared with the model group, overexpression of miR-204-5p significantly increased the paw withdrawal threshold value and paw withdrawal latency. In rats with chronic constriction injury of the sciatic nerve and HAPI cells activated by lipopolysaccharide, overexpression of miR-204-5p could inhibit the secretion of inflammatory cytokines. The dual luciferase reporter gene confirmed AURKB as the downstream target gene of miR-204-5p. The expression level of AURKB mRNA was significantly increased in the dorsal root ganglion of rats with chronic constriction injury. Whereas silencing of AURKB could inhibit neuropathic pain and neuroinflammation. In lipopolysaccharide-induced HAPI cells, the overexpression of miR-204-5p reduced the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway proteins by inhibiting the expression of AURKB, thereby reducing neuroinflammation. All the findings indicate that miR-204-5p relieves neuropathic pain in rats with chronic constriction injury of the sciatic nerve through the AURKB/Wnt/β-catenin pathway.

Key words: miR-204-5p, neuropathic pain, AURKB, chronic constriction injury, rat, Wnt pathway

中图分类号:

毛轲, 高誉华, 周松林, 赵彦芬, 张原源, 杜思龙, 李喜龙. MiR-204-5p减轻大鼠坐骨神经慢性缩窄损伤引起神经病理性疼痛的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4680-4686.

Mao Ke, Gao Yuhua, Zhou Songlin, Zhao Yanfen, Zhang Yuanyuan, Du Silong, Li Xilong. MiR-204-5p alleviates neuropathic pain in rats with chronic constriction injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(29): 4680-4686.

图/表（结果） 7

2.1 大鼠背根神经节组织中miR-204-5p的mRNA表达水平术前及术后第7，14天检测大鼠背根神经节组织中miR-204-5p的mRNA表达。与假手术组比较，模型组大鼠的miR-204-5p mRNA表达显著降低(P < 0.05)，见图1。

2.2 过表达miR-204-5p对大鼠神经病理性疼痛的影响术前及术后第3，7，14，21天分别测量缩足反应阈值和缩足潜伏期。与假手术组比较，模型组大鼠缩足反应阈值和缩足潜伏期显著降低(P < 0.05)；与空载体组比较，miR-204-5p过表达组大鼠缩足反应阈值和缩足潜伏期显著升高(P < 0.05)，见图2。

2.3 过表达miR-204-5p对大鼠神经炎症的影响在术后第7天检测大鼠背根神经节组织中炎性细胞因子白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2的分泌水平。酶联免疫吸附实验结果显示：与假手术组比较，模型组白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2水平显著升高(P < 0.05)；与空载体组相比，miR-204-5p过表达组白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2水平显著降低(P < 0.05)，见图3。

2.4 AURKB是miR-204-5p的靶基因采用生物信息学分析工具PITA(https://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html)预测得知miR-204-5p与AURKB 3?UTR结合，见图4A。HEK-293T细胞共转染AURKB-Wt和miR-204-5p mimic后荧光素酶活性显著下调(P < 0.05)，而共转染AURKB-Mut和miR-204-5p mimic后荧光素酶活性无明显变化，见图4B。Western blot结果显示：过表达miR-204-5p抑制AURKB的表达，而抑制miR-204-5p则促进AURKB的表达(P < 0.05)，见图4C，D。

2.5 沉默AURKB对大鼠坐骨神经慢性缩窄性损伤引起的神经性疼痛的影响术前及术后第7，14天检测大鼠背根神经节组织中AURKB mRNA的表达水平。与假手术组比较，模型组大鼠AURKB mRNA的表达显著升高(P < 0.05)，见图5A。通过鞘内注射sh-AURKB研究AURKB在神经性疼痛发展中的作用。术前及术后第3，7，14，21天分别测量缩足反应阈值和缩足潜伏期。与假手术组比较，模型组大鼠缩足反应阈值和缩足潜伏期显著降低(P < 0.05)；与杂乱干扰组比较，AURKB干扰组大鼠缩足反应阈值和缩足潜伏期显著升高(P < 0.05)，见图5B，C。

2.6 沉默AURKB对坐骨神经慢性缩窄性损伤大鼠神经炎症的影响在术后第7天检测大鼠背根神经节组织中炎性细胞因子白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2的分泌水平。酶联免疫吸附实验结果显示：与假手术组比较，模型组白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2水平显著升高(P < 0.05)；与杂乱干扰组比较， AURKB干扰组白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2水平明显降低(P < 0.05)，见图6。

2.7 miR-204-5p通过抑制AURKB的表达阻断Wnt/β-catenin信号通路 Western blot结果显示：与对照组比较，脂多糖组HAPI细胞中AURKB蛋白和Wnt/β-catenin信号通路蛋白(C-myc、cyclin D和β-catenin)的表达水平显著升高(P < 0.05)；与脂多糖+NC mimic组比较，脂多糖+miR-204-5p mimic组HAPI细胞中AURKB蛋白和Wnt/β-catenin信号通路蛋白(C-myc、cyclin D和β-catenin)的表达水平显著降低(P < 0.05)；与脂多糖+miR-204-5p mimic+空载体组对比，AURKB过表达逆转了miR-204-5p mimic的作用，见图7。酶联免疫吸附实验结果显示：与对照组比较，脂多糖组HAPI细胞中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2水平显著升高(P < 0.05)；与脂多糖+NC mimic组比较，脂多糖+miR-204-5p mimic组HAPI细胞中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2水平显著降低(P < 0.05)；与脂多糖+miR-204-5p mimic+空载体组对比， AURKB过表达逆转了miR-204-5p mimic的作用，见图7。

参考文献

[1] 寿雯婷,张世红,陈忠.钠离子通道在神经病理性疼痛中的作用研究进展[J].浙江大学学报(医学版),2011,40(2):217-221.
[2] VAN HECKE O, AUSTIN SK, KHAN RA, et al. Neuropathic pain in the general population: a systematic review of epidemiological studies. Pain. 2014;155(4):654-662.
[3] LEMA MJ, FOLEY KM, HAUSHEER FH. Types and epidemiology of cancer-related neuropathic pain: the intersection of cancer pain and neuropathic pain. Oncologist. 2010;15 Suppl 2:3-8.
[4] JIANGPAN P, QINGSHENG M, ZHIWEN Y, et al. Emerging Role of microRNA in Neuropathic Pain. Curr Drug Metab. 2016;17(4):336-344.
[5] LÓPEZ-GONZÁLEZ MJ, LANDRY M, FAVEREAUX A. MicroRNA and chronic pain: From mechanisms to therapeutic potential. Pharmacol Ther. 2017;180:1-15.
[6] DAYER CF, LUTHI F, LE CARRÉ J, et al. Differences in the miRNA signatures of chronic musculoskeletal pain patients from neuropathic or nociceptive origins. PLoS One. 2019;14(7):e0219311.
[7] 梁冰,董铁立.miR-19a对慢性压迫性损伤大鼠神经病理性疼痛的影响及其机制[J].第三军医大学学报,2018,40(7):590-595.
[8] ZHANG X, CHEN Q, SHEN J, et al. miR-194 relieve neuropathic pain and prevent neuroinflammation via targeting FOXA1. J Cell Biochem. 2020;121(5-6):3278-3285.
[9] SHEN WS, LI CF, ZHOU ZS, et al. MicroRNA-204 silencing relieves pain of cervical spondylotic radiculopathy by targeting GDNF. Gene Ther. 2020;27(6):254-265.
[10] WANG Y, YE F, HUANG C, et al. Bioinformatic Analysis of Potential Biomarkers for Spinal Cord-injured Patients with Intractable Neuropathic Pain. Clin J Pain. 2018;34(9):825-830.
[11] MOURA DS, CAMPILLO-MARCOS I, VÁZQUEZ-CEDEIRA M, et al. VRK1 and AURKB form a complex that cross inhibit their kinase activity and the phosphorylation of histone H3 in the progression of mitosis. Cell Mol Life Sci. 2018;75(14):2591-2611.
[12] SHEN Y, DING Z, MA S, et al. Targeting aurora kinase B alleviates spinal microgliosis and neuropathic pain in a rat model of peripheral nerve injury. J Neurochem. 2020;152(1):72-91.
[13] 文苾蕊, 张志玲, 陈乃宏. Wnt信号通路在神经病理性疼痛中的作用及机制研究进展[J].药学学报,2020,55(2):35-41.
[14] HU C, ZHAO YT, CUI YB, et al. Wnt/beta-Catenin Signaling Contributes to Vincristine-Induced Neuropathic Pain. Physiol Res. 2020;69(4):701-710.
[15] SHEU ML, CHIANG CY, SU HL, et al. Intrathecal Injection of Dual Zipper Kinase shRNA Alleviating the Neuropathic Pain in a Chronic Constrictive Nerve Injury Model. Int J Mol Sci. 2018;19(8):2421.
[16] GUO D, HU X, ZHANG H, et al. Orientin and neuropathic pain in rats with spinal nerve ligation. Int Immunopharmacol. 2018;58:72-79.
[17] BOUHASSIRA D. Neuropathic pain: Definition, assessment and epidemiology. Rev Neurol (Paris). 2019;175(1-2):16-25.
[18] GRACE PM, STRAND KA, GALER EL, et al. Morphine paradoxically prolongs neuropathic pain in rats by amplifying spinal NLRP3 inflammasome activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(24): E3441-3450.
[19] NISHIHARA T, TANAKA J, SEKIYA K, et al. Chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats causes different activation modes of microglia between the anterior and posterior horns of the spinal cord. Neurochem Int. 2020;134:104672.
[20] PFYFFER D, WYSS PO, HUBER E, et al. Metabolites of neuroinflammation relate to neuropathic pain after spinal cord injury. Neurology. 2020;95(7):e805-e814.
[21] LIANG YH, CHEN GW, LI XS, et al. Guanosine-5’-triphosphate cyclohydrolase 1 regulated long noncoding RNAs are potential targets for microglial activation in neuropathic pain. Neural Regen Res. 2021; 16(3):596-600.
[22] WU J, WANG C, DING H. LncRNA MALAT1 promotes neuropathic pain progression through the miR‑154‑5p/AQP9 axis in CCI rat models. Mol Med Rep. 2020;21(1):291-303.
[23] ZHANG X, ZHANG Y, CAI W, et al. MicroRNA-128-3p Alleviates Neuropathic Pain Through Targeting ZEB1. Neurosci Lett. 2020;729:134946.
[24] TIAN J, SONG T, WANG W, et al. miR-129-5p Alleviates Neuropathic Pain Through Regulating HMGB1 Expression in CCI Rat Models. J Mol Neurosci. 2020;70(1):84-93.
[25] 夏志强. miRNA-204-5p靶向RAB22A调控胶质瘤增殖、迁移与侵袭的机制分析[D].北京:北京协和医学院,2016.
[26] GAO J, WANG Y, ZHAO X, et al. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015;56(3):1493-1504.
[27] LI H, WANG J, LIU X, et al. MicroRNA-204-5p suppresses IL6-mediated inflammatory response and chemokine generation in HK-2 renal tubular epithelial cells by targeting IL6R. Biochem Cell Biol. 2019;7(2): 109-117.
[28] Nie M, Wang Y, Yu Z, et al. AURKB promotes gastric cancer progression via activation of CCND1 expression. Aging (Albany NY). 2020;12(2): 1304-1321.
[29] HUANG D, HUANG Y, HUANG Z, et al. Relation of AURKB over-expression to low survival rate in BCRA and reversine-modulated aurora B kinase in breast cancer cell lines. Cancer Cell Int. 2019;19:166.
[30] LEE JY, CHOI HY, JU BG, et al. Estrogen alleviates neuropathic pain induced after spinal cord injury by inhibiting microglia and astrocyte activation. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2018;1864(7): 2472-2480.
[31] TSUDA M. Microglia-Mediated Regulation of Neuropathic Pain: Molecular and Cellular Mechanisms. Biol Pharm Bull. 2019;42(12): 1959-1968.
[32] TOZAKI-SAITOH H, TSUDA M. Microglia-neuron interactions in the models of neuropathic pain. Biochem Pharmacol. 2019;169:113614.
[33] 王菲菲, 韩光, 杜英杰,等.Wnt/β-catenin信号通路在高压氧治疗大鼠神经病理性痛中的作用[J].临床麻醉学杂志,2016,32(2):171-174.
[34] ITOKAZU T, HAYANO Y, TAKAHASHI R, et al. Involvement of Wnt/beta-catenin signaling in the development of neuropathic pain. Neurosci Res. 2014;79:34-40.
[35] FAN X, BIAN W, LIU M, et al. MiR-216b-5p attenuates chronic constriction injury-induced neuropathic pain in female rats by targeting MAL2 and inactivating Wnt/β-catenin signaling pathway. Neurochem Int. 2020;28:104930.
[36] LUO Y, BARRIOS-RODILES M, GUPTA GD, et al. Atypical function of a centrosomal module in WNT signalling drives contextual cancer cell motility. Nat Commun. 2019;10(1):2356.
[37] LEE KB, JIN H, YE S, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 inhibits gastric cancer cell proliferation by inactivating Wnt signaling pathway via c-Myc with aurora kinases. Oncotarget. 2016; 7(45):73473-73485.
[38] SUBRAMANIYAN B, KUMAR V, MATHAN G. Effect of sodium salt of Butrin, a novel compound isolated from Butea monosperma flowers on suppressing the expression of SIRT1 and Aurora B kinase-mediated apoptosis in colorectal cancer cells. Biomed Pharmacother. 2017;90:402-413.

引言

神经病理性疼痛是由于躯体感觉系统损伤而引起的慢性疼痛[1]。它占全世界总人口患病率的6.9%-10%[2]。神经病理性疼痛可由多种因素诱发，如药物毒性、手术和创伤等[3]。神经病理性疼痛的预后和治疗已有大量研究与报道，但其发病机制仍不清楚。因此，探索治疗神经病理性疼痛的分子机制具有重要意义。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类小分子非编码RNA，通过阻碍mRNA翻译或使其降解介导基因表达。众多研究表明，miRNAs作为神经系统中基因表达和神经网络构建的关键调节器，在神经病理性疼痛的产生和调节中起着重要的作用[4-6]。例如，miR-19a通过调节SOCS3介导的JAK2/STAT3通路减轻坐骨神经慢性缩窄性损伤(chronic constriction injury，CCI)造成的神经病理性疼痛[7]。MiR-194通过靶向FOXA1缓解神经病理性疼痛和预防神经炎症[8]。据报道，脊髓压迫模型大鼠脊髓组织中miR-204表达上调，沉默miR-204可通过提高神经胶质细胞系衍生的神经营养因子表达水平缓解大鼠神经性疼痛[9]。现有研究表明，miR-204-5p是预测脊髓损伤后神经病理性疼痛的潜在生物标志物[10]，但是它在神经病理性疼痛中的作用机制尚未阐明。Aurora激酶B(aurora kinase B，AURKB)作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员，在染色体分离和细胞分裂等多个方面发挥重要的调节作用[11]。AURKB 基因和蛋白表达随着脊髓小胶质细胞增生和大鼠神经性疼痛的发展而上调，且敲低AURKB可减少小胶质细胞增生并减轻坐骨神经慢性缩窄性损伤引起的大鼠神经性疼痛[12]。此外，Wnt通路已被证实参与神经病理性疼痛的发生和维持，而且与中枢敏化、炎症因子的分泌等密切相关[13-14]。

该研究经过生物信息学分析发现AURKB是miR-204-5p的下游靶基因，过表达miR-204-5p能够显著抑制AURKB的表达。在体内建立坐骨神经慢性缩窄性损伤大鼠模型，通过鞘内注射慢病毒介导的miR-204-5p过表达载体或AURKB短发夹RNA(shRNA)，以及在体外采用脂多糖激活大鼠小胶质细胞系HAPI，通过转染miR-204-5p模拟物(mimics)和AURKB过表达载体，探讨miR-204-5p靶定AURKB对大鼠神经病理性疼痛及神经炎症的影响，以期为神经病理性疼痛的治疗及药物开发提供新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计动物体内实验和细胞学体外实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年5月在河南中医药大学医学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠90只，体质量180-220 g，由河南中医药大学动物实验中心提供。所有大鼠均在25 ℃恒温和湿度40%-60%的环境下饲养，动物生产许可证号：SYXK(豫)2016-0009。该研究的所有实验程序均严格按照河南中医药大学《实验动物护理与使用指南》的要求进行。实验方案经河南中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号为：HNUCM-2020053。
1.3.2 实验试剂及仪器 Trizol(美国Invitrogen公司)；脂多糖(美国Sigma公司)；Prime Script RT Master Mix试剂盒以及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(日本Takara 公司)；ELISA试剂盒(美国R&D Systems公司)；AURKB、C-myc、cyclin D和β-catenin抗体(Abcam公司)；pmirGLO载体(美国Promega公司)；Von Frey纤维丝(美国IITC公司)；慢病毒介导的空载体、miR-204-5p过表达载体、杂乱干扰载体和AURKB短发夹RNA由生工生物工程(上海)股份有限公司构建；蛋白提取试剂盒(北京索莱宝公司)；双荧光素酶报告基因检测系统(美国Promega公司)。
1.3.3 细胞大鼠小胶质细胞系HAPI购自Otwo生物技术公司，HEK-293T细胞购自美国保藏中心ATCC。HAPI和HEK-293T细胞均用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的饱和湿度培养箱中。
1.4 实验方法
1.4.1 建立神经性疼痛动物模型随机将90只大鼠分为假手术组(n=15)、模型组(坐骨神经慢性缩窄性损伤，n=15)、空载体组(坐骨神经慢性缩窄性损伤后鞘内注射1 μg空载体，n=15)、miR-204-5p过表达组(坐骨神经慢性缩窄性损伤后鞘内注射1 μg慢病毒介导的miR-204-5p过表达载体，n=15)、杂乱干扰组(坐骨神经慢性缩窄性损伤后鞘内注射1 μg杂乱干扰载体，n=15)和AURKB干扰组(坐骨神经慢性缩窄性损伤后鞘内注射1 μg慢病毒介导的AURKB短发夹RNA，n=15)。
采用坐骨神经慢性缩窄性损伤方法建立大鼠神经性疼痛动物模型[15]。首先使用40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，将大鼠左股骨后内侧坐骨神经外露并与周围组织分离，使用4-0的铬肠线结扎4次，间隔1 mm，术后切口逐层缝合。假手术组大鼠暴露坐骨神经并分离，不结扎。通过缩足反应阈值和缩足潜伏期判定模型是否建立成功，建模成功标准为缩足反应阈值和缩足潜伏期均降低。共90只SD大鼠进行实验，其中模型组有2只和空载体组有1只大鼠手术过程中死亡，系实验人员操作失误，余无特殊，针对这3只大鼠已进行后续实验补充。动物模型的成模率为97.15%。在坐骨神经慢性缩窄性损伤手术当天和术后第3，7，14，21天，分离并收集大鼠背根神经节组织用于后续实验。
1.4.2 鞘内注射大鼠麻醉后，使大鼠保持俯卧位，将PE-10聚乙烯导管插入L4-L6之间的脊髓蛛网膜下腔，通过注射20 μL 2%利多卡因使大鼠双侧后肢麻痹，进行鞘内植入，坐骨神经慢性缩窄性损伤手术前72 h，以下重组慢病毒(空载体、miR-204-5p过表达载体、杂乱干扰载体以及AURKB短发夹RNA)通过与鞘内导管相连的微注射器注射到大鼠体内，注射量为1 μg。
1.4.3 疼痛阈值评估各组大鼠在手术当天及术后第3，7，14，21天分别进行机械性痛敏测定。神经性疼痛的机械性异位痛和热痛觉过敏分别通过缩足反应阈值和缩足潜伏期进行评估[12，16]。
(1)机械刺激大鼠双侧足底获得缩足反应阈值：将大鼠置于底部为金属网的有机玻璃盒中，使用Von Frey纤维丝对大鼠的双侧足底进行压力强度逐渐增加的刺激，每次持续时间为3 s，每次间隔15 s，连续刺激10次，记录大鼠缩足、抬足或舔足等行为。
(2)热辐射刺激大鼠双侧足底观察缩足潜伏期：采用一定强度的热辐射(光束直径为 0.5 cm和强度为20 IR)对大鼠足底进行照射，观察大鼠出现缩足、抬足或舔足等行为，立即停止照射，记录反应时间，每次照射时间间隔5 min，连续测量5次，排除极值后计算平均值。
1.4.4 细胞处理及分组 HAPI大鼠小胶质细胞系购自美国ATCC细胞库，将细胞以5×108 L-1的细胞浓度接种于12孔细胞培养板中，孔内为含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基，将细胞培养板放入37 ℃、体积分数为5% CO2细胞培养箱。①对照组细胞加入等体积无菌磷酸盐缓冲液；②NC mimic组细胞转染50 nmol/L NC mimic后在无血清培养基中培养6 h，后转入完全培养基中孵育24 h；③miR-204-5p mimic组细胞转染50 nmol/L miR-204-5p mimic；④NC inhibitor组细胞转染100 nmol/L NC inhibitor；⑤miR-204-5p inhibitor组细胞转染100 nmol/L miR-204-5p inhibitor；⑥脂多糖组细胞使用100 nmol/L脂多糖孵育12 h诱导细胞产生炎症反应；⑦脂多糖+NC mimic组细胞转染50 nmol/L NC mimic后与100 nmol/L脂多糖孵育12 h；⑧脂多糖+miR-204-5p mimic组细胞转染50 nmol/L miR-204-5p mimic后与100 nmol/L脂多糖孵育12 h；⑨脂多糖+miR-204-5p mimic+空载体组细胞转染50 nmol/L miR-204-5p mimic和20 ng/L空载体后再与100 nmol/L
脂多糖孵育12 h；⑩脂多糖+miR-204-5p mimic+AURKB过表达组细胞转染50 nmol/L miR-204-5p mimic和20 ng/L pcDNA3.1-AURKB载体后再与100 nmol/L脂多糖孵育12 h。
1.4.5 酶联免疫吸附实验术后7 d，从各组随机挑选3只大鼠麻醉后处死，收集大鼠背根神经节组织进行酶联免疫吸附实验。按照酶联免疫吸附试剂盒说明书检测各组大鼠背根神经节组织及各组HAPI细胞中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2等炎性细胞因子水平。
1.4.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验术前及术后第7，14 天，分别从各组随机挑选3只大鼠麻醉后处死，收集大鼠L4-L6脊柱双侧背根神经节组织进行RT-qPCR实验。采用Trizol试剂提取总RNA，Prime Script RT Master Mix反转录合成cDNA，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ进行qPCR。RT-qPCR引物序列如下：GAPDH上游5'‐GAC TCA TGA CCA CAG TCC ATG C‐3'，下游5'‐AGA GGC AGG GAT GAT GTT CTG‐3'；U6上游5′‐CTC GCT TCG GCA GCA CA‐3'，下游5'‐AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT‐3'；AURKB上游5'AGT GCT CTG CTA TGA ACT GAT G-3'，下游5'-ACC TTG ACA ATC CGA CGA TAT G-3'；miR-204-5p上游5'-CGA AGT TCC CTT TGT CAT CCT-3'，下游5'-GTG CAG GGT CCG AGG TAT TC-3'；U6和GAPDH作为内参。通过2-ΔΔCt法计算基因的相对表达水平。
1.4.7 免疫印迹实验(Western blot) 采用索莱宝蛋白提取试剂盒从各组HAPI细胞中提取总蛋白，采用10%SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，并转移至聚偏氟乙烯膜上，使用5%脱脂牛奶将上述聚偏氟乙烯膜封闭1 h，防止非特异性结合，室温下与AURKB(1∶1 000)，C-myc(1∶1 000)，cyclin D(1∶1 000)和β-catenin(1∶1 000)一抗室温孵育1 h后，4 ℃孵育过夜，第2天使用Tris缓冲生理盐水冲洗后，与山羊抗兔二抗(1∶1 000)在室温下孵育1 h。通过化学发光检测系统检测膜上的靶蛋白，使用Image-Pro Plus 6.0软件分析目标条带的灰度值。
1.4.8 生物信息学分析及双荧光素酶报告基因实验采用生物信息学分析工具PITA(https://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html)预测miR-204-5p的靶基因。设计合成含有AURKB 3ʹUTR野生型(AURKB-Wt)或突变型(AURKB-Mut)片段的pmirGLO双荧光素酶报告基因质粒。将上述质粒与miR-204-5p mimic或NC mimic共转染至HEK-293T细胞中，48 h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。
1.5 主要观察指标 ①RT-qPCR检测大鼠背根神经节中miR-204-5p和AURKB mRNA的表达水平；②ELISA分析大鼠背根神经节和大鼠小胶质细胞HAPI中炎性细胞因子白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2水平；③Western blot法检测AURKB及Wnt/β-catenin通路标志蛋白(C-myc、cyclin D和β-catenin)的表达水平；④双荧光素酶报告基因法验证miR-204-5p与AURKB的靶定关系。
1.6 统计学分析所有数据以x±s表示，采用SPSS 22.0软件进行分析。两组数据之间的比较使用t检验法，而多组数据间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过河南中医药大学第二临床医学院生物统计学专家审核。

讨论

脊髓损伤引起的慢性神经病理性疼痛通常会对患者的生活质量造成持续的、严重的不良影响，因此寻找有效的神经病理性疼痛治疗靶点迫在眉睫[17]。坐骨神经慢性缩窄损伤可引起神经损伤，导致小胶质细胞激活，活化的小胶质细胞通过释放脑源性神经营养因子和促炎症因子(白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α)参与神经性疼痛的发生和维持[18]。然而，坐骨神经慢性缩窄损伤不仅会损伤感觉神经，还会损伤运动神经元，这说明还应评估与前脊柱相关的病理反应。许多研究使用面部和舌下神经横断模型研究小胶质细胞的反应，其中有研究显示在一个引起截瘫的缺血性脊髓损伤模型中，前脊柱小胶质细胞可参与突触剥离[19]。神经损伤后，神经胶质和促炎递质的产生可调节疼痛敏感性，持续的神经胶质和免疫细胞激活以及与神经元的相互作用导致外周和中枢敏化的发展，进而诱发神经病理性疼痛[20-21]。这些研究表明小胶质细胞激活和坐骨神经慢性缩窄损伤引起的神经病理性疼痛密切相关。

近年来，大量研究表明miRNAs通过靶向下游mRNAs在神经性疼痛中发挥作用[22-24]，其中miR-204-5p引起人们的广泛关注，其在癌症、糖尿病角膜病变和神经炎症等疾病中发挥重要作用。如miR-204-5p通过下调TRPM7的表达诱导炎症损伤和氧化应激，以及靶向RAB22A调控胶质瘤增殖和侵袭[25]；在糖尿病角膜病变发展过程中，miR-204-5p通过调节SIRT1的表达延迟上皮细胞周期[26]。研究显示miR-204-5p是炎症反应的抑制因子，miR-204-5p可通过调节白细胞介素6/白细胞介素6受体轴抑制肾小管上皮细胞炎症和趋化因子的产生[27]，而炎性细胞因子调控的神经炎症与神经病理性疼痛的进展有关。研究显示miR-204参与脊髓压迫引起的大鼠神经性疼痛[9]。miR-204-5p在神经病理性疼痛中的作用及潜在分子机制仍不清楚。该研究发现miR-204-5p在坐骨神经慢性缩窄损伤大鼠背根神经节组织中表达下调，miR-204-5p过表达可改善坐骨神经慢性缩窄性损伤大鼠的机械异位痛和热痛觉过敏，抑制神经炎症。此外，经生物信息学分析发现AURKB是miR-204-5p的下游靶基因，过表达miR-204-5p能够显著抑制AURKB的表达。

AURKB是治疗肿瘤的重要靶标，可通过抑制AURKB的表达抑制肿瘤细胞增殖[28-29]。近期研究表明AURKB参与脊髓小胶质细胞增生和外周神经损伤后继发性神经病理性疼痛[12]。小胶质细胞增生是中枢神经系统对创伤或炎症和缺血性疾病引起的外周或中枢神经损伤的一种典型反应。外周神经损伤可诱发脊髓小胶质细胞增生，包括小胶质细胞的激活和增殖。激活后，小胶质细胞释放大量递质和炎症因子，使脊髓神经元敏感，有助于诱导和维持外周神经损伤后的神经性疼痛[30-32]。以上研究表明，AURKB可作为治疗神经性疼痛的潜在靶点。该研究发现，术后第7，14天AURKB mRNA的表达在坐骨神经慢性缩窄性损伤大鼠模型背根神经节组织中持续上调，沉默AURKB可改善模型大鼠的机械异位痛和热痛觉过敏，抑制炎症反应。

既往研究表明激活Wnt/β-catenin信号通路促进炎性细胞因子的释放、突触可塑性以及中枢敏化等参与神经病理性疼痛的发生和发展[33-35]。AURKB可通过调节Wnt/β-catenin信号通路参与多种疾病的发展[36-37]。例如，沉默AURKB抑制β-catenin在细胞核中的表达，并使其下游靶基因C-myc的表达受到抑制，从而阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞的侵袭和迁移[37]。AURKB通过调节β-catenin和cyclin D的表达介导Wnt信号上调促进结肠癌细胞增殖[38]。然而，AURKB是否通过调节Wnt/β-catenin信号通路参与神经病理性疼痛的发展尚无明确报道。该研究发现，脂多糖激活HAPI细胞后，过表达miR-204-5p可抑制AURKB和Wnt/β-catenin信号通路标记蛋白(C-myc、cyclin D和β-catenin)的表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路激活并降低炎性细胞因子白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2的分泌，从而减轻脂多糖诱导的神经炎症，而AURKB过表达可逆转miR-204-5p的作用。

综上所述，miR-204-5p在神经性疼痛的发展过程中起着至关重要的作用。MiR-204-5p通过靶向AURKB阻断Wnt/β-catenin信号通路减轻坐骨神经慢性缩窄性损伤大鼠的神经病理性疼痛，表明miR-204-5p可作为慢性神经病理性疼痛治疗的重要靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

MiR-204-5p减轻大鼠坐骨神经慢性缩窄损伤引起神经病理性疼痛的作用机制

MiR-204-5p alleviates neuropathic pain in rats with chronic constriction injury

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[1]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[2]	税晓平, 李春莹, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病大鼠骨骼肌脑源性神经营养因子、核因子κB及炎症指标的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 669-675.
[3]	范建超, 徐派的, 韩永丽, 文彩玉珠, 张红星, 潘小丽. 电针足三里对功能性消化不良模型大鼠内脏高敏感性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 663-668.
[4]	莫伟彬, 黄天昌, 曾智伟, 燕林博. 葛根总黄酮干预长时耐力运动后再力竭运动大鼠脑组织β-连环蛋白及糖原合成酶激酶3β的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 736-741.
[5]	冯建波, 李陈诚, 刘金月, 王小敏, 彭笳宸. 金黄色葡萄球菌生物膜克氏针置入建立创伤性大鼠骨髓炎模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 700-705.
[6]	丁雪, 贾莹, 刘纯, 杨世榕, 赖灵妍, 杨桦, 丁琪. 慢性氟中毒SD大鼠正畸牙移动的位移及速率变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4687-4692.
[7]	吴菊花, 杨亚南, 翁锡全, 赵芳芳, 徐国琴, 林文弢. 低氧运动干预营养性肥胖模型大鼠骨骼肌能量代谢的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4598-4604.
[8]	赵俊果, 陈新, 蒋若涵, 郭影, 高波. 二甲双胍对先兆子痫模型大鼠认知功能受损的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4651-4657.
[9]	刘珂, 范海霞, 王宏, 程焕芝, 耿海霞. 胶原纤维和基质金属蛋白酶9在大鼠正畸牙根吸收中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4288-4292.
[10]	董丽萍, 罗佳, 李广意, 袁衡. 增龄对大鼠髂总动脉超微结构的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4123-4126.
[11]	覃勤, 夏天, 李月发, 张铃羚, 秦海霞. 枢经热疗对神经病理性疼痛模型大鼠的镇痛作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4199-4204.
[12]	曾裕威, 黄闯, 魏建国, 段东明, 王簕. 利用生物发光成像示踪大鼠颅骨缺损中移植的骨髓间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3968-3973.
[13]	杨钤, 张轶欧, 贾力莉, 谢君, 冯玛莉, 李庭凯. 心肌梗死大鼠模型的建立及疾病进程评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3733-3737.
[14]	何兴鹏, 郑利钦, 李鹏飞, 悦桂阳, 李志鸿, 吴敏辉, 林梓凌. 两种肾虚证型去势模型大鼠骨小梁微观结构及骨代谢的差异[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3768-3772.
[15]	张婉霞, 尼加提·努尔穆罕默德, 买斯吐热木·黒力力, 柳江龙, 刘迪, 买买提吐逊·吐尔地. 关节腔内注射医用臭氧治疗颞下颌关节骨关节炎模型大鼠的合适剂量[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3700-3705.